老年痴呆早期诊断外周血蛋白标志物、应用及辅助诊断系统的制作方法

老年痴呆早期诊断外周血蛋白标志物、应用及辅助诊断系统
1.相关申请的交叉引用
2.本技术主张2022年3月14日提交的申请号为202210245944.x的中国发明专利申请的优先权，其内容通过引用的方式并入本技术中。
技术领域
3.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于血液的老年痴呆早期(轻度认知损害，mci)诊断外周血蛋白标志物、应用及其医疗辅助诊断系统。


背景技术：

4.(1)现有技术
5.阿尔茨海默病(ad)，俗称老年痴呆，是一种以记忆、认知和日常生活能力下降为主要特征的神经退行性疾病，在老年人群中患病率高、致残率高、疾病负担沉重。流行病学调查显示，60岁以上老年人群的患病率为3-5％，每增加5岁，患病率增加1倍，80岁以上可达20％，90岁以上可达50％。我国是个老龄化社会，据国家统计局公布的数据，截止到2020年底，我国60岁及以上人口达2.6亿人，占全国总人口18.7％。其中，痴呆患者1000万，而且，更为庞大的是，我国还拥有3000余万痴呆早期的轻度认知功能损害(mild cognitive impairment,mci)患者(2019年，柳叶刀)，[longfei j,meina q,et al.dementia in china:epidemiology,clinical management,and research advances.lancet neurology.2019,19(1):p81-92]，医疗和护理负担极其沉重。目前尚无药物能延缓或逆转疾病进程，因此阿尔茨海默病的早期诊断和干预至关重要。
[0006]
阿尔茨海默病大致可分为无症状期、轻度认知功能损害(mci)和痴呆期。患者在出现明显的临床症状前，可存在约10年左右的轻度认知功能损害。该阶段的患者虽然日常生活能力不受影响，但痴呆的病理变化已经在大脑中存在、发展，直到出现明显的临床症状。因此，mci被认为是进行早期诊断和干预的最佳阶段。
[0007]
但是，老年痴呆的早期诊断非常困难。近10年，美国国立衰老研究所和阿尔茨海默病协会(nia-aa)引进生物标志物的检测，使ad患者在出现明显的临床症状之前就可以实现早期诊断。2011年，nia-aa推荐采用氟脱氧葡萄糖-正电子体层扫描(fdg-pet)、淀粉样蛋白-正电子体层扫描(aβ-pet)、和脑脊液中aβ42、t-tau、p-tau检测作为ad早期诊断的生物标志物。但是，这些检查或成本昂贵(fdg-pet、aβ-pet)，或属有创操作(脑脊液检查)，目前仍主要用于研究领域、无法推广。因此，容易获取、检测方便的生物标志物成为大家竞相研究的重点。近年来研究发现，痴呆患者血液中部分物质的成分改变与其大脑的病理改变具有相关性，可反应大脑的病理变化。同时，血液还具有容易获取、可重复检测等优点，因此，血液检测可能成为痴呆早期诊断的有效方式。但是，血液中各成分构成复杂、含量低微，容易受到各因素影响而变化，因此，需要寻找到与痴呆相关的灵敏、可靠的早期诊断用生物标志物。当前研究发现外周血中痴呆的潜在生物标志物，主要包括血液中的microrna、血浆蛋白等指标，但仍处于探索阶段。血液中microrna的研究结果不够一致，尚缺乏大样本数据的
研究证据支持[miller,j.and j.kauwe,predicting clinical dementia rating using blood rna levels.genes,2020.11:p.706.]；而血浆蛋白因为其含量低、种类繁多，而受限于检测方法的敏感性和稳定性，结果也不够一致。就蛋白组学研究而言，kiddle等人(2014年)汇总21项研究分析，获得163个候选蛋白，筛选后就其中94个蛋白再次进行验证，研究结果和之前不够一致[kiddle,s.j.,et al.,candidate blood proteome markers of alzheimer's disease onset and progression:a systematic review and replication study.journal of alzheimers disease jad,2014.38(3):p.515.,许桦,肖世富,阿尔茨海默病外周血蛋白生物标志物研究进展.