一种将维生素D3转化成25-羟基维生素D3的基因工程菌及其基因、表达载体与应用的制作方法

一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌及其基因、表达载体与应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程菌技术领域，尤其涉及一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌及其基因、表达载体与应用。


背景技术：

2.维生素d3又名胆钙化醇，被广泛认为是一种重要的钙、磷代谢的调节物质，促进生长和骨骼钙化，治疗和预防佝偻病和骨质软化病。最近的研究表明维生素d3还可以调节免疫，增加胰岛素分泌，治疗和预防癌症、肥胖等等，总的来说维生素d3对于人体的健康水平维持和发展是非常重要。但是维生素d3本身的生物活性很低，而25-羟基维生素d3具有高生物活性，效价是维生素d3的3-5倍，生物活性是维生素d3的20-40倍，并且25-羟基维生素d3不需要经过肝脏代谢，适用于肝功能不全或者25-羟基氧化酶缺少的人群，此外25-羟基维生素d3经常作为动物的饲料添加剂，能够促进动物的骨骼发育，调节动物黏膜结构，而且在动物体内25-羟基维生素d3较普通维生素d3更容易吸收，生物学活性也更高。因此25-羟基维生素d3可广泛用于人体药物，保健品，动物食品添加剂，市场前景好，潜力大。
3.25-羟基维生素d3的合成方法主要是化学法和生物法两种，其中化学法是以麦角甾醇作为起始原料，经过光照开环、重排、保护、氧化、还原、去保护、连接等6-7步反应来合成25-羟基维生素d3，其反应步骤长，分离纯化复杂，低收率高成本，使得化学合成法的产业化局限性很大。
4.25-羟基维生素d3的生物法合成是最近研究的热点，生物法使用25-羟基氧化酶将维生素d3一步直接转化成为25-羟基维生素d3，对比化学合成法，其反应条件温和，生产成本低，对环境污染小，工业化前景十分看好。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
6.为此，本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，基因工程菌包含至少一个编码25-羟基氧化酶的外源dna序列，其基因序列为seq id no.1所示，其氨基酸序列为seq id no.2所示，编码铁氧还蛋白fdx的外源dna序列，其基因序列为seq id no.3所示，其氨基酸序列为seq id no.4所示，和细胞色素p450还原酶cpr的外源dna序列，其基因序列为seq id no.5所示，其氨基酸序列为seq id no.6所示。
7.作为优选，外源25-羟基氧化酶选自cyp2r1。
8.作为优选，已将外源dna序列通过基因工程技术引入基因工程菌,微生物已经包含外源dna序列的质粒转化，将的外源dna序列整合入微生物的基因组，基因工程菌还包含功能性内源聚合酶系统。
9.作为优选，基因工程菌是枯草芽孢杆菌。
10.作为优选，基因工程菌是枯草芽孢杆菌wb800菌株。
11.一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，包括如下步骤：
12.a、提供根据权利要求1-8中任何一项的基因工程菌；
13.b、在允许表达外源dna序列的条件下培养基因工程菌；
14.c、将基因工程菌培养物与底物维生素d3接触。
15.作为优选，底物维生素d3溶解于β-环糊精或丙二醇或丙二醇乙醇混合溶剂。
16.作为优选，b步骤为将基因改造的枯草芽孢杆菌wb800按照0.1％接种量加入改进的tb培养基在30～40℃下发酵20-50小时得到培养基成品，tb培养基为灭菌且增加碳源为0.5％～4％的甘油或1％～5％的葡萄糖。
17.作为优选，c步骤为添加维生素d3的β-环糊精水溶液或维生素d3的丙二醇溶液或维生素d3的丙二醇-乙醇混合溶液到培养基成品中进行发酵，最终维生素d3在发酵液中的终浓度在0.01-0.2％之间。
18.作为优选，c步骤为加入底物维生素d3后发酵20～72小时得到发酵液，将发酵液高温灭菌后喷干，维生素d3转换成25-羟基维生素d3的收率在40～70％之间。
19.本发明的有益效果为：(1)在本发明中采用全细胞合成法来合成25-羟基维生素d3；普通生物合成经常选用大肠杆菌作为宿主，由于其是革兰氏阴性菌，在发酵后期会产生内毒素，在食品工业和饲料业使用受到限制；而本发明使用枯草芽孢杆菌作为基因表达宿主，枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，是一种被中国农业农村部和美国fda公认的安全微生物，可以提供食品安全级的25-羟基维生素d3的制备，通过枯草芽孢杆菌发酵制备的产品可以在医药、食品、保健品和饲料添加剂等安全性要求高的行业使用；
20.(2)本发明通过使用基因工程菌作为全细胞催化剂来将维生素d3转化成25-羟基维生素d3，同时通过基因改造方法来提高生物转化的效率，本发明通过在枯草芽孢杆菌wb800中共表达cyp2r1，铁氧还蛋白fdx和细胞色素p450还原酶cpr实现了维生素d3高效率转换成25-羟基维生素d3；
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
22.实施例1：cyp2r1-cpr-fdx重组枯草芽孢杆菌的构建：
23.一、质粒pwb980-cyp2r1-cpr-fdx的获得：
