一种用于检测KMT2A-PTD融合基因的试剂盒、其方法和应用与流程

一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用。


背景技术：

2.急性白血病(acute leukemia，al)是一类造血干细胞来源恶性克隆性血液系统疾病。临床上以贫血、出血、感染和髓外浸润为主要表现，病情进展迅速，死亡率高。kmt2a(histone-lysine n-methyltransferase 2a)基因定位于11号染色体长臂2区3带(11q23)，片段大小为92kb，至少包括36个外显子，是血液系统恶性疾病中常累及的基因之一。大多数发生kmt2a基因异常的急性白血病的预后较差。kmt2a的部分串联重复(partial tandem duplication，ptd)是kmt2a基因片段exon 3-9插入exon 9、10、11或12之后形成的一种kmt2a内部基因改变的异常现象，kmt2a和ptd发生融合形成kmt2a-ptd融合基因，该融合基因与临床不良结果相关，多数患者对常规化疗耐药，即使做异基因造血干细胞移植也容易复发，是一个独立的预后不良因素。
3.因此，亟需一种对kmt2a-ptd融合基因进行检测的产品。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术中对kmt2a-ptd融合基因检测灵敏度低、特异性不高的缺陷。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；
6.其中，所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.较佳地，所述引物对和探针溶于pcr反应液中，浓度分别为
8.较佳地，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述探针的3’端标记bhq1淬灭基团。
9.较佳地，所述试剂盒还包含参考基因扩增检测试剂组，其包括用于扩增参考基因的引物和探针，所述参考基因为abl1基因。
10.较佳地，所述用于扩增参考基因的引物的核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示，所述用于扩增参考基因的探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。
11.较佳地，所述试剂盒还包含阳性对照，所述阳性对照为包含kmt2a-ptd融合基因基因组片段的质粒和abl1基因的质粒。
12.较佳地，所述试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为包含abl1基因的质粒。
13.本发明还提供了一种非诊断目的检测kmt2a-ptd融合基因的方法，所述方法包含以下步骤：
14.s1，提供一微滴式数字pcr系统，其包含微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪；
15.s2，从待测样本中提取rna，将rna逆转录为cdna，对cdna进行扩增得到反应液；
16.s3，将所述反应液置于所述微滴生成仪中进行乳化，所述反应液形成10000～20000个微滴，将每一个微滴置于不同的反应单元中，使每一个反应单元包含一个或多个拷贝的核酸分子；
17.s4，利用所述封膜仪对每一个反应单元进行封膜；
18.s5，封膜结束后，利用上述任意一项所述的试剂盒中的引物对每一个反应单元中的kmt2a-ptd融合基因进行pcr扩增，利用上述任意一项所述的试剂盒中的探针对扩增产物进行特异性位点检测，利用所述微滴读取仪对每一个反应单元进行荧光信号的统计，根据pcr扩增后荧光信号的强弱对kmt2a-ptd融合基因进行定性和/或定量检测。
19.较佳地，所述pcr扩增的条件为：step1，95℃10分钟；step2，94℃15秒和58℃60秒，扩增反应40个循环；step3，98℃10分钟。
20.本发明还提供了一种如上任意一项所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测kmt2a-ptd融合基因。
21.本发明的有益效果：
22.(1)本发明针对kmt2a-ptd融合基因设计了适用于微滴式数字pcr系统的第一正向引物seq id no.1序列、第二正向引物seq id no.2序列、反向引物seq id no.3序列、探针seq id no.4序列，可以避免引物结合非目标位点，提高多剪切位点的检出灵敏度，从而进一步提高试剂盒的检测精确度；进一步地，利用微滴式数字pcr系统对kmt2a-ptd融合基因进行检测，微滴式数字pcr在检测的过程中将待测样品分配到大量独立、平行的微反应单元中，每个微反应单元独立检测目的基因，相较于现使用的定性和定量pcr技术，微滴式数字pcr根据每个微反应单元内样品dna拷贝的绝对计数，而无需依赖内参和另外制备标准曲线，大大提高了检测的灵敏度，尤其对于浓度较低的样本来说更易检出，该方法快速准确、灵敏度高、特异性强。
