一种细胞膜纳米粒及其制备方法与用途

1.本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种细胞膜纳米粒及其制备方法与用途。


背景技术：

2.细胞膜包载纳米粒，在保留原有内核纳米粒性质的基础上，能增加原细胞的相关生理功能，如依靠细胞膜表面的蛋白增强浸润病灶部位或吸附细胞因子等。此外，细胞膜纳米粒可通过表面的蛋白如cd47和cd24，延长体内循环时间防止被内吞。
3.通过物理结合或化学修饰的方法在细胞膜上引入额外的蛋白能增加细胞膜纳米粒的功能。修饰额外蛋白可以通过连接剂，将目的蛋白化学连接至细胞膜表面，但这种方法可能会影响原有膜表面蛋白的功能。也可将目的蛋白与亲脂碳链如dspe等进行连接，利用亲脂碳链的疏水性插入细胞膜的磷脂双分子层。基因工程化技术通过对目的细胞进行基因改造，使其表达某种特定的蛋白，已被应用于细胞膜纳米粒的研究中。这种方法不仅保留了原有细胞膜的功能，还可使目的蛋白稳定表达在细胞膜表面。如通过慢病毒感染构建表达α4蛋白的工程化细胞，与细胞膜表面原有的β1蛋白组成炎症受体迟现抗原-4(very late appearing antigen-4，vla-4)，提取细胞膜制备纳米粒，靶向炎症部位的血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，vcam-1)用于治疗肺炎。还有研究通过基因工程化使t细胞过表达程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1，pd-1)，制备成细胞膜纳米粒后，通过阻断肿瘤细胞的细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)发挥抗肿瘤疗效。
4.免疫细胞具有天然的炎症靶向能力，如中性粒细胞、巨噬细胞、t细胞等。在早期炎症中，cd4
+
t辅助1(th1)细胞和中性粒细胞浸润损伤部位并释放促炎细胞因子。在炎症晚期，调节性t(treg)细胞和th2细胞增殖，通过产生抗炎细胞因子来抑制炎症进程，如转化生长因子-β(tgf-β)和il-10。在关节炎和结肠炎中，均有大量的cd4
+
t细胞浸润炎症组织。但如果炎症不受控制，过度激活的免疫细胞，如巨噬细胞等，会分泌促炎细胞因子，如tnf-α、il-1β和il-6等，进一步召集外周血中的免疫细胞到达炎症部位，恶化炎症程度，进而形成了一个高活性氧(reactive oxygen species，ros)的微环境。因此，利用免疫细胞在炎症部位的深层组织穿透能力，能提高纳米载体对炎症组织的靶向性和渗透性。本发明由此而来。


技术实现要素：

5.为了解决本发明背景技术中的技术问题至少之一，本发明提供了细胞膜纳米粒及其制备方法与用途。
6.本发明的技术方案是：本发明的一个目的在于提供一种细胞膜纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
7.载药纳米粒制备：通过活性氧敏感的铜缩硫醇交联剂将mtx和dasa分别链接至透明质酸，合成ha-tk-mtx或ha-tk-dasa聚合物，所述聚合物在生理盐水中自组装成载药纳米粒；细胞膜制备：使用基因工程技术，构建细胞表面可稳定表达acd4单链抗体scfv的巨噬细
胞株，感染流程将巨噬细胞极化为m1型，随后提取细胞膜，得到cd4靶向的细胞膜；细胞膜纳米粒制备：将细胞膜和载药纳米粒共挤出，制得细胞膜纳米粒。需要说明的是，该步中的载药纳米粒为ha-tk-mtx和ha-tk-dasa。
8.本发明的另一个目的在于提供一种不同的细胞膜纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
9.载药纳米粒制备：通过活性氧敏感的铜缩硫醇交联剂将mtx和dasa分别链接至透明质酸，合成ha-tk-mtx或ha-tk-dasa聚合物，所述聚合物在生理盐水中自组装成载药纳米粒；细胞膜制备：将巨噬细胞极化为m1型，提取细胞膜，然后用nhs功能化的dsep-peg与cd4单克隆抗体反应得dspe-peg-acd4，并将dspe-peg-acd4插入m1型细胞膜中，得到cd4靶向的细胞膜；细胞膜纳米粒制备：将细胞膜和载药纳米粒共挤出，制得细胞膜纳米粒。需要说明的是，该步中的载药纳米粒为ha-tk-mtx和ha-tk-dasa。
10.本发明还有一个目的在于提供了一种根据上述所述的制备方法制备得到的细胞膜纳米粒tacd4m1-np。
11.本发明还有另外一个目的在于提供了一种根据上述所述的细胞膜纳米粒用于制备治疗炎症性疾病药物中的用途。
12.本发明筛选出具有协同抑炎功效的新药物组合，运用治疗白血病的达沙替尼治疗炎症性疾病，老药新用。创新应用甲氨蝶呤与达沙替尼的药物组合治疗炎症性疾病。也创新设计可搭载内源性cd4
+
t细胞的药物递送体系，利用cd4
+
t细胞的体内分布特性和对炎症部位的趋化性能，实现药物的靶向递送，高效治疗炎症性疾病如类风湿关节炎和溃疡性肠炎，为炎症性疾病的治疗提供了新方法和新思路。
附图说明
13.图1为本发明实施例的细胞膜纳米粒的合成流程及作用机理示意图(图1a为合成路线；图1b为作用机制图)；图2为mtx和dasa对免疫细胞的体外抑制数据(数据表示为平均值
±
标准差(n＝3))；图3为mtx和dasa联合给药在胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，cia)小鼠中的抗炎效果示意图(图3a为实验流程图；图3b为足爪肿胀图；图3c为关节炎指数数据；图3d为小鼠体重曲线图；
14.图3e为血清il-6浓度；图3f为血清il-1β浓度；图3g为血清tnf-α浓度；数据表示平均值
±
标准差(n＝4-5)，ns为无显著性差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)；图4为mtx和dasa联合给药在脂多糖诱导的急性炎症小鼠模型中的抗炎效果图(图4a为实验流程图；图4b为小鼠和炎症部位生物发光图像；图4c为炎症部位荧光强度；数据表示为平均值
±
标准差(n＝8)，采用双尾非配对学生t检验进行分析。ns为无显著性差异，*p《0.05，**p《0.01)；图5中为mtx和dasa联合给药在酵母聚糖a诱导的关节炎(zymosan a induced arthritis，zia)小鼠中的抗炎效果图(图5a为实验流程图；图5b为关节相对周长图；图5c为体重曲线图；图5d为滑膜炎症因子；数据表示为平均值
±
标准差(n＝5)，ns为无显著性差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)；图6为mtx和dasa联合给药在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)小鼠中的抗炎效果示意图(图6a为实验流程图；图6b为结肠长度图；图6c为结肠长度图；图6d为体重曲线图；数据表示为平均值
±