24.根据三个酶的序列设计引物，用prime star hs dna聚合酶扩增得到目的基因片段，引物设计序列分别如seq id no.7、seq idno.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示)；
25.引物由上海生物工程有限公司合成，将扩增得到的目的基因片段经过双酶切后，回收含粘性末端的目的片段，与用同样内切酶处理过的pwb980载体片段经t4 dna连接酶连接，获得重组质粒。
26.pcr反应体系：ddh2o 22μl，premix primestar 25μl，上游引物(20μm)1μl，下游引物(20μm)1μl，质粒dna1μl。反应步骤：98℃30s，55℃30s，72℃7min，进行30个循环
27.纯化后的基因pcr产物用dpn i酶消化模板：
28.酶切体系：pcr产物30μl，10
×
buffer 5μl，dpn i 1.5μl，ddh2o将体系补足50μl。
29.酶切2h后利用3s spin agarose gel dnapurification kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化dna片段。
30.二、重组枯草芽孢杆菌b.subtilis wb800/pwb980-cyp2r1-cpr-fdx的构建：
31.挑选宿主菌wb800至3ml的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取菌液100μl接种至用50ml离心管配好5ml spi medium中，37℃、100rpm培养3h后测od600达到1左右，取100μl菌液接种到2ml spii medium中，37℃、100rpm培养1.5h，加20μl100
×
egta溶液，于37℃100rpm摇床培养10min，用1.5ml离心管分装成500μl每管，向管中加入60μl质粒，轻轻混匀与37℃100rpm摇床培养30min，将离心管转移到200rpm摇床37℃培养1.5h，以10000rpm离心收集菌体、弃部分上清，留100μl重悬菌体，涂卡那平板，37℃培养过夜。
32.阳性克隆的选择：
33.挑取4个单克隆，转接装有5ml的含有50μg
·
ml-1硫酸卡那霉素的lb培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒mini-plasmid rapid isolation kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。取出20μl质粒交由上海生工测序。
34.实施例2：重组枯草芽孢杆菌的表达培养
35.lb培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl 1％，ph7.0。需要时使用前加入硫酸卡那霉素(50μg
·
ml-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
36.tb培养基：酵母粉24g/l，胰蛋白胨12g/l，kh2po4 2.32g/l，k2hpo4
·
3h2o 16.43g/l，甘油5g/l，ph7.0。
37.挑取阳性克隆单菌落接种于5ml含50μg
·
ml-1硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10ml培养液转接于1l含50μg
·
ml-1硫酸卡那霉素的改进tb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养48h。
38.实施例3：
39.将100毫克的维生素d3，5克羟丙基-β-环糊精加入10毫升纯净水中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为46％。
40.实施例4：
41.将100毫克的维生素d3，5克甲基-β-环糊精加入10毫升纯净水中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到100毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为40％。
42.实施例5：
43.将100毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为41％。
44.实施例6：
45.将100毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇-乙醇(7：1)中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为51％。
46.实施例7：
47.将50毫克的维生素d3，5克羟丙基-β-环糊精加入10毫升纯净水中溶清，然后将此
溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为49％。
48.实施例8：
49.将50毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇-乙醇(7：1)中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为57％。
50.实施例9：
51.将10毫克的维生素d3，5克羟丙基-β-环糊精加入10毫升纯净水中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为61％。
52.实施例10：
