一种牛支原体菌株及其灭活疫苗和应用

1.本发明涉及生物制品领域，特别是一种牛支原体菌株及其灭活疫苗和应用。


背景技术：

2.牛支原体(mycoplasma bovis，m.bovis)是引起牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease，brds)的主要病原之一，主要引起牛肺炎、关节炎和乳腺炎等多种疾病。该病常与其他细菌混合感染，具有高发病率及死亡率。如今，肉牛集约化养殖一旦感染牛支原体后很难被清除，感染牛支原体后牛的免疫力和抵抗力明显下降，且极易感染其他病原体，牛支原体与其他细菌或病毒混合感染会加重病情，对养牛业造成更大的经济损失。
3.目前，牛支原体的预防及治疗面临以下困难：由于m.bovis不具有细胞壁，因此对多种抗生素不敏感且容易产生耐药性，临床治疗极为困难。随着国家限抗减抗政策的出台，支原体的疫苗研制对牛支原体的预防显得尤其重要。免疫预防是防制牛支原体病的重要手段之一，国内牛支原体疫苗正在研制之中，截止目前无商品化疫苗的生产。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种牛支原体菌株及其灭活疫苗和应用。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.本发明的第一个目的是要提供一种牛支原体菌株，该菌株为牛支原体(mycoplasmabovis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号为cgmcc no.25268，保藏日期为2023年5月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.本发明的第二个目的是要提供一种牛支原体菌株在制备预防牛支原体病药物中的应用。
8.本发明的第三个目的是要提供一种预防牛支原体病的疫苗，包含灭活的牛支原体菌株。
9.进一步地，所述预防牛支原体病的疫苗还包括终浓度为14％的montanide
tm gel 01佐剂。
10.本发明的第四个目的是要提供一种预防牛支原体病的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
11.s1、抗原的制备
12.将权利要求1所述的牛支原体菌株cc20091010接种于600ml pplo肉汤培养基,静置培养5d制备其种子液，菌液浓度为1x109ccu/ml，将种子液于4℃、16000rpm条件下无菌离心30min，用60ml无菌pbs溶液将沉淀物吹起混匀，用pbs溶液将该离心过程重复3遍，清洗菌体表面的培养基，最后用pbs溶液将菌体定容到60ml，按菌液总量的0.025％比例加入β-丙内酯，混匀后放置2～8℃搅拌灭活22h后，37℃下水解2h，制得牛支原体抗原液；
13.s2、灭活疫苗的配制
14.取上述制备的牛支原体抗原液，再加入终浓度为14％的montanide
tm gel 01水佐剂，并加入硫柳汞溶液，硫柳汞溶液的终浓度不超过0.01％，充分搅拌，冷却后4℃保存，即得预防牛支原体病的疫苗。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.1.本发明的牛支原体菌株cc20091010从病牛的肺脏组织中分离得到，对其灭活后制得预防牛支原体病的疫苗，该疫苗类型为灭活疫苗，安全性高，能较好保留菌株的免疫原性，便于运输保存。
17.2.本发明所述疫苗灭活剂为β-丙内酯(bpl)，具有无残留，作用于病原体dna或rna，不直接作用于蛋白，保持较好的免疫原性，灭活时间短缩短生产周期，提高经济效益。
18.3.本发明选用montanide
tm gel 01水相佐剂作为本产品佐剂，保护抗原，增强循环抗体的水平，产生高保护性免疫。
19.4.本发明的灭活疫苗在防治牛支原体病中的呈现较好的免疫原性，产生中和抗体效价峰值为1:2
14
，保护力为73.4％。
附图说明
20.图1为分离得到7株牛支原体菌株在培养基中培养3d后的颜色变化。
21.图2为牛支原体菌株的形态图。
22.图3为分离得到7株牛支原体菌株鉴定的pcr扩增的电泳图。
23.图4为普通级家兔对分离得到7株牛支原体菌株的灭活疫苗的免疫结果。
24.图5为注射cc20091010灭活疫苗后的c组家兔攻毒后的肺脏病变情况。
25.图6为d组家兔攻毒后的肺脏病变情况。
26.图7为f组家兔的肺脏病变情况。
27.图8为家兔牛支原体cc20120826感染肺脏病理切片结果。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
29.实施例1
30.牛支原体的分离纯化
31.在吉林省部分地区规模化养殖场病牛的肺脏组织中分离得到牛支原体cc20091010、cc20120826。在集约化肉牛养殖场无菌采集患牛呼吸系统疾病的肉牛肺脏，选取病变组织与健康组织的交界处组织约1g，将组织接种于pplo肉汤培养基中进行增菌，在37℃恒温箱中培养3d，颜色由红色变为黄色且澄清，将培养基上清用0.22μm滤膜过滤除菌，取过滤后的液体100μl加入到一个新的1mlpplo肉汤培养基中进行传代，继续在37℃恒温箱中培养3d，培养基的颜色由红色变为黄色且清亮透明(参见图1)，取最后一次出现颜色变化的液体100μl涂布于pplo琼脂培养基，在37℃恒温箱中培养5-7d，肉眼可见针尖大小透明菌落，在倒置显微镜下观察其菌落形态为m.bovis菌株，具有的“油煎蛋”样典型特征，边缘整齐，表面光滑，中间厚，边缘薄(参见图2)，挑取单菌落接种于液体培养基中，经过三次固液交替的克隆纯化菌种，进行保菌。将保存的菌液按照10％的比例接种pplo肉汤培养基中，连