标准差(n＝5)，ns为无显著性差异，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001)；图7为本发明的温敏水凝胶的
species，ros)敏感的酮缩硫醇(thioketal，tk)交联剂，将mtx和dasa链接至生物安全性高、可降解的透明质酸(hyaluronic acid，ha)，分别合成ha-tk-mtx与ha-tk-dasa聚合物。聚合物能在生理盐水或水中自组装形成ros响应性纳米粒。
②
通过2种方法制备表达靶向cd4的蛋白的细胞膜。制备得dspe-peg-acd4，通过dspe插膜将acd4链接至细胞膜表面；第一种方法为通过基因工程技术，构建细胞表面可稳定表达acd4单链抗体(single chain antibody fragment，scfv)的巨噬细胞株，构建完成后巨噬细胞极化为m1型，并提取细胞膜；第二种方法为用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-n-羟基琥珀酰亚胺(dspe-peg2000-nhs，dp-nhs)修饰cd4单抗(acd4)。
③
通过脂质体挤出仪共挤出的方式，将表达acd4蛋白的巨噬细胞膜包裹在ha-tk-mtx/dasa纳米粒表面。
19.本发明的细胞膜纳米粒的工作原理如下(图1b)：
①
静脉给药后，纳米粒依靠anti-cd4靶向并搭载外周血的cd4+t细胞，t细胞依靠炎症趋化能力携带纳米粒渗透至炎症部位。
②
未搭载上cd4+t细胞的游离纳米粒可依靠细胞膜表面的p选择素糖蛋白配体1(p-selectin glycoprotein ligand-1，psgl-1)和淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，lfa-1)分别与病变血管的p-选择素(p-selectin)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，icam-1)配体结合，富集在炎症部位。
③
炎症部位的纳米粒响应环境中的高ros，释放两种免疫抑制药物，协同抑制免疫细胞。该细胞膜纳米粒搭载cd4+t细胞的药物递送梯体系可通过搭载cd4+t细胞实现炎症部位的靶向给药，抑制炎症部位多种免疫细胞活性，清除病变部位的炎症因子和活性氧，显著抑制炎症反应。
20.实验方法
21.1.1试剂：胎牛血清、rpmi 1640和dmem培养基购自美国gibco公司。青霉素和链霉素购自武汉普诺赛生命科技有限公司。丙酮酸钠和非必需氨基酸购自北京索莱宝科技有限公司。透明质酸(hyaluronic acid，ha，10kda)购自重庆渝偲医药科技有限公司。luminol、lucigenin、丁二酸酐、甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)、dmap、nhs和edc购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ack红细胞裂解液、粪便隐血试剂盒和达沙替尼(dasatinib，dasa)购自上海源叶生物科技有限公司。alamar blue购自上海翊圣生物科技有限公司。ficoll-paque plus单核细胞分离液购自美国cytiva公司。鼠源cd4、cd3和cd28单抗购自美国bio x cell公司。dspe-peg2000-nhs购自上海芃硕生物科技有限公司。ripa裂解液、dio染料、hoechst 33342、bca试剂盒和脂多糖(lipopolysaccharide，lps)购自上海碧云天生物技术有限公司。ifn-γ购自美国peprotech公司。cd4
+
t细胞阴选分离试剂盒购自加拿大stemcell公司。鼠源il-6、il-1β、tnf-αelisa试剂盒和lipo3000购自美国thermo fisher公司。磷钨酸负染色液购自上海麦克林生化科技有限公司。h2o2购自上海凌峰化学试剂有限公司。葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，dss，40kda)购自上海西宝生物科技股份有限公司。酵母聚糖a购自德国sigma公司。tk-nh2和fitc-dextran(4kda)购自重庆渝偲医药科技有限公司。alt和ast检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。牛ii型胶原蛋白、弗式完全佐剂(complete freund’s adjuvant，cfa)和弗式不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant，ifa)购自美国chondrex公司。
22.1.2实验动物：cd4
+
t细胞由c57bl/6小鼠的脾脏提取，使用含有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素、1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸的rpmi 1640培养基进行培养。
model组、
②
mtx组、
③
dasa组和
④
mtx+dasa组，每组8只。第2天和第4天，尾静脉给药。mtx组给药50μg mtx，dasa组给药50μg dasa，mtx+dasa组给药50μg mtx和50μg dasa。第5天，每只小鼠腹腔注射含有200μgluminol和50μg lucigenin的混合溶液，5min后ivis成像仪(ivis lumina iii，美国caliper life sciences公司)检测生物荧光。
34.1.7mtx和dasa联合给药在酵母聚糖a诱导的关节炎小鼠中的抗炎效果
35.第0天，酵母聚糖a使用无菌pbs溶解至，雄性c57bl/6小鼠使用异氟烷气体麻醉，通过髌骨韧带注射20μl(30μg)酵母聚糖a溶液于膝关节腔内，诱导小鼠产生关节炎，即zia(zymosan a induced arthritis)模型。第1天，小鼠膝关节红肿，进行分组，共4组：
①
zia组、
②
mtx组、
③
dasa组和
④
mtx+dasa组，每组5只。第1、3和5天，尾静脉给药。mtx组给药50μg mtx，dasa组给药50μgdasa，mtx+dasa组给药25μg mtx和25μg dasa。每日观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠的体重，游标卡尺测量膝关节长宽，计算周长。
36.第6天，co2安乐死小鼠，解剖取小鼠踝关节的滑膜组织，加入1ml ripa强裂解液，在冰浴中匀浆，4℃裂解1h，12000g、4℃离心20min后取上清。bca试剂盒测定上清的蛋白质浓度，elisa试剂盒测定il-6、il-1β和tnf-α的浓度。
37.1.8mtx和dasa联合给药在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠中的抗炎效果
