用于细胞超快荧光成像的碳点、其制备方法及应用

1.本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种用于细胞超快荧光成像的碳点、其制备方法及应用。


背景技术：

2.生物成像技术是研究生物系统结构和功能的重要工具。它通过成像技术对生物样本进行非侵入性或微创伤方式的三维成像，从而获得有用的信息。荧光成像是一种常用的光学成像技术，它利用荧光染料或荧光蛋白标记靶分子，并在激发光的作用下发射荧光信号，从而实现对生物样本的成像。与其他成像技术相比，荧光成像具有高分辨率、非侵入性、信号增强和实时成像等优点。其中，高分辨率是荧光成像技术最为突出的优势之一。它可以用于研究细胞和分子水平的生物过程，并且可以在单个细胞和亚细胞水平进行成像。
3.虽然荧光成像具有许多优点，但其速度缓慢是该技术面临的主要问题之一。由于成像速度缓慢，荧光成像可能会失去动态过程的关键信息，例如动态细胞行为或快速信号传递事件。此外，成像噪声也会增加，因为慢速成像会导致对环境因素的更多敏感性。还需要考虑生物样本对荧光激发的暴露时间，因为长时间的激发会导致样本的细胞损伤和荧光褪淬灭。为了解决这些问题，新的荧光成像技术正被努力开发，以提高速度和对活体样本的适应性，如光学切片成像、多光子荧光显微镜和时间分辨荧光成像等。
4.碳点是一种新型的荧光纳米材料，具有许多优点，特别是在荧光成像领域中。首先，碳点具有良好的荧光性能，能够发出强烈的荧光信号，使其成为生物成像领域中的理想荧光探针。其次，碳点具有良好的生物相容性和低毒性，能够在生物体内进行实时成像，无需担心对生物体产生不良影响。此外，碳点可以通过表面修饰实现对其荧光特性的调节和改善，从而实现更精确的成像。所以，将碳点应用于荧光成像以解决上述问题将具有较好的前景，但现在未见公开可靠的方案。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于细胞超快荧光成像的碳点、其制备方法及应用。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、将1,5-二氨基萘溶解于溶剂中，然后加入酸溶液，搅拌；
8.s2、在步骤s1得到的溶液中再加入溶剂，搅拌；
9.s3、将步骤s2得到的混合物转移至反应釜中，进行水热反应；
10.s4、反应结束后向产物中滴加碱液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液，之后采用柱色谱法对产品溶液进行纯化、分离，最后干燥，得到碳点。
11.优选的是，所述溶剂为无水乙醇，所述酸溶液为盐酸溶液，所述碱液为氢氧化钠溶液。
12.优选的是，所述步骤s1具体为：称取0.22-0.88g 1,5-二氨基萘，溶解于5-20ml无水乙醇中，再加入1-4ml浓度为35wt％的盐酸溶液，常温下搅拌过夜。
13.优选的是，所述步骤s2具体为：在步骤s1得到的溶液中再加入10-40ml无水乙醇，搅拌0.5-2h。
14.优选的是，所述步骤s3具体为：将步骤s2得到的混合物转移至特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，200-280℃下水热反应4-16h。
15.优选的是，所述步骤s4具体为：反应结束后向产物中滴加氢氧化钠溶液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液；之后将产品溶液经过旋蒸后加入硅胶，最后加入硅胶柱中，以二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱液进行洗脱，收集的样品旋转蒸发，得到碳点。
16.优选的是，所述步骤s4中，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1～15:1。
17.优选的是，所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，包括以下步骤：
18.s1、称取0.44g 1,5-二氨基萘，溶解于10ml无水乙醇中，再加入2ml浓度为35wt％的盐酸溶液，常温下搅拌过夜；
19.s2、在步骤s1得到的溶液中再加入20ml无水乙醇，搅拌1h；
20.s3、将步骤s2得到的混合物转移至特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，240℃下水热反应8h。
21.s4、反应结束后向产物中滴加氢氧化钠溶液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液；之后将产品溶液加入硅胶柱中，以二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1的混合液作为洗脱液进行洗脱，收集的样品旋转蒸发，得到碳点。
22.本发明的第二方面，提供一种用于细胞超快荧光成像的碳点，其特征在于，其通过如上所述的方法制备得到。
23.本发明的第三方面，提供一种如上所述的方法制备的碳点在细胞超快荧光成像中的应用。
24.本发明的有益效果是：
25.本发明以nad为前驱体合成了一种能作为生物荧光成像探针的高亮荧光碳点，碳点的绝对量子效率高达32.07％，并表现出良好的激发不依赖特性，低浓度时即可在细胞中发出明亮的黄色荧光；
26.本发明的碳点可特异性地靶向细胞内的溶酶体，与商业染料复染分析可得共定位系数高达90％；且该碳点还具有超快免洗成像的能力，5s即可进入细胞，一分钟便达到稳定状态，无需清洗即刻成像；其能够很好的用于细胞的超快荧光成像。
附图说明
27.图1为实施例1制备的碳点的透射电镜(tem)照片；
28.图2为实施例1制备的碳点的dls粒径分析图；
29.图3为实施例1制备的碳点的荧光光谱图；
