联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用

1.本发明涉及天然药物领域，特别涉及联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.炎症是一种为了消除有害刺激、清除坏死的细胞、并修复受损的组织而产生的一系列生物防御反应，例如红肿、发热、疼痛以及功能障碍等，这些反应是免疫系统在感染和组织损伤过程中维持正常组织稳态的基本行为。但长期的慢性炎症会诱导机体产生过激的异常反应，甚至会诱发许多疾病如糖尿病、动脉粥样硬化老年痴呆症、癌症等。炎症在分子水平上是一个复杂的过程，炎症期间由巨噬细胞产生促炎因子，包括肿瘤坏死因子(tnf-α)，各种白细胞介素，前列腺素(pg)，一氧化氮(no)和活性氧(ros)等。研究表明哮喘、癌症、关节炎和其他相关的慢性退行性疾病均与这些促炎因子的过量产生有关。为了治愈炎症性疾病，需要调节整个过程中分泌的各种化学介质的产生。
3.目前临床上常使用甾体激素和非甾体类(阿司匹林、双氯芬酸和布洛芬等)治疗炎症，虽然这些药物效果显著，但服用后人体会产生诸多毒副作用，如肝脏、肠道、心血管损伤等。因此，有必要寻找新的抗炎活性物质，为新型抗炎药物的研发提供先导物。而抑制炎症因子的产生是治疗炎症性疾病的重要方式。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用。本发明以lps诱导raw264.7产生no为模型进行抗炎活性评价，式i或式ii所示的化合物能够抑制no的产生，体现抗炎活性。因此表明上述化合物能够用于制备预防、治疗和/或缓解炎症的食品和/或药品。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了联苄类化合物在制备预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应的药物中的应用；
7.所述联苄类化合物包括如下任意项：
8.(i)、如式i所示的化合物；和/或
9.(ii)、如式ii所示的化合物；和/或
10.(iii)、如(i)或(ii)所示化合物的衍生物；和/或
11.(iv)、如(i)或(ii)所示化合物药学上可接受的盐；和/或
12.(v)、如(i)或(ii)所示化合物的前药或药物中间体；
13.14.在本发明的一些具体实施方案中，所述预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应包括抑制促炎因子的产生。
15.在本发明的一些具体实施方案中，所述促炎因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、一氧化氮或活性氧中的一种或多种。
16.在本发明的一些具体实施方案中，所述促炎因子包括一氧化氮。
17.在本发明的一些具体实施方案中，所述炎症反应包括机体发红、肿胀、发热或疼痛中的一种或多种。
18.在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的剂型包括口服制剂；
19.优选的，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂；
20.更优选的，所述胶囊剂包括硬胶囊剂或软胶囊剂；
21.更优选的，所述片剂包括口服片剂或口腔片剂。
22.更优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。
23.在本发明的一些具体实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
24.在本发明的一些具体实施方案中，所述药学上可接受的辅料包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或多种。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述联苄类化合物的制备方法包括如下步骤：
26.步骤1、取金钗石斛干燥茎，粉碎，乙醇水溶液浸提，过滤，浓缩后获得乙醇提取物；
27.步骤2、取步骤1获得的乙醇提取物，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分级萃取，萃取液浓缩获得各级萃取物；
28.步骤3、取步骤2获得的乙酸乙酯萃取物，采用活性追踪，分离纯化制得式i和/或式ii所示的化合物。
29.在本发明的一些具体实施方案中，所述联苄类化合物的制备方法具体包括：
30.s1)金钗石斛干燥茎(13.0kg)粉碎机打碎后，用2倍体积的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成乙醇提取物；
31.s2)将乙醇提取物与水体积比1:1制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，然后将各萃取液浓缩制成萃取物；
32.s3)取乙酸乙酯萃取物，过减压正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(20:1
→
0:1，v/v)混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，得到16个流份，记为fr.1～fr.16；
33.s3)采用活性跟踪的方法，对16个流份进行抗炎活性测试，发现流份fr.8具有较强的抗炎活性，在50μg/ml浓度下，no生成抑制率为64.5
±
2.6％。
34.s5)取fr.8经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(3:7
→
1:0)进行梯度洗脱，得到10个流份，记为fr.8-1～fr.8-10；
35.s6)取fr.8-6经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到3个流份，记为fr.8-6-1～fr.8-6-3；
36.s7)取fr.8-6-1经硅胶柱以石油醚-丙酮(20:1
→
0:1)梯度洗脱得到式i所示化合物2(320.4mg)；