38.雄性c57bl/6小鼠，自由饮用含有2.5％葡聚糖硫酸钠(40kda)的水，诱导产生结肠炎，即uc(ulcerative colitis)模型。第0天，小鼠分组，共4组：
①
uc组、
②
mtx组、
③
dasa组和
④
mtx+dasa组，每组5只。第0～5天，小鼠自由饮用含有2.5％葡聚糖硫酸钠的水。第1、3和5天，尾静脉给药。mtx组给药60μg mtx，dasa组给药60μg dasa，mtx+dasa组给药30μg mtx和30μg dasa。每日观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠的体重。第6天，co2安乐死小鼠，解剖取结肠，拍照记录长度。剪取约1cm长度的结肠，加入ripa强裂解液，匀浆后离心取上清。bca试剂盒测定蛋白质的浓度，elisa试剂盒测定上清中il-6的浓度。
39.1.9ha-tk-mtx/dasa的合成和表征
40.ha(0.2mmol)去离子水超声溶解，加入edc(0.4mmol)和nhs(0.4mmol)，室温搅拌1h活化羧基。然后加入tk-nh2(0.2～1mmol)，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h。反应结束后去离子水透析，冷冻干燥后得ha-tk。mtx(0.2mmol)、edc(0.4mmol)和nhs(0.4mmol)溶于dmso中，室温搅拌1h活化羧基。ha-tk(0.2～0.4mmol)溶于甲酰胺，然后加入羧基被活化的mtx，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h。反应结束后依次使用水、50％乙醇和dmso透析，冷冻干燥后得ha-tk-mtx。unmodified dasa(0.3mmol)、丁二酸酐(1.2mmol)和dmap(0.3mmol)溶解于dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h。反应结束后，油泵旋干反应液，乙腈复溶，使用semi-hplc(p0050，北京慧德易科技有限责任公司)进行分离(流动相：35％乙腈和65％水，检测波长：320nm)，得dasa。ha-tk-dasa的合成方法同ha-tk-mtx。氘代dmso溶解合成产物，1h nmr(unity inova 400m，美国瓦里安公司)进行表征。
41.1.10acd4m1-np的合成
42.anti-cd4与dspe-peg2000-nhs按照摩尔比1：0、1：5、1：10、1：25的比例加入至低蛋白吸附管，无菌pbs调节蛋白浓度为1mg/ml，按照每100μl的溶液体积加入10μl 1mol/l的nahco3调节ph值至8.5，四维旋转仪(be-1100，中国kylin-bell公司)室温反应12h。超滤后的产物dspe-peg2000-anti-cd4。
43.j774a.1巨噬细胞使用10ng/ml的lps和10ng/ml的ifn-γ培养24h，使其极化为m1
表型，使用细胞膜抽提试剂盒提取细胞膜，bca试剂盒测定蛋白浓度。按照1mg膜蛋白加入50μg dspe-peg2000-acd4，恒温振荡器(thz-103b，上海一恒科学仪器有限公司)300rpm、37℃反应30min，4℃、16000g离心10min，去除游离dspe-peg2000-acd4。按照细胞膜蛋白质量和纳米粒质量比为1:1加入ha-tk-mtx/cy5，通过脂质体挤出仪(lf-1，加拿大avestin公司)制备出粒径约200nm的纳米粒m1-np和acd4m1-np。
44.1.11acd4m1-np的cd4+t细胞和炎症靶向性
45.使用阴选分离试剂盒从小鼠脾脏中提取cd4
+
t细胞，然后加入制备好的m1-np和acd4m1-np，在37℃条件下孵育15min。结束后离心去除游离纳米粒，流式细胞仪(facs calibur ariaⅲ，美国bd公司)检测。
46.balb/c雌性小鼠足爪皮下注射50μg lps构建炎症模型。动物分为5组：
①
des-np组、
②
m0-np组、
③
m1-np组、
④
acd4m1-np组和
⑤
acd4 pre-depletion组，每组4～5只。第1天，acd4 pre-depletion组每只小鼠尾静脉注射20μg anti-cd4抗体，清除体内cd4
+
t细胞。第2天，小鼠尾静脉给药。12h后ivis成像仪(ivis lumina iii，美国caliper life sciences公司)检测造模部位的荧光强度(ex＝745nm，em＝800nm)。des为细胞膜蛋白破坏组，将细胞膜于600w强度下超声30min制备。m0为正常j774a.1细胞。
47.1.12表达anti-cd4蛋白的基因工程化细胞的构建
48.在pfucci质粒载体中插入目的基因序列，pfucci-cmv-anti-cd4-puro质粒由mcd8αleader、anti-mcd4 scfv片段(clone 2c 11)、mcd28 hinge+mcd28tm、p2a、thy1.1串联链接后构建到pfucci-cmv-puro载体中，得到anti-cd4 scfv-mcd28-p2a-thy1.1基因序列如seq id no：1：
49.gccaccatggctttgccagtgacagctcttctccttccactggccctcctccttcacgccgctaggccaatgaagtgcagctggatcatcctgttcctgatggccctgaccaccggcgtgaacagcgaggtgcagctgcagcaagacggcgccgagctgggcaagcctggcacaagcgtgaagctgagctgcaaggtgagcgactacaacattaggaggacctacatgcactgggtgaatcagaggcctggcaagggcctggagtggatcggaaggatcgaccctgccaacggcaacaccatctacggcgagaagttcaagagcaaggccaccctgaccgccgacacaagcagcaacaccgcctacatgcagctgagccaactgaagagcgacgacaccgccatttacttctgcgccatcggcgtgcagtacctggactactggggccaaggcgtcatggtcacagtgagctccggaggcggaggctccggcggaggcggctccggcggaggcggctccatggaaaccgataggctcctcctgtgggtcctgctcctgtgggtgcctgatagcaccggagacaccgtgctgacccaaagccctgccctggccgtgagccctggcgagagggtgaccatcagctgtagggccaccgagaggttcagcaccctgatccactggctgcagcagaggcccggacagcagcctaagctgctgatctacctgacaagccacctggacagcggcgtgcctgctaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcgaccctgtggaggccgacgacacagccacctactactgtcagcagacctggaacgacccttggaccttcggcggaggcaccaagctggagctgaagaggattgagttcatgtatcccccaccttacttggacaatgaaaggtctaatgggaccatcatacacattaaagagaaacacctgtgtcatactcagagttctccaaaattgttctgggccttggttgtcgttgccggcgtactgttctgttacggtctcttggttaccgtggcactttgtgttatctggactgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccctggccctatgaacccagccatcagcgtcgctctcctgctctcagtcttgcaggtgtcccgagggcagaaggtgaccagcctgacagcctgcctggtgaaccaaaaccttcgcctggactgccgccatgagaataacaccaaggataactccatccagcatgagttcagcctgacccgagagaagaggaagcacgtgctctcaggcacccttgggatacccgagcacacgtaccgctcccgcgtcaccctctccaaccagccctatatcaaggtccttaccctagccaacttcaccac
dasa的剂量尾静脉给药。治疗期间，观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠的体重。第39天，测试小鼠运动能力和足爪抓握能力，在正式进行测试前，先进行适应性训练。适应性训练结束后，将小鼠放置在旋转笼(厂家定制)内，逐渐升高转速至70rpm，记录小鼠掉落时旋转笼的转速；再固定转速为25rpm，记录小鼠在笼内坚持的时间。
58.第40天，测量各组小鼠足爪厚度，取血测定血清中促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度。解剖取造模部位的滑膜组织，匀浆后ripa裂解液裂解，测定滑膜中促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度。小鼠安乐死，解剖取后足爪，micro-ct(skyscan 1176，德国bruker公司)拍摄分析。小鼠足爪多聚甲醛固定，使用石蜡包埋并进行切片，组织切片用苏木精-伊红(h&e)、番红o-固绿(sf)和马松三色(masson)进行染色。
59.1.16tacd4m1-np对uc小鼠的疗效评估
60.雄性c57bl/6小鼠自由饮用含有2.5％硫酸葡聚糖的水造模结肠炎。第0天，小鼠进行分组，共6组：
①
uc组、
②
healthy组、
③
free drug组、
④
m0-np组、
⑤
m1-np组和
⑥
tacd4m1-np组，每组6只。第1、3和5天，分别制备不同的细胞膜纳米粒，按照每只小鼠30μg mtx+30μg dasa的剂量尾静脉给药。每日观察小鼠的生存状况，记录各组小鼠的体重，并根据结肠炎的临床症状记录疾病活动指数(disease activity index,dai)。dia由体重减轻量(0分，《1％；1分，1～5％；2分，5～10％；3分，10～15％；4分，》15％)、便稀程度(0分，大便正常；2分，大便疏松；4分，水样腹泻)和便血程度(0分，正常；2分，轻微出血；4分，严重出血)三部分组成，每个部分独立评分，计算总分。第5天，小鼠灌胃fitc标记的葡聚糖，评价肠道组织的完整性。fitc-dextran(4kda)按照0.6mg/g体重进行灌胃，4h后异氟烷麻醉小鼠，眼眶后静脉丛取血，酶标仪(m1000 pro，瑞士tecan公司)测定荧光强度(ex＝480nm，em＝530nm)。第6天，取小鼠新鲜粪便，通过粪便隐血试剂盒检测小鼠便血程度。小鼠co2安乐死，解剖取结肠，拍照。
61.1.17对zia小鼠的疗效评估
62.雄性c57bl/6小鼠膝关节腔注射酵母聚糖a造模zia模型。第1天，小鼠膝关节红肿，进行分组，共6组：
①
zia组、
②
healthy组、
③
free drug组、
④
m0-np组、
⑤
m1-np组和
⑥
tacd4m1-np组，每组6只。第1、3和5天，分别制备不同的细胞膜纳米粒，按照每只小鼠37.5μg mtx+12.5μg dasa的剂量尾静脉给药。每日观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠的体重，游标卡尺测量膝关节长宽并计算周长。第6天，小鼠异氟烷麻醉后取血，测定血清中促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度。然后co2安乐死小鼠，解剖取造模部位的滑膜组织，测定滑膜中促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度。
63.1.18tacd4m1-np的安全性评价
64.兔子取血4ml，加入两倍体积的pbs，10000g、4℃离心5min，弃上清，用pbs重悬，重复洗5次，最后一次用pbs稀释至40ml。每200μl的红细胞溶液加入800μl的不同浓度的纳米粒溶液。加pbs的作为阴性组(negative)，加水的作为阳性组(postive)，每个样品平行三次。将样品在室温下静置4h后，10000g、4℃离心3min，拍照观察溶血程度。取上清液测定577nm处吸光度，655nm作为参照波长。按照公式2计算溶血率。
[0065][0066]
第0天，dba/1雄性小鼠进行分组，共2组：
①
healthy组和
②
tacd4m1-np组，每组6
只。第0、2和4天，按照每只小鼠30μg mtx+30μg dasa的剂量尾静脉给药。每日观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠的体重。第5天，取血进行血常规分析。小鼠安乐死，解剖取心、肝、脾、肺、肾，进行h&e切片染色分析。肝脏研磨后通过试剂盒检测alt和ast的活性。
[0067]
2实验结果
[0068]
2.1mtx和dasa对巨噬细胞或t细胞的体外抑制效果
[0069]
通过alamar blue测定mtx和dasa对巨噬细胞和cd4
+
t细胞的抑制作用。mtx是叶酸类似物，通过抑制二氢叶酸还原酶的活性影响四氢叶酸的合成，从而干扰dna的生物合成，临床上用于治疗类风湿性关节炎和癌症。dasa是酪氨酸激酶抑制剂，临床上用于治疗白血病和car-t治疗引起的细胞因子风暴。结果显示，mtx可显著抑制巨噬细胞raw264.7的活性，ic
50
为1.453μm，dasa对raw264.7的抑制活性较差(图2a)；dasa可显著抑制cd4
+
t细胞的活性，ic
50