30.图4为实施例1制备的碳点的红外图谱；
31.图5为实施例1制备的碳点的温度稳定性测试结果；
32.图6为实施例1制备的碳点的细胞毒性测试结果；
33.图7为实施例1制备的碳点的荧光共定位分析结果；
34.图8为实施例1制备的碳点在hela细胞中的超快成像效果。
具体实施方式
35.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
36.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
37.下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
38.实施例1
39.一种用于细胞超快荧光成像的碳点，其制备方法包括以下步骤：
40.s1、称取0.44g 1,5-二氨基萘(nda)，溶解于10ml无水乙醇中，再加入2ml浓度为35wt％的盐酸溶液，常温下搅拌过夜；
41.s2、在步骤s1得到的溶液中再加入20ml无水乙醇，搅拌1h；
42.s3、将步骤s2得到的混合物转移至特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，240℃下水热反应8h。
43.s4、反应结束后向产物中滴加浓度为2.5％的氢氧化钠溶液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液；之后将产品溶液加入硅胶柱中，以二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1的混合液作为洗脱液进行洗脱，得到亮黄色的透明液体，收集后旋转蒸发，得到碳点。溶解在乙醇或dmso溶液中进行后续实验。
44.以下对实施例1制备的碳点进行性能检测与表征
45.参照图1，为实施例1制备的碳点的透射电镜(tem)照片，图2是碳点的dls粒径分析图。从图1中可以看出，该碳点呈球形，大小约为8nm。从图2中可以看出，碳点的粒径分布粒径在6.5nm，7.5nm，8.7nm，10.1nm以及11.7nm的占比分别为13.7％，36.4％，34.1％，13.6％和2.2％，与tem结果相符。
46.参照图3是碳点的荧光光谱图，从图中可以看出，碳点的最佳激发为470nm，最佳发射为550nm，为标准的黄色荧光。
47.参照图4，是碳点的红外图谱，分析透射峰强度可知，碳点表面富含羟基、氨基等基团。位于2967cm-1
的吸收峰是由于c-h键伸缩振动导致的。位于2868cm-1
的峰是属于c-oh的伸缩振动导致的。位于1665cm-1
的峰被认为是属于-c＝o键的伸缩振动。位于1521cm-1
的峰被认为是属于-no2键的伸缩振动。位于1379cm-1
的吸收峰是由于c-n-c基团伸缩振动导致的。丰富的基团很好的继承了前驱体的特性，并额外表现出良好的光学效果。
48.参照图5，是碳点的温度稳定性测试结果，可以看出在10-60摄氏度的范围下，碳点的荧光强度几乎不受影响。
49.参照图6，是碳点的细胞毒性测试结果，通过wst-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒对碳点的细胞毒性进行了评估(如图6所示)。在加入了40μgml-1
的碳点时，细胞的活力几乎没有受到任何影响，这证明了在这个浓度下的碳点是几乎没有任何毒性的。在加入了100
μg ml-1
的碳点后，细胞活力会些许下降但是仍在80％以上。证明了碳点的毒性较低，生物相容性好。
50.参照图7，是碳点的荧光共定位分析结果：(a)是用dapi孵育的hela细胞的clsm图像，(b)是用lyso-tracker
tm
深绿色孵育的hela细胞的clsm图像，(c)是与碳点一起孵育的hela细胞的clsm图像，(d)是合并了碳点、dapi和lyso-traccer
tm
的结果。其中，碳点的浓度为40μg/ml，比例尺为25μm。
51.将商业染料dapi,lysotracker
tm
deep green与碳点共同孵育以确定碳点的靶向部位。dapi会高亮显示出细胞核所在的位置，lysotracker
tm
deep green则以绿色荧光体现出溶酶体所在的区域。可以发现，碳点的黄色荧光与商业染料的绿色荧光高度重合，初步证明了其靶向溶酶体的猜想。图片的定性判断已经完成，进一步的，使用color2和jacop两个软件对共聚焦显微镜的图片结果进行共定位分析，计算可以定量地表示两个连续变量之间线性关系的接近度和方向的皮尔逊系数，以及表示两种荧光染料染色结果符合程度的重叠度系数。两个参数均是约接近于1表示共定位效果越好。最终得到pearson's r value为0.924，overlap coefficient为0.932。这充分证明碳点会在细胞中靶向溶酶体，扩展了其在生物成像领域的应用。综上，该碳点具有较强的靶核特性，扩宽了碳点在生物医学领域中的应用。
52.参照图8，是碳点在hela细胞中的超快成像效果：(a)不同时间碳点进入细胞的共聚焦荧光图像，(b)利用该软件分析得到的荧光亮度分布；其中，碳点的浓度为40μg/ml，比例尺为25μm。
53.如图8所示可以看出，5秒钟时，细胞周围有微弱的荧光，碳点刚刚加入正向四周扩散；而仅需15秒钟，碳点即可进入细胞并开始发出荧光；接着便不断继续进入细胞聚集在溶酶体上，通过软件分析可以看出荧光亮度稳步上升，证明碳点的浓度不断增高；在1分钟左右时，荧光亮度达到稳定，而后因仪器的强激发光，荧光缓慢淬灭，亮度微弱下降。值得注意的是，以上的快速成像过程均是实时拍摄的结果，是活细胞状态下的即时成像，没有经过反复多次的清洗。本发明的碳点能够为超快荧光成像领域提供强大的工具。
54.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