37.s8)取fr.9经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(1:1
→
1:0)进行梯度洗脱，得到11个流份，记为fr.9-1～fr.9-11；
38.s9)取fr.9-8经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到5个流份，记为fr.9-8-1～fr.9-8-5；
39.s10)取fr.9-8-2通过半制备hplc(c18柱，50％甲醇/水作流动相，流速：4ml/min，检测波长270nm)分离得到化合物1(tr＝15.8min，6.2mg)。
40.本发明还提供了预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应的方法，向受试者施用如下任意项：
41.(i)、如式i所示的化合物；和/或
42.(ii)、如式ii所示的化合物；和/或
43.(iii)、如(i)或(ii)所示化合物的衍生物；和/或
44.(iv)、如(i)或(ii)所示化合物药学上可接受的盐；和/或
45.(v)、如(i)或(ii)所示化合物的前药或药物中间体；
[0046][0047]
本发明包括但不限于取得如下有益效果：
[0048]
本发明提供了一种预防及治疗炎症的化合物，具有式i或式ii所示结构，属联苄类化合物。以lps诱导raw264.7产生no为模型进行抗炎活性评价，式i或式ii所示的化合物能够抑制no的产生，体现抗炎活性。因此表明上述化合物能够用于制备预防、治疗和/或缓解炎症的食品和/或药品。
附图说明
[0049]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0050]
图1示式i所示化合物1的高分辨质谱；
[0051]
图2示式ii所示化合物2的高分辨质谱。
具体实施方式
[0052]
本发明公开了联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0053]
药用植物是抗炎活性分子的重要来源。金钗石斛为兰科植物，是传统的名贵药材之一。可作为治疗胃肠道心血管疾病的药物。从金钗石斛中分离出了多种化学成分，如联苯、菲类、芴酮类、倍半萜和生物碱等，这些成分已被发现具有抗肿瘤、抗炎、抗血栓、降血糖和免疫调节等功能。
[0054]
本发明提供了一类具有抗炎活性的联苄类化合物，具有式i或式ii所示结构：
[0055][0056]
本发明提供了上述具有抗炎活性的联苄类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0057]
s1)金钗石斛干燥茎(13.0kg)粉碎机打碎后，用2倍体积的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成乙醇提取物；
[0058]
s2)将乙醇提取物与水体积比1:1制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，然后将各萃取液浓缩制成萃取物；
[0059]
s3)取乙酸乙酯萃取物，过减压正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(20:1
→
0:1，v/v)混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，得到16个流份，记为fr.1～fr.16；
[0060]
s3)采用活性跟踪的方法，对16个流份进行抗炎活性测试，发现流份fr.8具有较强的抗炎活性，在50μg/ml浓度下，no生成抑制率为64.5
±
2.6％。
[0061]
s5)取fr.8经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(3:7
→
1:0)进行梯度洗脱，得到10个流份，记为fr.8-1～fr.8-10；
[0062]
s6)取fr.8-6经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到3个流份，记为fr.8-6-1～fr.8-6-3；
[0063]
s7)取fr.8-6-1经硅胶柱以石油醚-丙酮(20:1
→
0:1)梯度洗脱得到式ii所示化合物2(320.4mg)；
[0064]
s8)取fr.9经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(1:1
→
1:0)进行梯度洗脱，得到11个流份，记为fr.9-1～fr.9-11；
[0065]
s9)取fr.9-8经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到5个流份，记为fr.9-8-1～fr.9-8-5；
[0066]
s10)取fr.9-8-2通过半制备hplc(c18柱，50％甲醇/水作流动相，流速：4ml/min，检测波长270nm)分离得到式i所示化合物1(tr＝15.8min，6.2mg)。
[0067]
本发明以lps诱导raw264.7产生no为模型进行抗炎活性评价，结果表明，式i或式ii所示的化合物可有效抑制no的产生，体现抗炎活性。
[0068]
本发明中，所述raw264.7为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。
[0069]
所述lps为脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。
[0070]
基于此，本发明提供了上述化合物或上述制备方法制备的化合物抑制产生促炎因子的应用。
[0071]
本发明优选的，所述促炎因子包括肿瘤坏死因子(tnf-α)、各种白细胞介素、前列
腺素(pg)、一氧化氮(no)、活性氧(ros)等中的一种或多种。
[0072]
本发明提供了上述化合物或上述制备方法制备的化合物作为no生成抑制剂的应用。
[0073]
本发明提供了上述化合物或上述制备方法制备的化合物在制备预防、治疗或缓解炎症或炎症反应的药物中的应用。
[0074]
本发明优选的，所述炎症反应包括：机体发红、肿胀、发热、疼痛中的一种或多种。