为0.5708μm，而mtx对cd4
+
t细胞的ic
50
为11.283mm(图2b)。
[0070]
2.2mtx和dasa的联合给药对不同小鼠炎症模型的治疗效果
[0071]
胶原诱导的慢性关节炎模型(collagen induced arthritis，cia，常用的类风湿关节炎模型)：联合给药治疗cia小鼠的实验流程如图3a所示。经过五次治疗后，与cia组相比，三组治疗组均可不同程度的降低小鼠足爪肿胀度(图3b)。第42天，与ra组相比，联合给药组可显著降低ra指数，由cia组的13.6分降低至8.3分；mtx组和dasa组的ra指数较cia组相比虽然也有降低，但均无统计学差异(图3c)。体重曲线显示出了与ra指数相似的统计学差异，联合给药组与cia组相比体重显著提升，但mtx组和dasa组与cia组相比均无统计学差异(图3c)。血清炎症因子浓度结果显示，联合给药组与cia组相比，可显著降低il-6、il-1β和tnf-α的浓度，mtx组和dasa组与cia组相比虽然也可一定程度抑制促炎因子的浓度，但效果低于联合给药组(图3e至图3g)。其中，联合给药组降低血清il-6的疗效是mtx组的1.9倍，是dasa组的3.2倍(图3e)；降低血清il-1β的疗效是mtx组的1.4倍，是dasa组的8.6倍(图3f)；降低血清tnf-α的疗效是mtx组的2.2倍，是dasa组的3倍(图3g)。综上，mtx和dasa在治疗cia小鼠模型中显示出一定程度的协同效果。
[0072]
脂多糖(lps)诱导的急性炎症模型：联合给药治疗lps小鼠的实验流程如图4a所示。luminol和lucigenin可用于显示炎症程度，炎症强度与荧光强度成正比。经过两针治疗后，各给药组均可不同程度降低炎症程度。由足爪荧光图片可以看出，lps模型组足爪炎症程度最强，联合给药组可显著降低足爪部位的炎症(图4b)。联合给药组降低炎症的疗效是mtx组的3.5倍，是dasa组的1.9倍(图4c)。综上，mtx和dasa在治疗lps小鼠模型中显示出了一定程度的协同效果。
[0073]
酵母聚糖a诱导的急性关节炎模型(zymosan a induced arthritis，zia)：联合给药治疗zia小鼠的实验流程如图5a所示。经过三次治疗，五组给药组均可不同程度改善小鼠的症状，缓解膝关节肿胀程度，降低血清中的炎症因子水平，但对小鼠的体重均没有改善效果。其中联合给药组mtx+dasa(40μg+20μg)的治疗效果强于其它联合给药组和单药组，与zia组相比可显著降低膝关节肿胀程度和滑膜中促炎细胞因子的水平(图5b和图5d)。其中，mtx+dasa(40μg+20μg)组抑制滑膜il-6的效果是mtx组的1.5倍，是dasa组的2.7倍；抑制滑膜il-1β浓度的效果是mtx组的1.7倍，是dasa组的4.28倍；抑制滑膜tnf-α浓度的效果是mtx组的1.8倍，是dasa组的1.7倍(图5d)。综上，mtx和dasa在治疗zia小鼠模型中显示出一定程度的协同效果。
[0074]
葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎模型(ulcerative colitis，uc)：联合给药治疗uc小鼠的实验流程如图6a所示。经过3针治疗，各给药组均可显著提升小鼠的结肠长度，其中联合给药组效果最强，结肠长度由uc组的4.2cm延长至5.6cm(图6b和图6c)。各给药组均可降低结肠中炎症因子的水平，其中联合给药组降低结肠中il-6的疗效是mtx组的2.4倍，是dasa组的1.9倍，效果显著优于单药组(图6d)。联合给药组还可以显著改善小鼠体重降低的情况(图6e)。综上，mtx和dasa在治疗uc小鼠模型中显示出较好的协同效果。
[0075]
2.3ha-tk-mtx/dasa的合成和表征
[0076]
ha每一个重复双糖单位上含有一个游离羧基，ros敏感的tk链接剂两端带有氨基，因此可以采用edc和nhs为催化剂，通过酯化反应使ha与tk链接剂的末端氨基反应(图7a)。mtx含有游离羧基，因此可以与ha-tk-nh2反应，将mtx连接到聚合物载体上，制备成ros响应型药物(图7b)。由于ha亲水性较强，mtx亲脂性较强，因此在水中会形成内部mtx，外部ha的自组装纳米粒。可以利用同样的方法制备装载dasa的纳米粒，但由于原药dasa(unmodified dasa)没有游离羧基，仅有一个羟基，因此可将羟基修饰为羧基。具体方法为，以dmap和tea为催化剂，与丁二酸酐反应引入羧基(图7c)，然后制备ha-tk-dasa(图7d)。
[0077]
核磁图谱结果显示，1.3ppm为ha骨架上的n-乙酰基的甲基质子，1.5～2.5ppm为ha骨架中的亚甲基特征质子峰；1.6ppm为tk-nh2的甲基质子峰；ha连接tk后，核磁图谱出现了tk的甲基质子特征峰，证明tk成功连接至ha骨架(图8a)。7.0ppm和8.0ppm为mtx苯环上的质子峰，8.5ppm为两个羧基一侧的氨基质子峰；mtx与ha-tk反应后，产物出现了mtx的特征质子峰，证明成功连接(图8b)。dasa原药(unmodified dasa)羟基邻位的亚甲基质子峰为4.0ppm，丁二酸酐修饰后，由于羧基的吸电子效应，质子峰向低场位移，为4.4ppm，证明丁二酸酐成功连接至羟基(图8c)。7.25ppm为dasa苯环上的特征质子峰，8.5ppm为链接在苯环上的伯氨氢特征质子峰；dasa与ha-tk反应后，产物出现了dasa的特征质子峰，证明成功连接(图8d)。
[0078]
2.4acd4m1-np的制备和炎症靶向性
[0079]
使用lps和ifn-γ诱导m0型巨噬细胞极化为m1型，使用il-4和il-13极化为m2a型(图9a)。j774a.1细胞使用lps和ifn-γ诱导24h或48h后，m1型巨噬细胞特征蛋白cd86升高(图9b)。j774a.1细胞使用il-4和il-13诱导24h或48h后，m2a型巨噬细胞特征蛋白cd206的表达显著升高(图9c)。
[0080]
可搭载外周血cd4
+
t细胞的纳米粒设计如图9d。dspe-peg2000-nhs与anti-cd4(acd4)蛋白反应合成dspe-peg-acd4。将dspe-peg-acd4与细胞膜共孵育后，通过dspe将acd4蛋白锚定在细胞膜的磷脂双分子层上，然后将制备好的纳米粒与细胞膜共挤出，使细胞膜包载纳米粒，制备可搭载cd4
+
t细胞的细胞膜纳米粒acd4m1-np。流式结果表明，acd4m1-np可以通过表面的acd4靶向cd4
+
t细胞，96.3％的t细胞可被细胞膜纳米粒靶向结合，而没有acd4靶头蛋白的m1-np，与t细胞的结合明显较弱(图9e)。在lps诱导的急性炎症小鼠模型中，进行acd4m1-np的炎症靶向性实验(图9f)。结果显示，细胞膜纳米粒均可靶向至炎症部位，其中，m1-np的靶向效果强于des-np(细胞膜蛋白失活组)和m0-np。但acd4m1-np的效果最强，靶向性是m1-np的1.6倍，是m0-np的2.2倍，是des-np的2.9倍。对体内cd4
+
