一种醋酸及醋酸根含量的检测方法与流程

[0001][0002]
本发明涉及一种药物残留溶剂的检测方法，尤其涉及一种药物中醋酸及醋酸根残留量的高效液相色谱检测方法。


背景技术：

[0003][0004]
为保证药物在人体的安全性，ich制定的《q3c杂质：残留溶剂的指导原则》提出了药物残留溶剂在人体安全条件下的可接受量。该指导原则将药品生产和纯化过程中醋酸归为低毒性溶剂，该类溶剂对人体伤害很小，但该类溶剂中许多尚未进行长期毒性或致癌研究，所以在gmp或其他质量要求中需要进行含量限制。
[0005]
基于此，药品研发过程中需要对残留溶剂中的醋酸含量进行限定。药物合成过程中使用的醋酸可能以醋酸的形式残留，亦可能以醋酸根的形式残留，所以药品合成研发过程中需要对醋酸、醋酸根进行质量检测，以限制醋酸的含量水平。
[0006]
目前药物残留溶剂醋酸常用的检测方法为气相色谱法，例如中国专利文献cn 104297365 a公布的盐酸莫西沙星中残留溶剂醋酸的测定方法，即采用气相色谱法。然而，由于醋酸极性较强，沸点高，形成的气相色谱峰形较差，且醋酸易与dmso及dmf等气相溶剂反应，产生未知峰，不利于醋酸含量的准确测定。
[0007]
此外，气相色谱法适用于气体或易挥发的气体和固体的检测，无法对醋酸根进行检测，所以目前常用的醋酸根的检测方法是比色法。中国专利文献cn 115046950 a公布的检测药物中醋酸根的含量的方法为比色法：即建立吸光度-酸根离子浓度的标准曲线，获取待测样品的吸光度，根据标准曲线和待测样品的吸光度计算样品中酸根离子的含量。尽管比色法操作简单，但是其检测准确性极低，因为比色法以生成有色化合物的显色为基础，针对性强，使用条件较为严格，易被其他组分干扰，且易受光线，环境等影响。
[0008]
因此，开发一种快速、通用性较强的醋酸及醋酸根检测方法，在药物的质量控制方面有很重要的意义。


技术实现要素：

[0009][0010]
本发明目的是建立一种可以准确检测药物中醋酸及醋酸根残留量的高效液相色谱法，弥补现有技术的不足。
[0011]
为达到目的，本发明的技术方案如下：
[0012]
一方面，本发明提供一种检测药物中醋酸及醋酸根含量的方法，所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，以磷酸二氢钠水溶液和乙腈作为流动相a和/或流动相b，按照等度洗脱或者梯度洗脱。
[0013]
在一些实施方案中，药物为拉克酰胺。
[0014]
在另一些实施方案中，磷酸二氢钠水溶液摩尔浓度为0.01-0.05 m。
[0015]
优选地，所述磷酸二氢钠水溶液的摩尔浓度为0.02 m。
[0016]
在一些实施方案中，采用的色谱柱为耐纯水相色谱柱。
[0017]
进一步地，耐纯水相色谱柱为waters atlantis
®ꢀ
t3，其规格为150 mm
×
4.6 mm
×5ꢀµ
m。
[0018]
在一些实施方案中，色谱柱柱温为20~40℃。
[0019]
优选地，色谱柱柱温为25℃。
[0020]
在一些实施方案中，洗脱过程中按照梯度洗脱，洗脱梯度起始比例为95%~100%的a相，最终比例为50%~100%范围的b相；其中流动相比例是各流动相体积占洗脱液总体积的百分比，流动相a和b的体积比例总和为100%。
[0021]
在一些实施方案中，洗脱液的流速为0.5~1.5 ml/min；优选地，所述洗脱液流速为1.0 ml/min。
[0022]
在一些实施方案中，采用的高效液相色谱仪检测器紫外检测器。
[0023]
进一步地，检测波长为200 nm~280 nm。
[0024]
优选地，检测波长为210 nm。
[0025]
在一些实施方案中，包括以下步骤中的一种或多种：
[0026]
(a) 配制空白溶液、对照品溶液、供试品溶液（即药物溶液），其中：
[0027]
空白溶剂：即稀释溶剂，为纯水或者高比例水溶液；
[0028]
对照品溶液：取冰醋酸，用稀释溶剂溶解稀释至一定的浓度；
[0029]
供试品溶液：取供试品溶液，加稀释溶剂溶解稀释至一定的浓度；
[0030]
(b) 将所述的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液分别取10~100
ꢀµ
l注入高效液相色谱仪，按照下表梯度洗脱，记录色谱图；
[0031]
时间（分钟）流动相a（%）流动相b（%）010007100083070203070211000301000
[0032]
(c) 根据色谱峰峰面积计算供试品醋酸及醋酸根的含量，计算方法如下：
[0033][0034]
在一些实施方案中，对照品及供试品溶液的具体配制方法如下：
[0035]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇
匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
[0036]
供试品溶液：取拉克酰胺约250 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇10 min使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0037]
流动相a（即 磷酸二氢钠水溶液）：称取2.3996 g（
±ꢀ
0.24 g）磷酸二氢钠（如为二水合物按摩尔浓度不变折算称样量），置装有1000 ml水的试剂瓶中溶解，再加入1.0 ml磷酸，混匀，抽滤，超声，即得。
[0038]