23.(2)本发明设计的试剂盒可以从白血病患者骨髓样本中提取的rna转录cdna中检测相关融合基因，其最低检出限可以达到10个拷贝，有助于临床上白血病患者体内kmt2a-ptd融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗、避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后都具有重要的意义，检测方法简便，适宜临床应用。
24.(3)现有检测技术中所需要的最低有效模板量为300～500ng rna，而本发明设计的引物是适用于微滴式数字pcr系统，当待测样本的dna浓度被稀释到很低水平时，样本溶液被分散到大量的反应单元中，使每个反应单元所含有的dna分子数最多只有一个，本发明所需要的有效模板量大大降低，其最低有效模板量为100ng rna，即可实现目的基因的快速准确检测。
附图说明
25.图1为本发明的kmt2a野生型和kmt2a-ptd异常示意图。
26.图2为本发明设计的引物位置区域。
27.图3为本发明的阳性样本示意图。
28.图4为本发明的阴性样本示意图。
29.图5为本发明的试剂盒与市售试剂盒检测kmt2a-ptd的定量值结果对比。
具体实施方式
30.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
31.本发明未指出的实验药品均为市售取得，本发明未详细说明的实验方法均为本领域常规实验方法。
32.名词解释：
33.绝对定量：测定目的基因在样本中的分子数目，即通常说的拷贝数。
34.相对定量：测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例。
35.目前国内外广泛使用的检测kmt2a相关融合基因的方法中，经常使用的方法是荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，fish)、ngs测序法(next generation sequencing，ngs)、荧光定量pcr，但是均存在缺陷。荧光原位杂交技术虽然结果较为直观，但是只能进行定性检测，并且操作复杂、成本高、灵敏度低，同时还需要荧光显微镜等大型仪器设备和病理医生的诊断意见，不利于临床样本的快速检出。ngs测序法虽然具备高通量、快速、直观地进行核苷酸分析的优势，但是成本较高、工艺繁琐，对生信分析人员技术要求较高，因此不适合进行单种融合基因的定量检测。荧光定量pcr虽然能够进行单种融合基因的定量检测，但是需要建立目的基因和内参基因的标准曲线，通过ct值换算成基因拷贝数，要求目的基因和内参基因的标准曲线扩增效率一致，因此对引物和探针设计要求较高，误差也较大，对于融合比例极低的阳性样本的漏检率很高。如图1所示，为本发明的kmt2a野生型与kmt2a-ptd异常示意图，本发明针对kmt2a-ptd融合基因进行引物和探针的设计，利用微滴式数字pcr技术进行目的基因的检测，大大提高了检测的灵敏度。
36.实验仪器：安捷伦8800定性pcr仪，bio-rad qx200微滴式数字pcr系统(包含微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，冷冻离心机，涡旋震荡器。
37.1.本发明的引物和探针设计
38.本发明通过在ncbi上查询kmt2a的序列，依据人kmt2a基因外显子8、外显子9和外显子3序列，如图2所示的位置进行引物的设计，设计筛选得到特异性和灵敏度均较高的数字pcr引物对与探针序列。
39.用于扩增kmt2a-ptd融合基因的引物对以及相应的探针序列如下：
40.kmt2a-ptd的第一正向引物(seq id no.1)：5
’‑
gtccagagcaga gcaaacag-3’；
41.kmt2a-ptd的第二正向引物(seq id no.2)：5
’‑
atgggaggctta ggaatc-3’；
42.kmt2a-ptd的第一反向引物(seq id no.3)：5
’‑
acacagatggat ctgagagg-3’；
43.kmt2a-ptd的探针(seq id no.4)：5
’‑
gtggctctgaccgaaatt cagc-3’；
44.其中，探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
45.用于扩增abl1的引物对以及相应的探针序列如下：
46.abl1的正向引物(seq id no.5)：5
’‑
tggagataacactctaagcataactaaaggt-3’；
47.abl1的反向引物(seq id no.6)：5
’‑
gatgtagttgcttgggaccca-3’；
48.abl1的探针(seq id no.7)：5
’‑
ccatttttggtttgggcttcacac catt-3’；
49.其中，探针5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
50.2.本发明的体系反应液的配制
51.(1)按表1配制kmt2a-ptd反应液，将配制好的kmt2a-ptd反应液4μl和10μl的ddpcr supermix进行混合，得到pcr预混液；