t细胞进行清除后，acd4m1-np的炎症部位富集显著降低，与m1-np组相当，证明acd4m1-np的高效炎症靶向性确实是因为搭载cd4
+
t细胞(图9g和图9h)。
[0081]
2.5tacd4m1-np的合成和表征
[0082]
通过dspe-peg-acd4插膜的方式使细胞膜表面表达acd4需重复制备，且插入效率低，acd4表达量低，更关键的是dspe-peg-nhs修饰需与acd4的活性氨基反应，可能会影响acd4的活性。因此，可通过基因工程的方式，使j774a.1细胞稳定表达acd4蛋白。首先设计目的基因，由mcd8αleader、anti-mcd4 scfv片段(clone 2c11)、mcd28 hinge、mcd28tm、p2a和标签蛋白thy1.1串联后构成，插入pfucci-cmv-puro载体中，采用三质粒系统构建慢病毒(图10a)。然后利用慢病毒感染j774a.1，构建稳定表达acd4蛋白的工程化细胞。流式细胞仪检测结果显示，细胞阳性率达68％(图10b)。有趣的是，经过病毒感染后，巨噬细胞极化为m1表型，且高表达炎症粘附的分子psgl-1和lfa-1(图10c-e)。
[0083]
提取该细胞的细胞膜，与载药纳米粒共挤出后制备得细胞膜包载得纳米粒tacd4m1-np。tem(扫描电镜)结果显示，ha纳米粒(np)显示呈球形，粒径约为140nm；tacd4m1-np显示出核壳结构的球形，粒径约为150nm(图11a)。细胞膜囊泡(tacd4m1)的水合粒径约为158nm，zeta电位为-22mv；ha纳米粒(np)的水合粒径约为165nm，zeta电位为-17mv；包膜纳米粒(tacd4m1-np)的水合粒径略微增大至178nm，zeta电位为-22mv，比np低且与细胞膜囊泡一致(图11b)。page结果显示，tacd4m1-np的膜蛋白与tacd4m1囊泡的膜蛋白种类一致，证明细胞膜成功包被纳米粒(图11c)。tacd4m1-np具有良好的ros响应型，在500μmh2o2的条件下，24h释放46.7％的mtx和34.6％的dasa，但在pbs种释放仅为7.9％。
[0084]
(图11d)。
[0085]
2.6tacd4m1-np的cd4+t细胞和炎症靶向性
[0086]
提取小鼠脾脏中的cd4
+
t细胞，与m0-np、m1-np和tacd4m1-np共孵育，共聚焦结果显示，m0-np和m1-np会有少量结合在细胞膜表面，而tacd4m1-np纳米粒(红色)可以明显结合t细胞，且与细胞膜(绿色)共定位，证明tacd4m1-np纳米粒可以依靠膜表面的anti-cd4蛋白与cd4
+
t细胞结合(图12a)。流式结果显示出相似的趋势，tacd4m1-np可以与cd4
+
t细胞显著结合，而m1-np仅有少量与细胞结合(图12b)。将cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞按照数量1:1混匀后，依次加入两种纳米粒，探究其靶向性(图12c)。流式散点图结果显示，m1-np会与cd8
+
t和cd4
+
t细胞进行非特异性结合，而tacd4m1-np会特异性靶向cd4
+
t细胞，结合率达99.9％(图12d)。流式直方图结果显示，tacd4m1-np与m1-np相比，可显著靶向cd4
+
t细胞，而对cd8
+
t细胞的靶向性很差，两种纳米粒没有差异(图12e)。因此，即使在有cd8
+
t细胞存在的情况下，tacd4m1-np也可以通过细胞膜表面的anti-cd4蛋白，精准靶向cd4
+
t细胞。
[0087]
uc模型小鼠的炎症结肠部位靶向性实验流程如图13a所示。结果显示，游离药物组(free drug)在结肠部位的蓄积很少，m0-np、m1-np和acd4 pre-depletion组在结肠部位均有一定靶向性；其中tacd4m1-np组的结肠靶向性最强，是m1-np组和acd4 pre-depletion组的2.4和1.8倍(图13b和图13c)。m1-np组和acd4pre-depletion组的靶部位荧光强度相似，说明清除了体内t细胞后，tacd4m1-np无法搭载cd4
+
t细胞，其靶向效果与无anti-cd4蛋白的m1-np组相似(图13c)。zia小鼠中的炎症关节部位靶向性实验流程如图13d所示。结果显示，tacd4m1-np组的靶向性最强，m1-np组和acd4 pre-depletion组靶向性相似；tacd4m1-np组的靶向性是m1-np组和acd4 pre-depletion组的1.8和1.6倍(图13e和图13f)
[0088]
2.7tacd4m1-np对cia小鼠的疗效评估
[0089]
tacd4m1-np治疗cia小鼠的实验流程如图14a所示。ra指数结果显示，三组细胞膜
纳米粒组(m0-np、m1-np和tacd4m1-np)与游离药物组(free drug)相比，均可显著降低ra指数，其中tacd4m1-np组疗效最佳，ra指数均在5分以下(图14b)。体重结果显示，各给药组相较于cia组，体重均有一定程度的提升，说明均起到一定的治疗作用；第40天，与cia组相比，free drug组小鼠体重虽然有一定程度上升，但无统计学差异，而m0-np、m1-np和tacd4m1-np组体重均显著上升，其中tacd4m1-np组体重的下降程度最轻(图14c)。小鼠足爪厚度结果显示，与cia组相比，free drug组抑制了22.5％的足爪增厚，m0-np组抑制了56.3％，m1-np组抑制了73.8％，tacd4m1-np组抑制了90.0％(图14d)。
[0090]
小鼠足爪肿胀时，其运动能力和抓握能力均会下降，为了更好的评估各组药物的治疗效果，对小鼠进行行为学能力的测定，即旋转笼实验(图14e)。当转速逐渐升高至70rpm时，与cia组相比，free drug组运动能力(足爪抓握能力)仅恢复11.9％，m0-np组恢复34.3％，m1-np组恢复55.7％，tacd4m1-np组恢复72.8％；tacd4m1-np组恢复小鼠运动能力的效果分别是free drug组、m0-np组和m1-np组的6.1、2.1和1.3倍(图14f)。当固定转速为25rpm时，tacd4m1-np组恢复小鼠运动能力的效果分别是free drug组、m0-np组和m1-np组的3.8、1.5和1.4倍(图14g)。
[0091]
通过elisa检测cia小鼠模型中踝关节滑膜和血清中的炎症细胞因子浓度。在滑膜中，与cia组相比，各给药组均可不同程度的降低促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度，其中tacd4m1-np组的效果最强(图14h)。同样的，在血清中，各给药组抑炎趋势与滑膜中类似，均可不同程度的降低促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度，其中tacd4m1-np组的效果最强(图14i)。tacd4m1-np组的抑制炎症因子的疗效是free drug组的11.4倍，m0-np组的2.1倍，m1-np组的1.4倍。