中华临床医师杂志:电子版,2017(10):p.1821-1824.]。2015年，另有研究者采用与kiddle等人相同的检测方法，筛选出一组蛋白(包括s100-a9蛋白、cd226抗原、体移植炎症因子1、内皮细胞选择性粘附分子、白细胞分化抗原cd84)，诊断mci的敏感度为96.7％，特异度为80.0％，准确度为92.5％[zhao x,lejnine s,spond j,et al.a candidate plasma protein classifier to identify alzheimer's disease[j].j alzheimers disease jad,2015,43(2):549-563]，但同样，该结果未能被后来的研究重复和验证。直到2020年，karikari等人在《lancet neurology》上发表大样本研究结果，外周血中的蛋白质作为痴呆诊断生物标志物的诊断价值才获得公认。该研究在1000多例患者上，对tau-181蛋白诊断痴呆的可靠性和稳定性进行验证，结果发现tau-181对处于痴呆阶段的患者诊断，有很好的敏感性和稳定性[karikari,t.,et al.,blood phosphorylated tau181as a biomarker for alzheimer's disease:a diagnostic performance and prediction modelling study using data from four prospective cohorts.the lancet neurology,2020.19:p.422-433.]。近2年的研究还包括血浆gfap蛋白、p-tau217、p-tau231等的诊断价值，总体而言，这些蛋白对于痴呆临床期诊断的正确性可达90％以上，但对痴呆早期mci阶段的诊断价值仍不够稳定，有待进一步证实[oeckl,p.,et al.,glial fibrillary acidic protein in serum is increased in alzheimer'sdisease and correlates with cognitive impairment.j alzheimers dis,2019.67(2):p.481-488.；chatterjee,p.,et al.,diagnostic and prognostic plasma biomarkers for preclinical alzheimer's disease.alzheimers dement,2021.；ashton,n.j.,et al.,plasma p-tau231:a new biomarker for incipient alzheimer's disease pathology.acta neuropathol,2021.141(5):p.709-724；thijssen,e.h.,et al.,plasma phosphorylated tau 217and phosphorylated tau 181as biomarkers in alzheimer's disease and frontotemporal lobar degeneration:a retrospective diagnostic performance study.lancet neurol,2021.20(9):p.739-752.]。
[0008]
综上所述，痴呆的早期诊断具有重要的社会需求，目前仍缺乏检测方便、易于推广的ad早期诊断方式，外周血获取方便、可重复多次检测，完全具备作为痴呆早期诊断工具的可能。然而，血液中的蛋白含量低、种类繁多，对检测技术的敏感性和稳定性要求高。因此，需要通过有效的技术，寻找可靠、敏感的ad早期诊断生物标志物。
[0009]
(2)现有技术存在的问题或不足之处
[0010]
随着蛋白组学技术的进步，可以从大规模水平寻找血液中的差异蛋白，通过对差异蛋白的筛选，寻找到潜在的生物标志物。目前用于高通量的外周血检测和筛查的蛋白组学技术主要包括以下几类：
[0011]
