一种基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片及其应用

1.本发明涉及遗传学、分子生物学、生物信息学和棉花分子育种领域，尤其涉及一种基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片及其应用。


背景技术：

2.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)指基因组单个核苷酸的变异，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性作为第三代遗传标记，snp数量众多、分布密集、易于检测，是较理想的基因分型目标。纵观分子标记技术的革新，以dna序列变异为基础的单核苷酸多态性(snp)，已经接近在分子水平进行变异检测的终极标准。预期今后若干年分子检测技术和平台的发展大致是在此基础上进行提升和改进。因此，高效、低成本的snp基因型检测技术成为发展共享技术和平台的最佳选择。
3.基于snp的靶向测序基因型检测(genotyping by target sequencing，gbts)技术就是要从基因组dna中挑选特定的靶向位点，进行测序和基因型检测。这种靶向或固定的简化基因组测序大大减少了dna测序量，简化了生物信息分析和数据处理，提高了对各种基因型检测平台的适应性。且该技术适合所有标记位点的检测，包括功能已知位点(如已克隆的基因)、功能未知位点(候选基因)以及中性位点。其系统标记数量的可塑性为各种应用提供了巨大弹性空间，基本上适合需要不同标记数量的全部场景，如标记辅助的主基因选择、回交育种及其背景选择、多基因聚合育种、种子纯度检测、转基因成份鉴定等。因此gbts将成为未来很长一段时间基因型检测的首选。
4.已开发的棉花snp芯片如illumina 80k，zju40k等已经被育种企业和科研单位广泛采用，应用于基因分型、基因组选择、种质资源遗传多样性分析等。这些芯片snp密度普遍较高，其中illumina 80k固相芯片还存在无法定制的缺点；芯片位点设计普遍以全基因组均匀分布的位点为基础，没有考虑与性状的关联，因而分型成本较高且选择的目的性不强。传统育种周期较长，表型变异不可预见，主要靠育种家的经验筛选。在对育种目标性状进行改良时容易造成其他优异性状的丢失。分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，检测目的基因和位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点，其关键的限制因素是与性状关联的位点的准确鉴定。
5.综上，基于陆地棉基因组测序和全基因组关联分析挖掘的陆地棉纤维品质、产量、抗病性等重要农艺性状显著关联的位点，以及常见植物转基因检测位点，部分背景位点，开发一款用于陆地棉基因分型、转基因检测、种质资源评价和分子标记辅助选择等的低密度液相snp芯片迫在眉睫。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，发现及筛选出894个snp位点，利用陆地
identify signatures of selection and loci associated with fiber quality and yield traits.nature genetics,2017,49(7):1089；liu等.association mapping of seed oil and protein contents in upland cotton.euphytica,2015,205(2):637-645；li等，genomic insights into the genetic basis of cotton breeding in china，molecular plant 16,662
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677)，选择与农艺性状及抗病性显著关联的634个snp位点(前景位点)。
20.3.以上共获得陆地棉基因组目标区段共1235个，通过检测备选snp位置和位点基因型是否与陆地棉参考基因组tm-1v2.1(cotton.zju.edu.cn)一致，筛选后获得1148个候选目标区段。
21.4.根据1148个候选目标区段，进行探针设计，设计原则具体为：挑选出可覆盖区域的所有长度为100-120bp的探针；计算可覆盖目标区域探针的gc含量；计算探针的同源性区域个数。其中，a.40bp以上完全相同；b.相似度85％，长度80bp；c.相似度95％，长度70bp三种情况均视为一个同源性区域。探针挑选原则：选取探针gc含量在30％～70％之间的；选取同源性区域个数≤5的；选取探针区域不包含ssr、n区域的。根据以上这些设计及挑选原则，共设计挑选出1795个探针，能检测894个目标区段，894个目标区段对应的核心snp位点信息如表1所示，snp标记染色体分布统计如图1所示，分布如图2所示。
22.5.根据公布的棉花转基因检测14个常见检测序列，设计出14条检测探针，本实施例中提供的14条检测探针如seq id no.1～seq id no.14所示，按顺序分别检测a1bt、a2cpti、a3cp4-epsps、a4cp4-epsps、a5bar、a6pat、a7cdp450、a8cp4-epsps、b.1camv35s、b.2fmv35s、b.3nos、b.4nos、b.5camv35s和nptii基因；该引物对组合的扩增产物可以进行一次高通量测序和分析即可完成样本中转基因成分的检测。其中，检测a3cp4-epsps基因和b.4nos基因的探针(seq id no.3、seq id no.12)如表所示；其中，i是次黄嘌呤。
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6.将检测894个snp位点以及14种主要转基因的探针组成基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片；其中与陆地棉纤维品质、产量、抗病性等重要农艺性状显著关联的位点329个，常见植物转基因检测位点14个，其他位点565个。
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本实施例中通过博瑞迪生物技术有限公司合成捕获探针构建芯片，该芯片基于液相探针杂交的靶向基因型检测(gbts)技术：genobaits。genobaits工作原理是基于目标探针与靶向序列互补结合进行定点捕获。首先对要测试的材料进行gdna文库构建。同时根据dna互补原理，在每个待测位点设计覆盖目标snp的探针，采用生物素(biotin)标记对目标探针进行标记。然后，在液态中利用生物素标记的目标探针与基因组目标区域杂交形成双链。随后利用链霉亲和素包衣的磁珠对携有生物素标记的目标探针进行分子吸附，从而捕
获与探针杂交的靶点。最后，对捕获的靶点序列进行洗脱、靶点扩增、建库和测序，最终获得目标snp的基因型。
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表1 894个核心snp位点信息