[0092]
由h&e切片染色图可以看出，cia组滑膜恶性增生，内衬细胞由于严重的炎症导致形态消失，基质细胞内浸润有大量的免疫细胞，形成的血管翳侵入关节腔，造成坏死，软骨表面出现侵蚀；healthy组滑膜形态正常，内衬细胞2～3层，无增厚现象，滑膜基质细胞无增生情况，无炎症细胞浸润；free drug组滑膜基质细胞大量增生，免疫细胞大量浸润出现炎症；m0-np组滑膜内衬细胞增厚，炎症细胞浸润整个滑膜；m1-np组滑膜内衬细胞3～4层，基质细胞部分增生；tacd4m1-np组内衬细胞2～3层，基质细胞无增生情况，滑膜中无炎症细胞浸润(图15a)。由sf切片图可以看出，cia组小鼠整个踝关节软骨着色不均匀，表面软骨退化严重；healthy组软骨形态、厚度均正常，呈现红色；free drug组和m0-np组踝关节软骨出现明显退化，厚度降低；m1-np组软骨结构正常，但整体厚度降低；tacd4m1-np组软骨结构、厚度均正常(图15b)。由masson切片图可以看出，cia组小鼠滑膜纤维化严重，呈现蓝色；healthy组滑膜结构正常，无纤维化；free drug组和m0-np组滑膜纤维化严重；m1-np组和tacd4m1-np组滑膜纤维化程度较轻(图15c)。因此，tacd4m1-np组可显著改善滑膜的病变结构，减少炎症细胞的浸润和滑膜基质细胞的增生，防止滑膜纤维化和软骨细胞的退化。
[0093]
由micro-ct成像图可以看出，cia组小鼠的所有关节均出现骨侵蚀现象，特别是踝关节和指关节，骨骼表面粗糙，部分实质骨缺失；healthy组足爪骨骼形态正常，表面光滑完整；free drug组和m0-np组指关节和踝关节骨骼侵蚀严重，指关节骨头部分缺失；m1-np组指关节和踝关节表面粗糙，但无骨头缺失的情况，骨侵蚀情况得到改善；tacd4m1-np组指关节和踝关节结构正常，骨表面光滑，仅有部分指关节表面粗糙(图15d)。
[0094]
2.8tacd4m1-np对uc小鼠的疗效评估
[0095]
tacd4m1-np治疗uc小鼠的实验流程如图16a所示。体重变化曲线显示，三组包膜纳米粒(m0-np、m1-np和tacd4m1-np)均显示出一定的抑制体重下降的能力，其中tacd4m1-np组疗效最强(图16b)。模型组小鼠第2天开始轻微腹泻和便血，第4天体重严重下降，第5天严重腹泻和便血；free drug组、m0-np组、m1-np组均出现不同程度的中度到重度腹泻、便血和体重下降的情况；tacd4m1-np组仅第3天出现轻微便血，严重便稀、便血和体重下降的现象均没有出现。病活动指数(disease activity index，dai)结果显示，uc组小鼠dia指数从第3天开始快速上升，第6天为11.3；free drug组显示出了与uc组相似的趋势；m0-np、m1-np和tacd4m1-np组均显示出一定的抑制效果，其中tacd4m1-np组效果最强，与free drug、m0-np、m1-np组相比，可显著抑制dia指数(图16c)。
[0096]
结肠上皮细胞受损严重时，会引起溃烂和出血，出现便血的症状。可通过检测粪便中的血液含量，判断结肠炎的严重程度。结果显示，healthy组小鼠粪便无显色反应，说明小鼠肠道健康正常，没有出现出血现象；uc组鼠粪便呈现黑褐色，说明小鼠肠道出血严重；free drug组粪便呈现较深的蓝绿色，说明小鼠肠道出现出血情况；m0-np组和m1-np组小鼠的粪便呈现蓝绿色，颜色比free drug组浅，说明出血程度得到缓解，但肠道依旧出现溃烂；tacd4m1-np组粪便呈现较浅的蓝绿色，说明肠道完整性得到最大程度的恢复，出血程度最弱(图16d)。
[0097]
结肠受损时，肠道完整性被破坏，通透性增强，因此可以通过灌胃fitc-dextran，检测血液中fitc-dextran的含量来判断结肠的损伤程度。小鼠灌胃fitc-dextran后，healthy组小鼠的血清几乎没有荧光；uc组的血清荧光强度显著上升，是healthy组的5.1倍，说明肠道损伤严重，上皮细胞完整性遭到破坏；free drug组的血清荧光强度与uc组相比虽有一定程度下降，但无显著性差异，说明游离药物恢复肠道完整性的能力较弱；三组包膜纳米粒(m0-np、m1-np、tacd4m1-np)均显示出一定的治疗效果，且荧光强度与free drug组相比，均显著下降，说明制备成纳米粒后，治疗效果显著提升；tacd4m1-np组的治疗效果最强，与m0-np和m1-np组相比，血清荧光强度显著降低(图16e)。
[0098]
结肠长度缩短是dss诱导uc模型的显著特征。healthy组结肠长度为7.7cm，uc组结肠长度显著降低，仅为4.2cm；经过药物治疗后，结肠长度均有一定程度的恢复；m0-np、m1-np、tacd4m1-np组结肠长度的恢复能力分别是free drug组的2.9、3.6和5.6倍(图16f和图16g)。
[0099]
2.9tacd4m1-np对zia小鼠的疗效评估
[0100]
tacd4m1-np治疗zia小鼠的实验流程如图17a所示。由小鼠膝关节肿胀曲线图可以看出，与zia组相比，m0-np、m1-np和tacd4m1-np组均可显著降低膝关节周长，其中acd4m1-np组膝关节肿胀程度最低(图17b)。体重变化曲线显示，m1-np组和tacd4m1-np组小鼠的体重均得到显著恢复，但tacd4m1-np组恢复小鼠体重的效果更强(图17c)。在滑膜中，与zia组相比，各给药组均可不同程度的降低炎症细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度，其中tacd4m1-np组的效果最强(图17d)。在血清中显示出了相似的趋势，各给药组均可不同程度的降低炎症细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的浓度，其中tacd4m1-np组的效果最强(图17e)。tacd4m1-np组降低促炎细胞因子的能力是free drug组的3.6倍，m0-np组的1.6倍，m1-np组的1.2倍。
[0101]
2.10tacd4m1-np的安全性评价
[0102]
通过溶血实验考察tacd4m1-np的安全性。pbs组无溶血现象，h2o组红细胞发生溶血，溶液由澄清变为红色，不同浓度的tacd4m1-np均无明显溶血现象，在1000μg/ml时的溶血率仅为2.4％(图18a)。
[0103]