(a)基于免疫捕获(immunocapture)的检测方法：此类方法以抗原抗体的特异性结合为原理，结合多种具体技术实现蛋白质的定性和定量检测，如：蛋白质液相芯片(lumicaninex xmap)、电化学发光技术msd(mesoscale discovery)等[许桦,肖世富,阿尔茨海默病外周血蛋白生物标志物研究进展.中华临床医师杂志:电子版,2017(10):p.1821-1824.]。可以在少量血液样本中，对大量目标蛋白进行检测。其高通量的特点，能够满足临床研究的需要，但是，此类方法是建立在抗原抗体特异性结合的基础之上，不适合进行无假设目标的检测，同时受所选择抗体的影响和限制较大，结果不够稳定。
[0012]
(b)基于适配体(aptamer)的检测方法：此类方法基于适配体和目标蛋白的特异性结合。适配体是一种单链寡核苷酸，能够有效识别并结合目标蛋白，这种结合具有高亲和力和高特异性的特点。该方法也同样具有高通量的特点，其结果具有更好的稳定性，也是目前使用最多的一类方法，但其结果仍可能受到所选用适配体的影响而波动[gold,l.,et al.,aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.plos one,2010.5(12):p.e15004.]。从而使稳定性下降。
[0013]
(c)基于质谱(mass spectrometry，ms)的检测方法：质谱检测较前两种方法昂贵，其特点在于摆脱了抗体对结果的影响，具有最佳的稳定性和准确性。而且近年来，随着质谱检测技术的不断进步，其敏感性不断提升，既可以对血液中的蛋白质进行无靶标性(非假设)检测，也可以直接对候选蛋白进行定量检测，结合核素标记等技术，可实现对血液中的低丰度蛋白的精确定量[许桦,肖世富,阿尔茨海默病外周血蛋白生物标志物研究进展.中华临床医师杂志:电子版,2017(10):p.1821-1824.]，研究结果稳定可靠，是低丰度蛋白检测的金标准。


技术实现要素：

[0014]
本发明的主要目的就是针对现有技术中所存在的老年痴呆早期诊断困难的问题，提供一种稳定、可靠、可用于诊断老年痴呆早期阶段(mci)的简便检测技术。
[0015]
为达到上述目的，本发明一方面提供了一种用于老年痴呆早期诊断的外周血蛋白标志物，所述的蛋白标记物包括蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)或p00736(c1r)。
[0016]
本发明第二方面提供了上述检测用于老年痴呆早期诊断的外周血蛋白标志物的试剂在制备老年痴呆早期诊断试剂盒中的应用。
[0017]
较佳地，所述的试剂盒能够测定血浆中的p02753(rbp4)蛋白或p22352(gpx3)蛋白或p23560(bdnf)蛋白或p02765(ahsg)蛋白或p00736(c1r)蛋白的含量。
[0018]
较佳地，所述的试剂盒能够测定p02753(rbp4)或p22352(gpx3)或p23560(bdnf)或p02765(ahsg)或p00736(c1r)的任一肽段的含量。
[0019]
本发明第三方面提供了老年痴呆早期诊断的医疗辅助诊断系统，其中，所述的诊断系统中包括mci诊断模型，所述的mci诊断模型包括蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)、年龄、和性别组成。
[0020]
采用本发明提供的基于血液的老年痴呆早期诊断外周血蛋白标志物、应用及其医疗辅助诊断系统，具有以下有益效果：
[0021]
1、采用非靶向性蛋白组学技术(dia)对组间差异蛋白进行开放性探索，减少人为
偏倚，具有更好的客观性。
[0022]
2、采用导入ipa(ingenuity pathway analysis)生物分析软件，对蛋白所属功能通路、相关疾病进行分析，逐层筛选，挑选出和神经系统疾病、痴呆具有相关性的蛋白；再逐步验证，最终确定用于痴呆早期诊断的生物标志物，具有很好的稳定性和可靠性。
[0023]
3、采用具有极高精度的质谱分析仪，结合同位素标准肽，对血样中的低丰度蛋白进行精准定量，检测结果稳定、可靠。并在此基础上，建立稳定的预测模型，最终获得由p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)五个蛋白、以及性别、年龄因素组成的一组预测模式，模型整体预测mci的曲线下面积(auc)＝0.758，敏感度为78％，特异度为75％，具有很好的稳定性和较好的敏感性。
附图说明
[0024]