本发明提供的药物残留溶剂醋酸及醋酸根的测定技术方案准确度高，专属性强，重现性好，可定性及定量检测出药物中醋酸及醋酸根，保证了药物的质量，从而提高了药物的安全性。
附图说明
[0039][0040]
图1为气相色谱法检测醋酸残留图谱
[0041]
图2为高效液相色谱检测醋酸及醋酸根含量测定空白溶液图谱
[0042]
图3为高效液相色谱检测醋酸及醋酸根含量测定供试品溶液图谱
[0043]
图4为高效液相色谱检测醋酸及醋酸根含量测定对照品溶液图谱
具体实施方式
[0044][0045]
下面通过实施例方式，对本发明涉及药物中醋酸及醋酸根含量测定方法进行详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
术语
[0047]
本发明所述的“药物”是用以预防、治疗及诊断疾病的物质，可以是天然化学物质及其形成的制剂，也可以是合成的化合物及其形成的制剂，亦可以是由生物工程形成的重组蛋白、抗体及其形成的制剂药物等。优选地，本发明一些实施例涉及合成的化合物及其形成的原料药和制剂。
[0048]
本发明所述的“醋酸根”是一种醋酸根离子，化学式ch3coo-，在药品溶液中可以游离的离子形态存在，亦可与其他物质形成醋酸盐，以醋酸盐的形式存在。
[0049]
本发明所述的“耐纯水相色谱柱”是指色谱柱对纯水或者高比例水溶液流动相具有耐受作用的色谱柱，包括但不限于aq系列，例如shimnex he c18-aq耐纯水色谱柱岛津ods碳十八高纯硅胶反相液相柱；ods系列，例如依利特sinochrom ods-bp色谱柱；rp系列，例如waters xterra rp-18液相色谱柱；t3色谱柱，例如waters atlantis
® t3等。
[0050]
本发明所述的“供试品”是指需要检测的目标药物。
[0051]
本发明所述的“供试品溶液”指需要检测的目标药物配制形成的溶液。
[0052]
发明人在探究药物中醋酸及醋酸根检测方法的过程中进行了大量的实验，发明人发现采用气相色谱法检测药物中醋酸的含量，色谱峰拖尾严重，峰形较差，不利于准确检测
药物中醋酸的含量。
[0053]
在此过程中，发明人意外发现，采用高效液相色谱法，以磷酸二氢钠水溶液和/或乙腈混合液为流动相，用反相色谱柱进行醋酸及醋酸根检测，可以快速、准确的检测药物中醋酸及醋酸根的含量。
[0054]
此外，发明人在实验过程中发现，采用的反相色谱柱为耐纯水相色谱柱时，该检测方法结果更稳定，色谱峰峰形好，结果更准确。
[0055]
在一些实施方案中，本发明检测的药物是酰胺类药物，包括但不限于拉克酰胺、拉考沙胺等。
[0056]
在一些实施方案中，本发明采用的磷酸二氢钠水溶液摩尔浓度为0.01 m，0.02 m，0.03 m，0.04 m，0.05 m；优选地，磷酸二氢钠水溶液摩尔浓度采用0.02 m。
[0057]
在一些实施方案中，本发明采用的耐纯水相色谱柱；优选地，色谱柱为waters atlantis
® t3，其规格为150 mm
×
4.6 mm
×5ꢀµ
m。
[0058]
在一些实施方案中，色谱柱柱温为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃；优选地，所述柱温为25℃。
[0059]
在一些实施方案中，洗脱过程中按照梯度洗脱，洗脱梯度起始比例为95%、96%、97%、98%、99%、100%的a相，最终比例为50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%范围的b相；其中流动相比例是各流动相体积占洗脱液总体积的百分比，流动相a和b的体积比例总和为100%。
[0060]
在一些实施方案中，洗脱液的流速为0.5 ml/min、0.6 ml/min、0.7 ml/min、0.8 ml/min、0.9 ml/min、1.0 ml/min、1.1 ml/min、1.2 ml/min、1.3 ml/min、1.4 ml/min、1.5 ml/min；优选地，所述洗脱液流速为1.0 ml/min。
[0061]
在一些实施方案中，采用的高效液相色谱仪检测器为紫外检测器。
[0062]
在一些实施方案中，检测波长为200 nm、210 nm、220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、260 nm、270 nm、280 nm；优选地，检测波长为210 nm。
[0063]
在一些实施方案中，包括以下步骤中的一种或多种：
[0064]
(a)配制空白溶液、对照品溶液、供试品溶液(药品溶液），其中：
[0065]
空白溶剂：即稀释溶剂，为纯水或者高比例水溶液；
[0066]
对照品溶液：取冰醋酸，用稀释溶剂溶解稀释至一定的浓度；
[0067]
供试品溶液：取供试品溶液，加稀释溶剂溶解稀释至一定的浓度；
[0068]
(b)将所述的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，注入体积可为10
ꢀµ
l、20
ꢀµ
l、30
ꢀµ
l、40
ꢀµ
l、50
ꢀµ
l、60
ꢀµ
l、70
ꢀµ
l、80
ꢀµ
l、90
ꢀµ
l、100
ꢀµ
l。按照表1梯度洗脱，记录色谱图；
[0069]
表1. 流动相梯度洗脱程序表
[0070]
时间（min）流动相a（%）流动相（b）010007100083070203070211000
301000
[0071]
(c)根据色谱峰峰面积计算供试品醋酸及醋酸根的含量，计算方法如下：
[0072][0073]