技术特征：
1.一种用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将1,5-二氨基萘溶解于溶剂中，然后加入酸溶液，搅拌；s2、在步骤s1得到的溶液中再加入溶剂，搅拌；s3、将步骤s2得到的混合物转移至反应釜中，进行水热反应；s4、反应结束后向产物中滴加碱液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液，之后采用柱色谱法对产品溶液进行纯化、分离，最后干燥，得到碳点。2.根据权利要求1所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇，所述酸溶液为盐酸溶液，所述碱液为氢氧化钠溶液。3.根据权利要求2所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：称取0.22-0.88g 1,5-二氨基萘，溶解于5-20ml无水乙醇中，再加入1-4ml浓度为35wt％的盐酸溶液，常温下搅拌过夜。4.根据权利要求2所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：在步骤s1得到的溶液中再加入10-40ml无水乙醇，搅拌0.5-2h。5.根据权利要求2所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：将步骤s2得到的混合物转移至特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，200-280℃下水热反应4-16h。6.根据权利要求2所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤s4具体为：反应结束后向产物中滴加氢氧化钠溶液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液；之后将产品溶液经过旋蒸后加入硅胶，最后加入硅胶柱中，以二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱液进行洗脱，收集的样品旋转蒸发，得到碳点。7.根据权利要求6所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1～15:1。8.根据权利要求7所述的用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、称取0.44g 1,5-二氨基萘，溶解于10ml无水乙醇中，再加入2ml浓度为35wt％的盐酸溶液，常温下搅拌过夜；s2、在步骤s1得到的溶液中再加入20ml无水乙醇，搅拌1h；s3、将步骤s2得到的混合物转移至特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，240℃下水热反应8h。s4、反应结束后向产物中滴加氢氧化钠溶液，调节溶液的ph到中性，得到产品溶液；之后将产品溶液加入硅胶柱中，以二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1的混合液作为洗脱液进行洗脱，收集的样品旋转蒸发，得到碳点。9.一种用于细胞超快荧光成像的碳点，其特征在于，其通过如权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到。10.一种如权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的碳点在细胞超快荧光成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于细胞超快荧光成像的碳点的制备方法，该方法包括以下步骤：S1、将1,5-二氨基萘溶解于溶剂中，然后加入酸溶液，搅拌；S2、再加入溶剂，搅拌；S3、得到的混合物转移至反应釜中进行水热反应；S4、反应结束后向产物中滴加碱液，调节溶液的pH到中性，之后采用柱色谱法进行纯化、分离，最后干燥，得到碳点。本发明以NAD为前驱体合成了一种能作为生物荧光成像探针的高亮荧光碳点，其可特异性地靶向细胞内的溶酶体，与商业染料复染分析可得共定位系数高达90％；且该碳点还具有超快免洗成像的能力，5s即可进入细胞，一分钟便达到稳定状态，无需清洗即刻成像；其能够很好的用于细胞的超快荧光成像。细胞的超快荧光成像。细胞的超快荧光成像。


技术研发人员：李力 朱彤彤 董文飞 梅茜 葛明锋 常智敏
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/16