图1为本发明的mci与nc组差异蛋白的通路分析结果图。
[0025]
图2为本发明的prm实验流程及检测示意图。
[0026]
图3a-1～图3e-2分别为p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)五个蛋白的浓度和相应诊断mci的结果图。
[0027]
图4为本发明的预测模型诊断mci的结果图。
具体实施方式
[0028]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0029]
本发明采用质谱蛋白组学检测技术，首先通过对老年痴呆早期的amci(遗忘型轻度认知损害)患者和认知正常老人(nc)外周血中的血浆蛋白进行检测和比对，获得的差异蛋白层层筛选、逐步验证，再结合同位素标记方法，对获得的靶向蛋白进行精准定量和验证，从而寻找可用于ad早期诊断的生物标志物。整个研究过程分为四个阶段：第一阶段采用数据非依赖性采集(data independent acquisition，dia)对amci和正常老人(nc)外周血的差异蛋白进行非靶向性、开放性探索；第二阶段通过生物信息技术，对组间差异蛋白逐步筛选，通过分子通路、功能机制等的层层筛查，剔除无关蛋白，确立候选蛋白的范围。筛选策略包括：(1)组间统计学差异达到：student’s t test检验p＜0.05、差异倍数为1.5及以上的蛋白；(2)ipa(ingenuity pathway analysis)生物分析软件，对蛋白所属功能通路、相关疾病进行分析，逐层筛选，挑选出和神经系统疾病、痴呆发病机制具有相关性的蛋白；第三阶段，获得候选蛋白在38例老年人群中进行初步验证，剔除检测及预测效果不佳的蛋白，进一步筛选，获得20个候选生物标志物；第四阶段，在155例老年人群中验证候选生物标志物的诊断效能。采用平行反应监测(parallel reaction monitroing，prm)质谱技术，结合同位素标记合成肽段，对20个靶向蛋白进行精准定量。在155例老年人中进行验证，最终获得一组蛋白(rbp4、gpx3、bdnf、ahsg、c1r)，结合年龄、性别，对amci早期诊断的敏感度达78％，特异度达到75％。
[0030]
如图1所示，ipa软件分析amci与nc组比较所得的差异蛋白，及其所属的功能通路。取p值的-log值在1.3以上(相当于p＜0.05水平)有统计学差异的通路共计17条，按照统计学差异的显著性从大到小排序为：急性反应信号通路、lxr/rxr激活、凝血系统、nadh修复、
组织因子在癌症中角色、fxr/rxr激活、gp6信号通路、il-8信号、胆碱生物合成iii、外在的凝血酶原激活途径、青年期早发性糖尿病(mody)信号、醣酵解i、糖异生i、内在的凝血酶原激活途径、磷脂酶、神经肌肉接头处集聚蛋白的相互作用等。
[0031]
如图2所示，通过spectrodive8软件对110多个目标蛋白进行靶向肽段的挑选，根据挑选的靶向肽段进行预实验，对目标肽段的检测效果进行分析，剔除信号强度差、检测效果不理想的蛋白，保留检测效果比较理想的蛋白，进入正式的prm定量检测及验证。
[0032]
如图3所示，该模型由p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)五个蛋白、以及性别、年龄因素组成的，模型的整体预测mci的auc＝0.758，敏感度为78％，特异度为75％。
[0033]
1.dia质谱检测
[0034]
在本实施例中，进行dia检测的例数为：amci组6例、nc组6例。amci组的平均年龄为68.17
±
6.369岁，nc组的平均年龄为70.50
±
10.585岁，两组年龄比较没有统计学差异(f＝1.775,p＝0.412＞0.05)。amci组、nc组的性别构成不存在统计学差异(x2＝0.670，p＝0.733＞0.05)。检测样本为人体外周血血浆。样本收集及处理严格按照统一规范完成。血液采集条件为：受试者空腹12小时，于次日清晨取肘静脉血，置于红色抗凝管内。采集后2小时内完成血液离心，分离血浆和血细胞。
[0035]
表1.dia质谱实验所需试剂和仪器规格
[0036]
[0037][0038]
dia质谱检测过程包括样本预处理、反向液相色谱分离(rplc)、dda检测及建库、dia个体样本检测等。检测所得蛋白采用dia质谱检测的专业分析软件spectronaut pulsar进行谱峰信息的提取、校正、积分。