下面通过具体实施例对高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法学进行验证。实施例中的材料和试剂，除无特殊说明，均为普通市售。
[0074]
实施例1.气相色谱法检测醋酸残留
[0075]
色谱条件
[0076]
色谱柱：wonda cap wax（0.25 mm
×
30 m
×
0.25
ꢀµ
m）
[0077]
检测器温度：250℃
[0078]
进样口温度：220℃
[0079]
升温程序：起始柱温80℃，以10℃/min的速率升至200℃，维持5 min。
[0080]
流速：1.0 ml/min
[0081]
分流比：10:1
[0082]
进样量：1
ꢀµ
l
[0083]
空白溶剂：甲醇
[0084]
对照品溶液：称取冰醋酸约10 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0085]
量取上述溶液1
µ
l，注入气相色谱仪，记录色谱图，见图1。
[0086]
如图1所示，气相色谱法检测的结果冰醋酸出峰在3.969 min，拖尾因子为4.151，拖尾严重，峰形较差，所以对于醋酸含量的检测准确性低。
[0087]
实施例2.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-专属性
[0088]
色谱条件
[0089]
色谱柱：waters atlantis
® t3（150 mm
×
4.6 mm
×5ꢀµ
m）
[0090]
流速：1.0 ml/min
[0091]
柱温：25℃
[0092]
检测波长：210 nm
[0093]
进样量：100
ꢀµ
l
[0094]
流动相
[0095]
流动相a：0.02 m磷酸二氢钠水溶液
[0096]
称取2.3996 g（
±
0.24 g）磷酸二氢钠（如为二水合物按摩尔浓度不变折算称样量），置装有1000 ml水的1000 ml试剂瓶中溶解，再加入1.0 ml磷酸，混匀，抽滤，超声，即得。
[0097]
流动相b：乙腈
[0098]
溶剂：即稀释溶剂，为流动相a
[0099]
运行时间：30 min
[0100]
梯度洗脱如下表2：
[0101]
表2. 流动相梯度洗脱程序表
[0102]
时间（min）流动相a（%）流动相（b）010007100083070203070211000301000
[0103]
溶液配制
[0104]
空白溶剂：流动相a。
[0105]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制两份。
[0106]
供试品溶液：取拉克酰胺约250 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇10 min使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。同法配制两份。
[0107]
精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液各100
ꢀµ
l，分别注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件及流动相运行，记录色谱图。图谱详见图2至图4。
[0108]
结果：通过图2至图4可知，空白溶剂不干扰醋酸含量的测定；目标峰保留时间约为4.3分钟，出峰时间较适宜，峰形良好。
[0109]
实施例3.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-进样精密度
[0110]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按照实施例2的色谱条件，检测方法及运行方法运行，连续进样6针，记录色谱图，考察仪器的精密度。结果见下表3。
[0111]
表3. 专属性结果汇总表
[0112][0113]
结论：连续进样6针，峰面积的rsd为0.23%，仪器进样精密度良好。
[0114]
实施例4.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-溶液稳定性
[0115]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别于室温条件下放置0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h后量取100
ꢀµ
l，注入液相色谱仪，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，记录色谱图。结果见下表4。
[0116]
表4. 稳定性结果汇总表
[0117][0118]
结论：对照溶液室温放置24 h内，峰面积rsd为0.26%，稳定性良好。
[0119]
实施例5.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-灵敏度
[0120]
精密量取对照溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。取定量限溶液3 ml，置10 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。精密量取上述溶液各100
ꢀµ
l，注入液相色谱仪，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，记录色谱图。结果如下表5。
[0121]