续传代3次使其生长稳定，对其ccu(颜色变化单位)进行测定。
32.使用细菌dna快速抽提试剂盒提取菌种的m.bovis dna。采用牛支原体特异性引物oppd/f进行扩增目的基因，通过凝胶成像仪观察结果(参见图3)，之后进行16s rrna测序鉴定。
33.牛支原体cc20091010的16s rrna测序结果如下：
34.gggggggggcctatacgtggcatggttcgagcgatgatagcaatatcatagcggcgaatgggtgagtaaca
35.cgtactcaacgtaccttttagattgggatagcggatggaaacatccgataataccgaatacttattatttttgcatgaaagtaat
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41.gcgttaaattttggggctcaaccccaaaacgcgttggatactggcagactagagttatgtagaggttagcggaattccttgtg
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43.acgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgatcattagttgatggggaact
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45.cgcacaagcggtggagcatgtggtttaatttgatgttacgcgtagaaccttacccactcttgacatcttctgcaaagctatgg
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47.aacgagcgcaacccttatccttagttactaccatttagttgagcactctaaggagactgcccgagtaatcgggaggaaggt
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50.tagtaatcgtagatcagctacgctacggtgaatacgttctcgggtcttgtacacaccgcccgtcaaaccatgggagctggtaatgcccgaagtcggtttataaagaaactgctaagcagacttgg。
51.牛支原体cc20120826的16s rrna测序结果如下：
52.gccggggcgttgctatacatgcatgtcgagcgatgatagcaatatcatagcggcgaatgggtgagtaacacgt
53.actcaacgtaccttttagattgggatagcggatggaaacatccgataataccgaatacttattatttttgcatgaaagtaatata
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56.ggaatattccacaatggacgaaagtctgatggagcgacacagcgtgcaggatgaaggccctatgggttgtaaactgctgt
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59.gttaaattttggggctcaaccccaaaacgcgttggatactggcagactagagttatgtagaggttagcggaattccttgtgaa
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65.cgagcgcaacccttatccttagttactaccatttagttgagcactctaaggagactgcccgagtaatcgggaggaaggtgg
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68.gtaatcgtagatcagctacgctacggtgaatacgttctcgggtcttgtacacaccgcccgtcaaaccatgggagctggtaatgcccgaagtcggtttataaagaaactgctaagcagaacgg。
69.pcr反应体系为25μl包括10
×
taq缓冲液2.5μl，dntp(2.5mm)2.0μl，taq酶0.3μl，上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl，dna模板2μl，ddh2o 17.2μl；其中上、下游引物如表1所示。
70.表1
[0071][0072]