[0039]
1.1实验步骤
[0040]
1.1.1样本准备
[0041]
检测所需要的蛋白质提取要求为无环境蛋白质、peg、triton、甘油等污染，肽段的准备要求为非特异性还原烷基化低于30％、非特异性酶切率低于5％、无明显非特异性修饰。前处理流程如下：
[0042]
(1)血浆100倍稀释，用bca法进行蛋白定量分析；
[0043]
(2)根据测定的蛋白浓度，分别取100ug蛋白，用100mm teab稀释至100ul；
[0044]
(3)加入1m的还原剂dtt 1ul，至终浓度为10mm，在37℃温育1小时；
[0045]
(4)加入2ul 1m碘乙酰胺，至最终浓度为20mm，室温，避光，温育1小时；
[0046]
(5)沉淀用5倍体积于样品的丙酮，在-20℃温度下静置过夜(12小时)；
[0047]
(6)于4℃下，12000g，离心20分钟；
[0048]
(7)去上清，向蛋白沉淀中加入-20℃乙醇和丙酮(比例为1:1)1ml进行混合，震荡洗涤5分钟，重复2次；
[0049]
(8)于4℃下，12000g，离心20分钟；
[0050]
(9)去上清，将蛋白沉淀置于室温下自然干燥，至沉淀变为透明；
[0051]
(10)向沉淀中加入50mm碳酸氢铵100ul，按照1:40(质量比w:w)比例，加入2.5ug测序级胰酶，37℃酶解过夜。
[0052]
1.1.2高效液相色谱分离
[0053]
采用高ph反相分离法对样本进行分离。取所有样品等量肽段，混合冻干，加入缓冲液a(buffer a:20mm甲酸铵水溶液，氨水调节至ph10.0)，进行分馏。高效液相色谱仪ultimate3000系统连接xbridge c18columicann反相柱，采用线性梯度进行高ph分离。于30分钟内，调节流动相b(80％乙腈中加入20mm甲酸铵，并将氨水的ph值调节至ph10.0)的浓度从5％升至45％，柱子在初始条件下平衡15分钟，柱子维持1毫升每分钟的流速，温度维持在30℃稳定，在此条件下共收集12个馏分。
[0054]
1.1.3质谱数据依赖式采集及建库
[0055]
各馏分加入30μl溶剂c(0.1％甲酸水溶液)制成悬浮液后，加入irt肽进行矫正，通过纳米液相(nano-lc)分离后，经在线电喷雾进行串联质谱分析。实验在easy-nlc 1200system上进行，系统连接于设有电喷雾离子源的q exatives plus质谱仪。3μl肽段样品以10μl每分钟的流量上样到捕集柱后，在分析柱中以线性梯度分离，150分钟内调节5％溶液d(d：0.1％甲酸乙腈溶液)至40％ d。柱子在初始条件下平衡10分钟，流量控制在300nl
每分钟速度，电喷雾离子源的电压设置为2千伏。质谱仪在数据依赖采集模式下工作，自动在一级质谱(ms)和二级质谱(ms/ms)间切换。在70k质量分辨率下获得全扫描谱图，质荷比(m/z)范围为350-1550，自动增益控制(automatic gain control，agc)用以控制进入离子阱的离子数量，目标设置为3e6，随后在17.5k分辨率下进行后续高能碰撞解离ms/ms扫描。参数设置：隔离窗(isolation window)设置为1.6da，agc目标设置为1e5，ms/ms fixed first mass设置为200，microscan设置为1，动态排除时间30秒。
[0056]
原始数据通过swiss-prot homo sapiens(2017-3-27)数据库进行搜库，搜库时将胰蛋白酶(trypsin)设置为消化酶，具体参数设置为：(1)搜索时碎片离子质量所允许的误差范围为0.050道尔顿；(2)搜索时母离子质量所允许的误差范围为10.0ppm；(3)允许的固定修饰：脲甲基化(carbamidomethyl，c)；(4)允许的可变修饰：天冬酰胺(asparagine)及谷氨酰胺(glutamine)脱酰胺基、甲硫氨酸(methionine)氧化、蛋白n端乙酰化。通过以上搜库信息建立谱图数据库，为后续dia检测建立比对标准。
[0057]
1.1.4质谱数据非依赖式采集和数据分析
[0058]