[0075]
本发明提供了一种预防、治疗或缓解炎症或炎症反应的药物，包括式i或式ii所示化合物中的一个或多个，以及药学上可接受的辅剂；
[0076]
本发明优选的，所述药学上可接受的辅料包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂等中的一种或两者以上的混合物。
[0077]
本发明优选的，所述药物的剂型为口服制剂，更优选为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
[0078]
更优选的，所述胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。更优选的，所述片剂为口服片剂或口腔片剂。更优选的，所述口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。
[0079]
本发明还提供了一种治疗炎症的方法，其为给予本发明所述的药物。
[0080]
本发明还提供了一种预防、治疗或缓解炎症或炎症反应的食品，包括式i或式ii所示化合物中的一个或多个；
[0081]
与现有技术相比，本发明提供了一种预防及治疗炎症的化合物，具有式i或式ii所示结构，属联苄类化合物。以lps诱导raw264.7产生no为模型进行抗炎活性评价，式i或式ii所示的化合物能够抑制no的产生，体现抗炎活性。因此表明上述化合物能够用于制备预防、治疗和/或缓解炎症的食品和/或药品。
[0082]
如无特殊说明，本发明提供的联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0083]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0084]
实施例1化合物的制备和结构鉴定
[0085]
1.1仪器与试剂
[0086]
brukerav-500型超导核磁共振波谱仪(瑞士bruker公司)；autospec300质谱仪(英国vg公司)；分析型高效液相色谱仪(美国agilent公司)；半制备高效液相色谱仪(美国dionex公司)；n-1000(2l)立式旋转蒸发仪和ca-1111冷却水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)；shz-d(ⅲ)循环真空泵(上海隆拓仪器设备有限公司)；as 220.r2万分之一电子秤(radwag wagi elektroniczne)；sephadex lh-20凝胶(merck co.ltd)；c18反相硅胶(20～45μm，日本fuji silysia chemical ltd公司)；柱层析用硅胶和薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂)；氘代试剂和色谱甲醇(德国merck公司)；95％乙醇、重蒸甲醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮等常用有机试剂(天津科密欧、天津福晨、广州光华等公司)。
[0087]
1.2化合物的制备
[0088]
金钗石斛样品于2018年4月采自海南省海口市石山镇火山岩基地，标本存放于中
国热带农业科学院热带生物技术研究所。
[0089]
金钗石斛干燥茎(13.0kg)粉碎机打碎后，用2倍体积的乙醇水溶液浸提3次(25℃
±
5℃，每次浸提7天)，所得浸提液过滤后合并浓缩(40℃)至无醇味，得到乙醇提取物；将乙醇提取物与水体积比1:1制成混悬液，依序用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行1:1(v/v)萃取，然后将各萃取液浓缩依次制成萃取物；取乙酸乙酯提取物，过减压正相硅胶柱(12cm
×
70cm)，以石油醚-乙酸乙酯(20:1
→
0:1,v/v)混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，得到16个流份，记为fr.1～fr.16；采用活性跟踪的方法，对16个流份进行抗炎活性测试，发现流份fr.8具有较强的抗炎活性，在50μg/ml浓度下，no生成抑制率为64.5
±
2.6％。取fr.8(石油醚-乙酸乙酯4:1流份)经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(3:7
→
1:0)进行梯度洗脱，得到10个流份，记为fr.8-1～fr.8-10；取fr.8-6(甲醇-水7：3流份)经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到3个流份，记为fr.8-6-1～fr.8-6-3；取fr.8-6-1经硅胶柱以石油醚-丙酮(20:1
→
0:1)梯度洗脱得到式ii所示化合物2(320.4mg)(石油醚-丙酮10：1流份)；取fr.9(石油醚-丙酮9：1流份)经c18反相硅胶柱色谱以甲醇-水(1:1
→
1:0)进行梯度洗脱，得到11个流份，记为fr.9-1～fr.9-11；取fr.9-8(甲醇：水＝7：3流份)经凝胶sephadex lh-20(氯仿：甲醇＝1:1)梯度洗脱得到5个流份，记为fr.9-8-1～fr.9-8-5；取fr.9-8-2通过半制备hplc(cosmosil-pack ods-a c18柱，50％甲醇/水作流动相，流速：4ml/min，检测波长270nm)分离得到式i所示化合物1(tr＝15.8min,6.2mg)。
[0090][0091]
1.3化合物结构鉴定
[0092]
式i所示化合物1样品呈黄褐色油状，溶于甲醇。hr-esi-ms在m/z:283.0950给出[m+na]
+
峰，推测其分子式为c
15h16
o4。核磁数据见表1。对比文献数据确定化合物结构为4,5,4'-三羟基-3-甲氧基联苄。为已知化合物，未见抗炎活性报道。
[0093]
式ii所示化合物2样品呈橙红色胶状，溶于氯仿。hr-esi-ms在m/z:297.1097给出[m+na]
+
，推测其分子式为c
16h18
o4。核磁数据见表1。对比文献数据确定化合物结构为4,5-二羟基-3,3'-二甲氧基联苄。为已知化合物，未见抗炎活性报道。