在pcr仪上进行扩增，94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，延伸2min，30个循环，终延伸72℃10min。取pcr产物5μl经1.0％琼脂糖凝胶电泳验证，经特异性引物pcr鉴定为牛支原体的分离株。牛支原体扩增产物大小应为1912bp。
[0073]
使用生化鉴定管进行发酵葡萄糖试验、水解精氨酸、水解甘露糖、分解丙酮酸钠试验、氯化三苯基四氮唑还原试验以及分解尿素试验，结果如表2所示。
[0074]
表2
[0075][0076][0077]
注：“+”表示阳性；“—”表示阴性
[0078]
实施例2
[0079]
灭活疫苗的制备
[0080]
1.抗原的制备
[0081]
将权利要求1所述的牛支原体菌株cc20091010接种于600ml pplo肉汤培养基,静置培养5d制备其种子液，菌液浓度为1x109ccu/ml，将种子液于4℃、16000rpm条件下无菌离心30min，用60ml无菌pbs溶液将沉淀物吹起混匀，用pbs溶液将该离心过程重复3遍，清洗菌体表面的培养基，最后用pbs溶液将菌体定容到60ml，按菌液总量的0.025％比例加入β-丙内酯，混匀后放置2～8℃搅拌灭活22h后，37℃下水解2h，制得牛支原体抗原液；
[0082]
2.灭活疫苗的配制
[0083]
取上述制备的牛支原体抗原液，再加入终浓度为14％的montanide
tm gel 01水佐剂，并加入硫柳汞溶液，硫柳汞溶液的终浓度不超过0.01％，充分搅拌，冷却后4℃保存，即得预防牛支原体病的疫苗。
[0084]
3.微生物检测
[0085]
对成品疫苗进行微生物检测，分别接种于bhi琼脂培养基和pplo琼脂培养基中，37℃培养箱培养4～5d，观察无杂菌生长。
[0086]
4.安全性检测
[0087]
用小鼠安检：用体重18～22gspf级昆明系小鼠5只，各皮下注射疫苗0.3ml。观察10
日，应全部健活。
[0088]
用家兔安检：用体重1.5～2.0kg家兔2只，各皮下注射疫苗5.0ml。观察10日，应全部健活。
[0089]
实施例3
[0090]
牛支原体抗体间接elisa检测方法的建立
[0091]
抗原为m.bovis p48蛋白，通过测定抗原与血清最佳稀释浓度、反应时间及阴性/阳性(p/n)血清临界值等指标开展试验，基本操作程序如下：
[0092]
(1)抗原包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释抗原包被在酶标板底部，100μl/孔，放置37℃培养箱2h后转移至2～8℃冰箱8h以上即可。
[0093]
(2)封闭：8h后将孔内液体弃去，使用pbst洗脱孔底杂质并拍干，所有样品孔加入1％bsa封闭液，200μl/孔，放置37℃培养箱1h。
[0094]
(3)添加一抗(待测血清与阳性血清)：待测血清各取150μl，加入载有150μl pbs溶液的2ml离心管内，横向从左至右依次做倍比混匀稀释。弃酶标板内液体，洗涤5次后拍干，每个样品取100μl加入酶标板内(每个稀释度做一个重复)，并设置阴性、阳性对照100μl/孔，放置37℃培养箱1h。
[0095]
(4)添加酶标二抗：弃孔内液体，洗涤5次后拍干，使用pbs以1：5000稀释hrp-羊抗兔igg，100μl/孔，放置37℃培养箱1h。
[0096]
(5)添加底物显色液：弃孔内液体，洗涤5次后拍干，加入显色液，100μl/孔，放置37℃培养箱避光孵育5～15min。
[0097]
(6)添加终止液：当阴性对照孔位未变色或呈淡黄色且阳性对照孔位变为橙色时，加入终止液，50μl/孔。
[0098]
结果判定：判定以p/n值为标准(被测血清孔位平均od值/阴性血清孔位平均值)。
[0099]
a)当阳性对照血清od
492
值≥0.5、阴性对照血清od
492
值≤0.2时，则试验条件成立。
[0100]
b)当p/n≥2.0时，判定为阳性，当p/n《2.0时，则判定为阴性。
[0101]
c)当p/n≥2.0时，最大稀释倍数的孔位数值为该血清抗体效价，即为1:2n。
[0102]
d)当阳性对照血清od
492
值≥0.5、阴性对照血清od
492
值≤0.2时，则试验条件成立。
[0103]
e)当p/n≥2.0时，判定为阳性，当p/n《2.0时，则判定为阴性。
[0104]
f)当p/n≥2.0时，最大稀释倍数的孔位数值为该血清抗体效价，即为1:2n。
[0105]
对牛支原体cc20091010灭活苗进行抗体水平的检测，结果参见图4，共两次免疫，每只家兔每次免疫注射1ml，首免与二次免疫间隔2周，二免后抗体水平显著提高，二免2周后(第28天)，免疫家兔血清抗体效价最高达1:2
14
。抗体水平检测共持续10周，抗体水平仍保持在1:2
10
以上。
[0106]
实施例4
[0107]
选用家兔对m.bovis cc200910株、cc20120826株两株菌进行比较，将牛支原体菌株cc20091010、cc20120826分别接种于600ml pplo肉汤培养基,静置培养5d制备其种子液，菌液浓度为1x109ccu/ml，将种子液于4℃、16000rpm条件下无菌离心30min，用60ml无菌pbs溶液将沉淀物吹起混匀，用pbs溶液将该离心过程重复3遍，清洗菌体表面的培养基，最后用pbs溶液将菌体定容到60ml，分别制得2种牛支原体攻毒菌液；采用气管注射的方式分别注入1