dia检测流程如下：取样品各9ul，加入irt肽，在easy-nlc 1200system上进行，系统连接装有在线电喷雾离子源的q exactives plus质谱仪。3μl肽段样品以10μl每分钟的流量上样到捕集柱，随后在分析柱中以线性梯度分离，150分钟内调节d溶剂的浓度从5％升至40％。柱子在初始条件下平衡10分钟，流量控制在300nl每分钟速度，电喷雾离子源的电压设置为2千伏。质谱仪在数据非依赖采集模式下运行，自动在一级质谱和二级质谱采集间进行切换。在70k质量分辨率下获得全扫描谱图，质荷比范围为350-1550，agc目标设定为3e6，随后在17.5k分辨率下进行后续高能碰撞解离ms/ms扫描，agc target为3e6。采用39个窗口对该范围内所有肽段进行裂解和扫描，窗口覆盖如下(表2)。
[0059]
表2.dia扫描窗口覆盖范围
[0060][0061]
采用spectronaut pulsar软件优化数据采集及分析，主要包括：设置循环时间(获得洗脱峰的最优化提取)、根据色谱峰宽调整母离子窗口、调整循环时间。每个谱峰提取6-8
个数据点用于分析，对谱峰信息进行提取、校正、积分，以默认参数设置(bgs factory settings-default)对dia质谱数据进行分析，蛋白质定性标准为母离子阈值(precursor threshold)设为1.0％fdr(false discovery rate)。同时采用该软件进行三组间差异蛋白的初步分析，差异蛋白的设置标准为三组间两两比较：student’s t test分析p＜0.05、差异倍数为1.5及以上的蛋白。
[0062]
2.组间差异蛋白分析和候选生物标志物筛选
[0063]
由于prm靶向质谱检测对目标蛋白的数目有一定限制，为确保后续研究中低丰度蛋白定量的准确性，需要对dia检测所获得的数百种蛋白进行分析，逐步筛选，确立候选的生物标志物，用于后续验证和诊断分析。差异蛋白导入ipa(ingenuity pathway analysis)生物分析软件，对蛋白所属功能通路、相关疾病进行分析(图1)，逐层筛选，挑选出和神经系统疾病、痴呆发病机制具有相关性的蛋白；识别最可能和ad存在关联的目标蛋白进入下一步验证；
[0064]
3.prm定量分析(初步验证)
[0065]
获得候选蛋白在38例老年人群中进行初步验证，剔除检测效果不佳的蛋白，进一步筛选。
[0066]
3.1实验材料、试剂及设备
[0067]
将收集到的生物样本采用biognosys前处理试剂盒(sample preparation kit pro，biognosys ag)进行蛋白提取、还原烷基化及酶解，然后每个样本取适量酶解好的肽段按照一定比例掺入pq500标肽试剂。制备好的样品首先采用unscheduled prm方法采集目标肽段以优化保留时间窗口，优化好方法之后即可进行正式实验。采集得到的数据经spectrodive(biognosys ag)软件进行目标肽段的鉴定和定量分析。
[0068]
表3.prm检测所需试剂及仪器规格
[0069]
[0070][0071]
实验步骤
[0072]
3.2prm预实验
[0073]
靶向肽段挑选标准为：
①
特征性肽段(unique peptide)；
②
肽段序列长度大于7个氨基酸，小于20个氨基酸；
③
肽段完全酶切，没有漏切位点，肽段序列中不包含脯氨酸；
④
肽段可包含固定修饰，但不包含可变修饰。
[0074]
根据挑选的肽段信息，进行预实验，用2个制备好的肽段样本进行检测。取样品等量肽段，混合冻干，在buffer a(buffer a：20mm甲酸铵水溶液，氨水调节至ph值达10.0)重新溶解后用ultimate3000系统连接反向柱，进行高ph反向分离，分离使用线性梯度，30分钟内梯度内由5％ b升至45％ b(b：80％乙腈中加入20mm甲酸铵，氨水调节至ph值达10.0)。柱子在初始条件下平衡15分钟，柱子维持1毫升每分钟的流速，温度维持在30℃稳定，在此条件下收集6个馏分用于分析。
[0075]
各馏分加入30ul溶剂c(c溶剂为0.1％甲酸水溶液；d溶剂为0.1％甲酸乙腈溶液)制成悬浮液后，加入irt肽，用反向液相分离，采用在线电喷雾离子源进行串联质谱检测和分析。采用easy-nlc 1000system完成该实验，同时，系统连接装有电喷雾离子源的orbitrap fusion tribrid质谱检测仪器。10ul肽段样品以10ul每分钟的速度上样到捕集柱，随后在分析柱中以线性梯度进行分离，在120分钟内将3％ d浓度升至32％ d浓度，柱子在初始条件下平衡10分钟，控制300nl每分钟的流量，电喷雾离子源的电压为2千伏。