52.(2)取3μl的模板溶液与3μl的水进行混合，加至装有上述pcr预混液的pcr管中，每个反应体系的总体积为20μl。
53.表1kmt2a-ptd反应液
[0054][0055][0056]
阳性对照模板：经测序确认的包含kmt2a-ptd融合基因的质粒和abl1基因的质粒的溶液。
[0057]
阴性对照模板：经测序确认的仅包含abl1基因的质粒溶液。
[0058]
3.实验方法和步骤
[0059]
(1)制备模板：采集骨髓样本，采用康为世纪核酸提取试剂盒(货号cwy027s)，按照试剂盒说明书操作，从所述骨髓样本中提取rna；将得到的rna作为模板进行检测；
[0060]
(2)逆转录：利用takara逆转录试剂盒rr037a将提取到的骨髓rna进行逆转录，按照5
×
buffer 4μl+随机引物2μl+酶1μl+13μl模板进行扩增，扩增程序为：42℃30s，85℃10s，4℃hold。
[0061]
(3)制备微滴：将制备好的20μl反应体系转移至qx200微滴生成仪专用卡夹(共有三行，每行8孔，依次为微滴行、样本行和生成油行)的样品行的8孔中，生成油行对应的8孔加入配套的微滴生成油70μl(bio-rad公司，货号1863005)；放入微滴生成仪中，自动生成微滴，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中；用预热好的热封仪对其进行封膜，封膜程序为180℃5s，封膜结束后在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时内进行pcr。
[0062]
(4)pcr扩增：按照表2的程序进行数字pcr扩增。
[0063]
表2数字pcr的扩增程序
[0064]
[0065]
4.实验结果分析的具体步骤
[0066]
(1)检测合格标准：待测样本符合下述条件即为合格。
[0067]
阳性对照：abl1质粒≥500拷贝/μl，kmt2a-ptd融合基因质粒≥100拷贝/μl；
[0068]
阴性对照：abl1质粒≥500拷贝/μl，kmt2a-ptd融合基因质粒＜10拷贝/μl；
[0069]
(2)待测样本中kmt2a-ptd融合基因的准确融合比值计算公式如下：
[0070]
若待测样本中kmt2a-ptd融合基因拷贝＞10，人abl1基因拷贝数≥500则待测样本为阳性；
[0071]
若待测样本中kmt2a-ptd融合基因拷贝≤10，人abl1基因拷贝数≥500则待测样本为阴性。
[0072]
5.实验结果
[0073]
在数字pcr仪上使用本发明提供的上述引物探针来检测自制标准品(经测序确认的kmt2a-ptd融合基因质粒与abl1基因质粒混合)和阴性质控品(经测序确认的abl1基因质粒混合)。数字pcr所使用的pcr反应液的各组分及用量如表1所示，数字pcr检测条件如表2所示。对各组扩增的结果进行分析，根据图3可知，fam(ch1)代表kmt2a-ptd，vic(ch2)代表abl1，fam、vic通道的阴阳性微滴都区分明显，阳性质控品检测效果好。图4是阴性样本检测图，fam通道皆无阳性微滴，vic通道阴阳性微滴区分明显，表明参照基因检测正常且无假阳性干扰，符合预期。图4为阴性样本检测结果图。ch1通道为fam通道，检测kmt2a-ptd拷贝数，无阳性微滴，荧光信号均低于1000；ch2通道为vic通道，检测内参基因abl1基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为abl1基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。
[0074]
实施例
[0075]
采集骨髓样本20例，各个骨髓样本均获自上海市第一人民医院，利用本发明制备得到的一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒进行临床采集的骨髓样本的检测。检测方法为：将提取的骨髓样本cdna在pcr反应管内采用本发明的试剂盒进行检测，反应条件如表2所示。
[0076]
实验结果：检测结果如表3和图5所示，所检测的20个样本中，本发明的定量检测结果均高于市售试剂盒的定量检测结果，如样本7、10、11、14、16、17、19，利用本发明的检测试剂盒阳性检出率高于市售试剂盒，尤其对于融合比例极低的阳性样本更易检出；进一步地，经过定量值的统计发现，本发明的试剂盒可以实现绝对定量，相较于市售试剂盒检测的相对定量来说精确度更高。本发明的试剂盒有利于临床伴kmt2d-ptd融合基因异常的急性髓系白血病的检出，有助于临床上白血病患者体内kmt2a-ptd融合基因的微量残留检测，最低检出限可低至10个拷贝(拷贝数是指测定的目的基因在待测样本中的分子数目)。本发明试剂盒检测只需一个半小时，比市售的试剂盒检测所需的时间更短。
[0077]
表3市售试剂盒与本发明试剂盒检测定量结果的对比
[0078]
样品编号市售试剂盒检测结果本发明的试剂盒检测结果116.13％56％221.60％97％328.19％105％448.51％216％
520.24％46％6178.80％370％700.20％8009001000.10％1157.92％190％120013001402％15001601.90％1701.10％18001902.90％2000