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其中，ref表示snp位点在参考基因组中的碱基类型，alt表示snp位点在群体中的碱基类型。
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实施例2、基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片在陆地棉基因分型以及转基因成分检测中的应用。
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使用200个陆地棉品种对芯片进行测试。测试结果显示，棉花功能标记芯片的平均位点检出率为94.17％，满足陆地棉基因分型检测。
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整个实验流程是基于genobaits技术体系完成的。具体实验流程如下：
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1.提取待测样本的基因组dna，并构建样品文库；
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1.1样品dna提取
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采用ctab法对样本dna进行提取。
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1.2样品dna质检
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将测试样品dna，用qubit fluorometric quantitation(thermo fisher)对dna浓度进行测定，用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。检测合格的样品放入4℃冰箱，保存、备用。
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1.3样品dna片段化
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取12μl质检合格的dna放置于0.2μl pcr管中，将管置于超声波破碎仪中对dna进行随机物理破碎，片段破碎至200-400bp。
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1.4样品末端修复
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向管中加入4μl genobaits end repair buffer(genobaits，即石家庄博瑞迪生物科技有限公司)和2.7μl genobaits end repair enzyme，补水至20μl，放入abi 9700pcr仪中37℃温育20分钟，完成破碎片段的末端修复和加a过程。
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1.5样品测序接头连接
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从pcr仪中取出小管加入2μl genobaits ultra dna ligase、8μl genobaits ultra dna ligase buffer和2μl genobaits adapter，补水至40μl，然后放置于abi9700 pcr仪上22℃反应30分钟，完成测序接头的连接。
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1.6样品dna纯化
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向连接产物中加入48μl的beackman ampure xp beads(beackman公司)对连接产物进行纯化，纯化后采用磁珠进行片段筛选，保留插入片段在200～300bp的连接产物。
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1.7样品文库扩增
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向上一步的pcr管中加入5μl带有barcode序列的测序接头、1μlp5接头、10μlgenobaits pcr master mix，并用纯水补至20μl；用abi 9700pcr仪进行扩增，扩增程序
为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复变性、退火、延伸，共8个循环；72℃延伸5min。不同的barcode用于区分不同的样品。
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1.8样品文库纯化
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向第二轮pcr产物中加入24μl beckmen ampure xp beads(beackman公司)，用移液器上下吸打均匀后，将0.2μl的pcr管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75vol％乙醇洗涤磁珠一次，用ph值为8.0的tris-hcl将文库dna洗脱下来。
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2.利用基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片测定目标样品在894个snp位点和14个基因的基因型
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2.1dna杂交
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取500ng已完成构建的基因组dna测序文库，加入5μl genobaits block i和2μlgenobaits block ii，置于eppendorf concentrator plus(eppendorf公司)真空浓缩仪上，在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μl genobaits 2
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hyb buffer、2.7μl genobaits hyb buffer enhancer、2.8μl nuclease-free water，用移液器吸打混匀后放置于abi 9700pcr仪上95℃温育10分钟，然后取出pcr管加入3μl已经合成的探针(探针的浓度为60ng/μl)，旋涡震荡混匀后放置于abi 9700pcr仪上65℃温育2小时，完成探针杂交反应。