[0076]
质谱仪首先在数据依赖采集模式下工作，仪器在一级质谱(ms)和二级质谱(ms/ms)采集间自动切换。在60k质量分辨率下扫描，全扫描谱图的质荷比(m/z)范围在350-1550之间，随后在15k分辨率条件下完成后续高能碰撞(hcd)二级质谱(ms/ms)扫描。具体参数设置：隔离窗(isolation window)设置为1.6da，agc target设置为400000，ms/ms fixed first mass设置为110，microscan设置为1，动态排除时间45秒。
[0077]
预实验数据导入spectronaut pulsar，通过嵌入的mascot distiller version 2.6进行搜库，数据库设置为swissprot homo sapiens(2017-3-27)，设置胰蛋白酶(trypsin)为酶解酶。搜库采用的具体参数：允许碎片离子质量误差范围为0.050da；允许母离子质量误差范围为10.0ppm；允许固定修饰为carbamidomethyl(c)；允许可变修饰为asparagine及glutamine脱酰胺基、methionine氧化、蛋白质n端乙酰化。搜库结果导入spectrodive 8软件进行分析，去除无法检测或目标肽段信号强度不理想的蛋白，根据预实验结果进行母离子及分析方法设置，然后进行正式的prm检测。
[0078]
3.3prm正式检测及数据采集
[0079]
取9ul样品，加入irt肽，经过在线电喷雾离子源后，在同一质谱仪上进行检测，设定质谱检测梯度为120分钟。2ul肽段样品以10ul每分钟流量上样到捕集柱，在分析柱中以
线性梯度分离：120分钟内将溶剂d的浓度由3％升至32％。分析柱在初始条件下平衡10分钟，流速控制在300nl每分钟，电喷雾离子源电压为2千伏。质谱仪首先在数据依赖采集模式下工作，仪器在ms(一级质谱)和ms/ms(二级质谱)采集间自动进行切换。在60k质量分辨率下扫描，获得全扫描谱图的质荷比范围为350-1550，随后在15k分辨率下进行后续高能碰撞ms/ms扫描，质谱选择prm模块。每个样品在最初检测的基础上重复检测一次以增加蛋白定量的准确性。采集到的数据导入spectrodive 8进行分析，对样品的信号强度进行矫正，以排除样品制备、仪器检测带来的人为误差。每个肽段采集最好的6个碎片离子(子离子)信号，碎片离子谱峰面积(peak area)之和代表肽段信号强度。每个蛋白选择3-5个肽段，肽段的平均信号强度代表该蛋白的表达量。
[0080]
4.同位素标记合成肽段结合prm技术进行精准定量及验证(扩大样本验证)。
[0081]
对以上筛选所获得20个候选生物标志物，结合同位素标记合成肽段prm技术进行精准定量和扩大样本验证。验证对象为155例老年人，其一般资料见表4。
[0082]
表4.nc和amci组一般资料比较
[0083][0084]
注：nc＝认知功能正常；amci＝遗忘型轻度认知损害
[0085]
采用具有高精度的串联easy-nanolc1200的orbitrap fusion
tm lumos
tm tribrid
tm
质谱仪(thermo fisher scientific,ma,usa)进行定量。首先，通过选择目标蛋白质的代表性肽段，对肽段进行质谱信号采集，获取目标蛋白质定量信息，同时，通过合成同位素标准肽段，绘制标准曲线，实现蛋白质的绝对定量。
[0086]
首先，在一级质谱中(q1)选择性地检测目标肽段的母离子信息；对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。实验包含2组样品。样品准备期间，所有待检测的样品中都添加pq500(ki-3019-96,biognosys ag,switzerland)同位素标记肽段用于目标肽段的鉴定和定量分析。所有样品的采集采取随机上样的方式。采集到的prm数据通过spectrondive 9.10(biognosys ag,switzerland)软件进行数据归一化和定量分析，通过students ttest(非配对，双尾)算法计算p值，差异倍数计算采用每组的平均值。样品前处理根据biognosys sample preparation kit pro试剂盒(ki-3013,biognosys ag,switzerland)说明书进行。制备好的肽段经由配备在线纳喷离子源的lc-ms/ms系统进行prm分析。