×
109ccu，通过肺脏病变面积相对应的分数评判毒力，分数越高病变程度越严重，即毒
力更强，评分结果如表3所示。
[0108]
表3
[0109][0110]
由表3可知，可通过平均分数直观比较出肺脏病面积，因此可说明cc20120826株毒力更强，并制备其病理切片可见严重的炎性细胞浸润及细胞组织病变，结果见图8，牛支原体(mycoplasma bovis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号为cgmcc no.25269，保藏日期为2023年5月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0111]
疫苗效力测定(用兔检验)
[0112]
1.免疫程序
[0113]
将19只家兔分为c组(支原体攻毒免疫)、d组(支原体攻毒对照)、f组(空白对照)，共3组，其中c、d组每组各8只家兔，f组为3只。第一次免疫对c组注射制备好的m.bovis灭活疫苗，疫苗注射前轻轻摇晃装载疫苗的青瓶，每只家兔注射1ml；一免后第2周以相同的剂量对c组进行第二次免疫。
[0114]
2.攻毒实验
[0115]
二免后第三周对所有家兔进行攻毒，c组、d组采用气管注射的方式注入1
×
109ccu的cc20120826株菌液，并连续攻毒3天；f组家兔通过后颈部皮下注射的方法每只注入1ml无菌pbs溶液作为空白对照；攻毒后两周分别对c组(支原体攻毒免疫)(参见图5)、d组(支原体攻毒对照)(参见图6)及f组(空白对照)(参见图7)进行剖检，试验周期为42天。
[0116]
3.免疫攻毒评价指标：
[0117]
3.1临床症状观察：每天观察家兔的精神状态、采食饮水和体重变化情况。
[0118]
3.2肺脏病变评分标准：兔子肺脏分别为左右尖叶、左右心叶、左右隔叶和中间叶共7部分，攻毒14天后对所有组未死亡家兔耳缘静脉注射空气处死，取出肺脏并观察肺脏病变情况。计算分数比较病变程度，总分为5.5分，评分依据表4。
[0119]
表4
[0120][0121]
4.免疫保护率的测定
[0122]
依据公式保护率＝(未免疫攻毒组肺脏病变分值-试验组肺脏分值/未免疫攻毒组肺脏分值)
×
100％，根据剖检结果如表5所示。
[0123]
表5
[0124][0125][0126]
由表5计算得疫苗组的保护率为73.4％。
[0127]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种牛支原体菌株，其特征在于：该菌株为牛支原体(mycoplasmabovis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号为cgmccno.25268，保藏日期为2023年5月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种如权利要求1所述的牛支原体菌株在制备预防牛支原体病药物中的应用。3.一种预防牛支原体病的疫苗，其特征在于，包含灭活的权利要求1所述的牛支原体菌株。4.根据权利要求3所述的预防牛支原体病的疫苗，其特征在于，还包括终浓度为14％的montanide
tm
gel01佐剂。5.一种预防牛支原体病的疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、抗原的制备将权利要求1所述的牛支原体菌株cc20091010接种于600mlpplo肉汤培养基,静置培养5d制备其种子液，菌液浓度为1x109ccu/ml，将种子液于4℃、16000rpm条件下无菌离心30min，用60ml无菌pbs溶液将沉淀物吹起混匀，用pbs溶液将该离心过程重复3遍，清洗菌体表面的培养基，最后用pbs溶液将菌体定容到60ml，按菌液总量的0.025％比例加入β-丙内酯，混匀后放置2～8℃搅拌灭活22h后，37℃下水解2h，制得牛支原体抗原液；s2、灭活疫苗的配制取上述制备的牛支原体抗原液，再加入终浓度为14％的montanide
tm
gel01水佐剂，并加入硫柳汞溶液，硫柳汞溶液的终浓度不超过0.01％，充分搅拌，冷却后4℃保存，即得预防牛支原体病的疫苗。

技术总结
本发明公开了一种牛支原体菌株及其灭活疫苗和应用，所述牛支原体(Mycoplasmabovis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号为CGMCCNo.25268，保藏日期为2023年5月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。对其灭活后制得预防牛支原体病的疫苗，该疫苗类型为灭活疫苗，安全性高，能较好保留菌株的免疫原性，便于运输保存；本发明所述疫苗灭活剂为β-丙内酯(BPL)，具有无残留，作用于病原体DNA或RNA，不直接作用于蛋白，保持较好的免疫原性，灭活时间短缩短生产周期，提高经济效益；本发明选用Montanide


技术研发人员：孔令聪 马红霞 张妍 李轩宇 张博 周航 战力源
受保护的技术使用者：吉林农业大学
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/9/16