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2.2dna捕获
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向上一步杂交完成的反应体系中加入100μl genobaits dna probe beads，上下吸打10次，放入abi 9700pcr仪上65℃温育45分钟，使磁珠与探针结合。用100μl genobaits wash buffer i、150μl genobaits wash bufferii分别对结合探针后的磁珠进行65℃热洗，然后再用100μl genobaits wash buffer i、150μl genobaits wash buffer ii(和150μl genobaits wash buffer iii分别对磁珠进行常温洗涤。洗涤完成的磁珠用20μl nuclease-free water进行重悬。
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取13μl重悬后的dna(带磁珠)加入到新的0.2ml pcr管中，然后加入15μl genobaits pcr master mix、2μl genobaits primer mix配置post-pcr体系，用abi 9700pcr仪进行文库扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复变性、退火、延伸，共15个循环；72℃延伸5min。
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向post-pcr产物中加入45μl beckmen ampure xp beads(beackman公司)并用移液器上下吸打均匀，然后将0.2ml pcr管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75vol％乙醇洗涤磁珠两次，用ph为8.0的tris-hcl将文库dna洗脱下来。完成探针的杂交捕获工作。
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2.3dna杂交捕获文库质检
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用qubit fluorometric quantitation(thermo fisher)对文库的dna浓度进行测定，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库dna的片段大小是否在300-400bp之间。
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2.4dna杂交捕获文库测序
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将构建好的dna文库用华大mgiseq2000测序仪进行测序。
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2.5基因型数据分析
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测序数据经过fastqc(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，用bwa(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上，用gatk(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行snp鉴定，用自编的perl脚本
对探针捕获测序的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型结果，如表2和表3所示。
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表2低密度液相基因芯片在200个棉花品种材料中检出率
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表3低密度液相基因芯片在200个棉花品种材料中转基因成分检出情况
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以上结果证实低密度snp液相芯片在200份陆地棉材料中的检出率为90.7％-96.5％，平均位点检出率为94％。在陆地棉品种中具有较高多态性，十分适合陆地棉种质资源评价、遗传改良以及转基因成分检测，检测准确性高。相比于已有的固相芯片和已开发的高密度液相芯片，可以以更低的成本开展棉花育种研究。
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显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片，其特征在于，所述陆地棉全基因组低密度snp芯片由检测894个snp位点以及14种主要转基因的探针组成；所述14种主要转基因具体为：a1bt、a2cpti、a3cp4-epsps、a4cp4-epsps、a5bar、a6pat、a7cdp450、a8cp4-epsps、b.1camv35s、b.2fmv35s、b.3nos、b.4nos、b.5camv35s和nptii；所述894个snp位点如表1所示。2.根据权利要求1所述的基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片，其特征在于，所述检测14种主要转基因的探针如seq id no.1～seq id no.14所示。3.权利要求1或所述的基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片的应用，其特征在于，包括：陆地棉转基因成分检测及基因分型、陆地棉资源评价和亲缘鉴定、种子纯度鉴定以及陆地棉品种主要农艺性状遗传改良。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，主要农艺性状包括纤维品质性状、产量性状、抗病性。

技术总结
本发明公开了一种基于靶向捕获测序的陆地棉低密度液相芯片及其应用。本发明低密度芯片包括908个SNP位点，其中与陆地棉纤维品质、产量、抗病性等重要农艺性状显著关联的位点329个，常见植物转基因检测位点14个，其他位点565个。此芯片适合于陆地棉品种中转基因成分检测、资源评价和亲缘鉴定、种子纯度鉴定以及陆地棉品种主要农艺性状遗传改良中的应用。陆地棉品种主要农艺性状遗传改良中的应用。陆地棉品种主要农艺性状遗传改良中的应用。


技术研发人员：司占峰 胡艳 张天真 方磊 韩泽刚
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/16