[0087]
5数据分析和建模
[0088]
5.1对获得的目标蛋白的定量结果进行统计分析。首先做单个蛋白的诊断mci的效能分析，所获得的结果按照p＜0.05，auc＞0.58为标准进行了筛选，最终获得的5个蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)具备较好的诊断价值。预测mci的auc分别为0.61、0.62、0.60、0.60、0.58，目标蛋白的浓度和auc见图3所示。
[0089]
5.2为进一步提高诊断价值，随后对获得的蛋白等数据进行建模，建模的目的在于想要找出一个最优的模型，对amci和健康人进行更有效的区分。调整训练集和测试集比例为75％：25％；对所有数据进行bagging tree缺失值插补。首先使用填充好缺失值的数据进
行肽段筛选，对每种肽段进行t-test。其次将蛋白中效力差的剔除即只保留pvalue最小的肽段代表蛋白的含量。将以上筛选出的蛋白进行模型训练，使用bootstrap 1000次的重抽样方法。在所有样本中取75％的样本作为训练集样本，剩余25％为预测集样本。采用逻辑回归的方法进行模型建立。该模型由p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)五个蛋白、以及性别、年龄因素组成的，模型的整体预测mci的auc＝0.758，敏感度为78％，特异度为75％(请参阅图4所示)。
[0090]
拟合公式：
[0091]
除了上述提到的技术方案，还可以采用质谱检测该五个蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)及其所属的肽段，以及采用抗原抗体结合技术、适配体结合技术对这5个蛋白进行的检测。
[0092]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

技术特征：
1.一种用于老年痴呆早期诊断的外周血蛋白标志物，其特征在于，所述的蛋白标记物包括蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)或p00736(c1r)。2.一种检测如权利要求1所述的外周血蛋白标志物含量的试剂在制备老年痴呆早期诊断试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括用于测定血浆中的p02753(rbp4)蛋白或p22352(gpx3)蛋白或p23560(bdnf)蛋白或p02765(ahsg)蛋白或p00736(c1r)蛋白的含量的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒用于测定p02753(rbp4)或p22352(gpx3)或p23560(bdnf)或p02765(ahsg)或p00736(c1r)中的任一肽段。5.一种老年痴呆早期医疗辅助诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统中包括一种老年痴呆早期诊断模型，该模型包括蛋白p02753(rbp4)、p22352(gpx3)、p23560(bdnf)、p02765(ahsg)、p00736(c1r)、年龄、性别组成。

技术总结
本发明提供了一种用于老年痴呆早期诊断的外周血蛋白标志物，所述的蛋白标记物包括蛋白P02753(RBP4)、P22352(GPX3)、P23560(BDNF)、P02765(AHSG)或P00736(C1R)，以及所述的老年痴呆早期诊断的蛋白标志物在诊断试剂盒中的应用，最后建立了一种老年痴呆早期诊断模型，模型的整体预测曲线下面积AUC＝0.758，敏感度为78％，特异度为75％。特异度为75％。特异度为75％。


技术研发人员：许桦 肖世富 王涛
受保护的技术使用者：上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心）
技术研发日：2022.11.28
技术公布日：2023/9/14