[0094]
表1式i所示化合物1和2的1h nmr(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)数据
[0095][0096]a溶剂为氘代甲醇，b溶剂为氘代氯仿。
[0097]
实施例2式i或式ii化合物的抗炎活性评价
[0098]
2.1仪器与试剂
[0099]
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7)由中国科学院干细胞库提供；sw-40超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；co2培养箱(英国rs biotech公司)；elx-800酶标仪(美国宝特公司)；胎牛血清fbs，dmem培养液购自gibco，usa；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)、吲哚美辛购自sigma公司。
[0100]
2.2抗炎活性评价
[0101]
选取raw264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)，在96孔平底细胞培养板上接种100μl浓度为5
×
104个/ml的细胞，培养于37℃，5％co2，90％以上湿度的条件下，24h后加入50μl配制好的待测化合物溶液(100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm)，继续在该条件下培养，1h后加入50μl配制的lps(终浓度500ng/ml)溶液，24h后每孔取上清100μl于新的96孔板中，之后向每孔加入100μl(40mg/ml)的griess试剂，混匀后于酶标仪540nm波长下测定并记录每孔的吸光度，按下面公式计算no抑制率。对照组为吲哚美辛，阴性对照组为dmso，把待测化合物倍半稀释5个浓度梯度。用横坐标表示待测化合物浓度，纵坐标表示抑制率，作图求出待测化合物的ic
50
值。
[0102]
抑制率(％)＝(c2-c1)/(c2-c0)
×
100％；
[0103]
式中：c0、c1、c2分别为540nm下测得的空白对照组(不加lps)、实验组、阴性(加lps)对照组的吸光值。计算各浓度下的抑制率并绘制化合物浓度—抑制率曲线图，计算得到化合物对lps诱导raw264.7产生no的半抑制浓度(ic
50
值)。结果如表2所示，可以看出，上述化合物能有效抑制raw264.7细胞no的产生，表现出显著的抗炎活性，优于阳性对照吲哚美辛。表2式i或式ii所示化合物对lps诱导的raw264.7巨噬细胞产生no的抑制作用
[0104][0105]a阳性对照，*p《0.05vs阳性对照组。
[0106]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.联苄类化合物在制备预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应的药物中的应用；所述联苄类化合物包括如下任意项：(i)、如式i所示的化合物；和/或(ii)、如式ii所示的化合物；和/或(iii)、如(i)或(ii)所示化合物的衍生物；和/或(iv)、如(i)或(ii)所示化合物药学上可接受的盐；和/或(v)、如(i)或(ii)所示化合物的前药或药物中间体；2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应包括抑制促炎因子的产生。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促炎因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、一氧化氮或活性氧中的一种或多种。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促炎因子包括一氧化氮。5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述炎症反应包括机体发红、肿胀、发热或疼痛中的一种或多种。6.如权利要求1或5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括口服制剂；优选的，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂；更优选的，所述胶囊剂包括硬胶囊剂或软胶囊剂；更优选的，所述片剂包括口服片剂或口腔片剂。7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或多种。9.如权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，所述联苄类化合物的制备方法包括如下步骤：步骤1、取金钗石斛干燥茎，粉碎，乙醇水溶液浸提，过滤，浓缩后获得乙醇提取物；步骤2、取步骤1获得的乙醇提取物，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分级萃取，萃取液浓缩获得各级萃取物；步骤3、取步骤2获得的乙酸乙酯萃取物，采用活性追踪，分离纯化制得式i和/或式ii所示的化合物。

技术总结
本发明涉及天然药物领域，特别涉及联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用。本发明提供了式I，式II所示联苄类化合物在制备预防、治疗和/或缓解炎症或炎症反应的药物中的应用。本发明从金钗石斛中分离得到式I，式II所示的联苄类化合物，所述联苄类化合物具有显著抗炎活性，可作为潜在的治疗炎症相关疾病药物或先导化合物的开发应用。化合物的开发应用。化合物的开发应用。


技术研发人员：杨理 陈惠琴 魏艳梅 梅文莉 戴好富
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带生物技术研究所
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/14