53.将10毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇-乙醇(7：1)中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为61％。
54.实施例11：
55.将10毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇-乙醇(9：1)中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为66％。
56.实施例12：
57.将6毫克的维生素d3，5克羟丙基-β-环糊精加入10毫升纯净水中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，液相检测25-羟基维生素d3转化率为70％。
58.实施例13：
59.将6毫克的维生素d3，加入10毫升丙二醇-乙醇(9：1)中溶清，然后将此溶液过滤除菌后加入到50毫升实施例2中的发酵液中反应48小时，取样10毫升用20毫升乙酸乙酯萃取并浓缩，将浓缩物溶于0.5毫升甲醇，送液相检测25-羟基维生素d3转化率为70％。
60.本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
61.62.63.64.65.66.67.68.69.
技术特征：
1.一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含至少一个编码25-羟基氧化酶的外源dna序列，其基因序列为seq id no.1所示，其氨基酸序列为seq id no.2所示，编码铁氧还蛋白fdx的外源dna序列，其基因序列为seq id no.3所示，其氨基酸序列为seq id no.4所示，和细胞色素p450还原酶cpr的外源dna序列，其基因序列为seq id no.5所示，其氨基酸序列为seq id no.6所示。2.根据权利要求1所述的一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，其特征在于：所述的外源25-羟基氧化酶选自cyp2r1。3.根据权利要求1所述的一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，其特征在于：已将所述外源dna序列通过基因工程技术引入所述基因工程菌,所述微生物已经包含外源dna序列的质粒转化，将所述的外源dna序列整合入所述微生物的基因组，所述基因工程菌还包含功能性内源聚合酶系统。4.根据权利要求1所述的一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是枯草芽孢杆菌。5.根据权利要求4所述的一种将维生素d3转化成25-羟基维生素d3的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是枯草芽孢杆菌wb800菌株。6.一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，包括如下步骤：a、提供根据权利要求1-8中任何一项的基因工程菌；b、在允许表达所述外源dna序列的条件下培养所述基因工程菌；c、将所述基因工程菌培养物与底物维生素d3接触。7.根据权利要求6所述的一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，其特征在于：所述底物维生素d3溶解于β-环糊精或丙二醇或丙二醇-乙醇混合溶剂。8.根据权利要求6所述的一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，其特征在于：所述b步骤为将基因改造的枯草芽孢杆菌wb800按照0.1％接种量加入改进的tb培养基在30～40℃下发酵20-50小时得到培养基成品，所述tb培养基为灭菌且增加碳源为0.5％～4％的甘油或1％～5％的葡萄糖。9.根据权利要求8所述的一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，其特征在于：所述c步骤为添加维生素d3的β-环糊精水溶液或维生素d3的丙二醇溶液或维生素d3的丙二醇-乙醇混合溶液到培养基成品中进行发酵，最终维生素d3在发酵液中的终浓度在0.01-0.2％之间。10.根据权利要求9所述的一种用于25-羟基维生素d3的生物催化方法，其特征在于：所述c步骤为加入底物维生素d3后发酵20～72小时得到发酵液，将发酵液高温灭菌后喷干，维生素d3转换成25-羟基维生素d3的收率在40～70％之间。

技术总结
本发明公开了一种将维生素D3转化成25-羟基维生素D3的基因工程菌及其基因、表达载体与应用，基因工程菌包含至少一个编码25-羟基氧化酶的外源DNA序列，其基因序列为SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明中采用全细胞合成法来合成25-羟基维生素D3；普通生物合成经常选用大肠杆菌作为宿主，由于其是革兰氏阴性菌，在发酵后期会产生内毒素，在食品工业和饲料业使用受到限制；而本发明使用枯草芽孢杆菌作为基因表达宿主，枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，是一种被中国农业部和美国FDA公认的安全微生物，可以提供食品安全级的25-羟基维生素D3的制备。羟基维生素D3的制备。


技术研发人员：刘金松 曾新福 范小燕 李慧
受保护的技术使用者：浙江惠嘉生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.12.02
技术公布日：2023/9/14