表5. 灵敏度结果汇总表
[0122]
名称浓度（mg/ml）峰面积相当于供试品溶液s/n定量限溶液0.0012.580.01%19.25检测限溶液0.00030.810.003%6.14
[0123]
结论：定量限溶液浓度为0.001 mg/ml，相当于供试品溶液的0.01%，检测限溶液浓度为0.0003 mg/ml，相当于供试品溶液的0.003%，满足检测限要求。
[0124]
实施例6.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-线性
[0125]
精密量取对照品储备液适量分别配制成2%，10%，50%，80%，100%，120%的线性溶液。精密量取上述溶液各100
ꢀµ
l，注入液相色谱仪，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，记录色谱图。结果见表6。
[0126]
表6. 线性结果汇总表
[0127][0128]
结论：冰醋酸在1.0
ꢀµ
g/ml~60.043
µ
g/ml范围内线性关系良好。
[0129]
实施例7.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-重复性
[0130]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制两份。
[0131]
供试品溶液：取拉克酰胺约250 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇10 min使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。同法配制六份。
[0132]
精密量取对照溶液及供试品溶液各100
ꢀµ
l，注入液相色谱仪，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，记录色谱图。结果如下表7。
[0133]
表7：重复性结果汇总表
[0134][0135]
结论：重复测定6份样品，结果无明显差异，重复性良好。
[0136]
实施例8.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-回收率
[0137]
对照品溶液：取冰醋酸250 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液1 ml，置50 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制两份。
[0138]
供试品溶液：取拉克酰胺约250 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇10 min使溶解，分别加入对照储备液0.4 ml，0.5 ml，0.6 ml用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为80%，100%，120%供试品溶液。每个浓度平行配制三份。
[0139]
精密量取对照品溶液及供试品溶液各100
ꢀµ
l，注入液相色谱仪，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，记录色谱图。结果如下表8。
[0140]
表8：回收率结果汇总表
[0141][0142]
结论：该方法在80%~120%范围内，平均回收率为99.7%，rsd为0.39%，方法回收率良好。
[0143]
实施例9.高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法-耐用性
[0144]
量取重复性项下对照品溶液及供试品溶液分别在流速
ꢀ±
0.2 ml/min，波长
±
5 nm，有机相比例
ꢀ±
5%的条件下进样，按照实施例2的色谱条件及运行方法运行，结果如下表9。
[0145]
表9：耐用性结果汇总表
[0146]
检测条件含量（%）正常条件0.02流速0.8ml/min0.02流速1.2ml/min0.02
波长205nm0.02波长215nm0.02有机相比例650.02有机相比例750.02
[0147]
结论：色谱条件微小改变不影响冰醋酸含量检测。
[0148]
通过实施例2至实施例9可知，本发明的高效液相色谱法测定醋酸及醋酸根含量的方法专属性强，进样精密度良好，灵敏度高，稳定性良好，线性关系良好，回收率良好，重复性良好及耐用性强。所以本方法适用于药物中醋酸及醋酸根的含量检测。
[0149]
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
min使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；流动相a：称取2.3996 g磷酸二氢钠，置装有1000 ml水的试剂瓶中溶解，再加入1.0 ml磷酸，混匀，抽滤，超声，即得。

技术总结
本发明提供了一种药物中醋酸及醋酸根的高效液相色谱法检测方法，所述的方法包括：色谱柱为反向色谱柱，以磷酸二氢钠水溶液和乙腈作为流动相A和/或流动相B，进行梯度洗脱，该方法检测专属性良好，准确度高。准确度高。准确度高。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：北京凯莱天成医药科技有限公司
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/9/16