[0079]
综上所述，本发明提出的一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，针对kmt2a-ptd融合基因设计了适用于基于微滴式数字pcr系统的引物和探针，以及相应的阳性对照和阴性对照，使其能够用于基于微滴式数字pcr的检测系统。利用微滴式数字pcr进行检测时，可将检测样本乳化成若干个独立的微滴，对每个微滴进行独立的检测，尤其对于浓度较低的样本来说更易检出。本发明用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒提高了检测的精确性，提升了检测的灵敏度，有助于微量残留检测，实现绝对定量；对于诊断、评价患者疗效、预测预后及对微小残留病变复发的监测中具有非常大的优势。并且本发明的试剂盒操作简便快捷、自动化程度高、成本低、易于推广，具有很好的应用前景。
[0080]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；其中，所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。2.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述引物对和探针溶于pcr反应液中，浓度分别为30μm～80μm。3.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述探针的3’端标记bhq1淬灭基团。4.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含参考基因扩增检测试剂组，其包括用于扩增参考基因的引物和探针，所述参考基因为abl1基因。5.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增参考基因的引物的核苷酸序列如seq id no.5和seqid no.6所示，所述用于扩增参考基因的探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。6.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照，所述阳性对照为包含kmt2a-ptd融合基因基因组片段的质粒和abl1基因的质粒。7.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为包含abl1基因的质粒。8.一种非诊断目的检测kmt2a-ptd融合基因的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：s1，提供一微滴式数字pcr系统，其包含微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪；s2，从待测样本中提取rna，将rna逆转录为cdna，对cdna进行扩增得到反应液；s3，将所述反应液置于所述微滴生成仪中进行乳化，所述反应液形成10000～20000个微滴，将每一个微滴置于不同的反应单元中，使每一个反应单元包含一个或多个拷贝的核酸分子；s4，利用所述封膜仪对每一个反应单元进行封膜；s5，封膜结束后，利用如权利要求1～7中任意一项所述的试剂盒中的引物对每一个反应单元中的kmt2a-ptd融合基因进行pcr扩增，利用如权利要求1～7中任意一项所述的试剂盒中的探针对扩增产物进行特异性位点检测，利用所述微滴读取仪对每一个反应单元进行荧光信号的统计，根据pcr扩增后荧光信号的强弱对kmt2a-ptd融合基因进行定性和/或定量检测。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的条件为：step1，95℃10分钟；step2，94℃15秒和58℃60秒，扩增反应40个循环；step 3，98℃10分钟。10.一种如权利要求1～7中任意一项所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测kmt2a-ptd融合基因。

技术总结
本发明公开了一种用于检测KMT2A-PTD融合基因的试剂盒、其方法和应用，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；其中，所述第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明设计的引物对和探针适用于微滴式数字PCR系统，检测时将反应液乳化成微滴，每一个微滴置于不同的反应单元进行独立检测，对于浓度较低的样本更易检出，提高了检测的灵敏度，进一步提升了检测的精确度，具有自动化程度高、操作简单的优势，更适合用于临床上白血病患者体内KMT2A-PTD融合基因的微量残留检测。PTD融合基因的微量残留检测。PTD融合基因的微量残留检测。


技术研发人员：王小蕊 童茵 杨隽 李会丹 娄加陶
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/16