进一步考察tacd4m1-np纳米粒的体内安全性，实验流程如图18b所示。dba/1小鼠注射三针tacd4m1-np纳米粒后，肝脏中的alt和ast活性与pbs组相比均无显著性差异，证明tacd4m1-np纳米粒无肝脏毒性(图18c)。血生化分析结果显示，注射tacd4m1-np纳米粒后，白细胞(white blood cells，wbc)、红细胞(red blood cells，rbc)、血小板(platelets，plt)的数量没有发生显著变化；淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞在白细胞中的占比也没有发生明显变化；血液中的血红蛋白(hemoglobin in the blood，hgb)浓度和平均红细胞血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin，mch)浓度均没有发生显著变化(图18d)。血生化结果证明tacd4m1-np不会影响血液中细胞的组成和红细胞的形态功能。器官切片结果显示，tacd4m1-np组心脏切片中肌纤维横纹清晰，无变性、坏死；肝脏切片中各组肝小叶结构完整、正常，肝细胞排列整齐，无变形、硬化；脾脏切片中各组脾小体和动脉周围淋巴鞘结构清晰，无变性；肺切片中各组肺泡疏松可见，无病变；肾切片中各组肾小管结构清晰，肾小囊无肥厚(图18e)。脏器切片显示tacd4m1-np良好的体内安全性。综上，tacd4m1-np安全性强，体内给药后没有出现明显毒性。
[0104]
3.总结
[0105]
本发明合成了可体内搭载cd4
+
t细胞、具有ros响应性的细胞膜纳米粒tacd4m1-np。该纳米粒能“搭车”cd4
+
t细胞，同时依靠细胞膜的同源靶向性，实现炎症部位的药物富集，提高靶部位的药物浓度，降低系统性毒副反应。同时我们通过遴选抑炎药物组合，选取对巨噬细胞活性抑制较强的药物甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)和原用于治疗白血病、对t细胞活性抑制较强的达沙替尼(dasatinib，dasa)，进行联合给药，结果显示该组合对酵母聚糖a诱导的关节炎(zymosan a induced arthritis，zia)、胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，cia)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)和lps诱导的急性炎症等模型均有协同治疗的效果，可增强抗炎效果，为炎症性疾病的治疗提供了新方法和新思路。

技术特征：
1.一种细胞膜纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：载药纳米粒制备：通过活性氧敏感的铜缩硫醇交联剂将mtx和dasa分别链接至透明质酸，合成ha-tk-mtx或ha-tk-dasa聚合物，所述聚合物在生理盐水中自组装成载药纳米粒；细胞膜制备：使用基因工程技术，构建细胞表面可稳定表达acd4单链抗体scfv的巨噬细胞株，感染流程将巨噬细胞极化为m1型，随后提取细胞膜，得到cd4靶向的细胞膜；细胞膜纳米粒制备：将细胞膜和载药纳米粒共挤出，制得细胞膜纳米粒。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，细胞膜制备的具体方法步骤如下：设计目的基因，由mcd8αleader、anti-mcd4 scfv片段clone 2c11、mcd28 hinge、mcd28tm、p2a和标签蛋白thy1.1串联后构成，基因序列如seq id no：1，插入质粒载体中，构建病毒，然后利用病毒感染j774a.1细胞，构建稳定表达acd4蛋白的工程化细胞。3.一种细胞膜纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：载药纳米粒制备：通过活性氧敏感的铜缩硫醇交联剂将mtx和dasa分别链接至透明质酸，合成ha-tk-mtx或ha-tk-dasa聚合物，所述聚合物在生理盐水中自组装成载药纳米粒；细胞膜制备：将巨噬细胞极化为m1型，提取细胞膜，然后用nhs功能化的dsep-peg与cd4单克隆抗体反应得dspe-peg-acd4，并将dspe-peg-acd4插入m1型细胞膜中，得到cd4靶向的细胞膜；细胞膜纳米粒制备：将细胞膜和载药纳米粒共挤出，制得细胞膜纳米粒。4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，ha-tk-mtx的合成方法步骤如下：ha去离子水超声溶解，加入edc和nhs，室温搅拌1h活化羧基；加入tk-nh2，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，去离子水透析，冷冻干燥后得ha-tk；mtx、edc和nhs溶于dmso中，室温搅拌1h活化羧基；ha-tk溶于甲酰胺，然后加入羧基被活化的mtx，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后依次使用水、50％乙醇和dmso透析，冷冻干燥后得ha-tk-mtx。5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，ha-tk-dasa的合成方法步骤如下：unmodified dasa、丁二酸酐和dmap溶解于dmf中，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，油泵旋干反应液，乙腈复溶，使用semi-hplc进行分离，条件为流动相：35％乙腈和65％水，检测波长：320nm，得dasa；ha去离子水超声溶解，加入edc和nhs，室温搅拌1h活化羧基；加入tk-nh2，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，去离子水透析，冷冻干燥后得ha-tk；dasa、edc和nhs溶于dmso中，室温搅拌1h活化羧基；ha-tk溶于甲酰胺，然后加入羧基被活化的dasa，避光、氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后依次使用水、50％乙醇和dmso透析，冷冻干燥后得ha-tk-dasa。6.一种根据权利要求1-5任一项所述的细胞膜纳米粒的制备方法制备得到的细胞膜纳米粒tacd4m1-np。7.一种根据权利要求6所述的细胞膜纳米粒用于制备治疗炎症性疾病药物中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的炎症性疾病包括类风湿关节炎、溃疡性肠炎。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述细胞膜纳米粒可体内搭载cd4
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t细胞渗透至炎症部位，ros响应性释放药物，显著降低血清和炎症部位促炎细胞因子的水平。10.一种治疗炎症性疾病的药物组合物，其特征在于，其包含甲氨蝶呤和达沙替尼，其中，甲氨蝶呤和达沙替尼的重量比为1:(0.5～2)。

技术总结
本发明公开了一种细胞膜纳米粒及其制备方法与用途。本发明合成了可体内搭载CD4


技术研发人员：郑毅然 赵磊
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/16