一种复合鱼鳞提取物及其制备方法、应用

1.本发明涉及海洋生物材料技术领域，尤其涉及一种复合鱼鳞提取物及其制备方法、应用。


背景技术：

2.日常生活中，人们不可避免的会接触紫外线辐射，包括高海拔地区和沿海地区的自然接触，以及来自医院、工厂和实验室的人工紫外线，都会对皮肤健康产生负面影响，降低人们日常生活的生活质量。根据2022年6月21日世界卫生组织的数据，至少有12万人死于紫外线辐射引起的皮肤癌。紫外线辐射引起的皮肤损伤通常表现为红斑、色素沉着、表皮脱落、皮肤松弛和皱纹，以及因胶原纤维退化失调和自噬水平下降而导致的表皮和真皮层增厚，概况称为“光老化”。
3.从水生动物，特别是海鱼中提取抗氧化胶原蛋白或胶原蛋白肽，从海洋动物中获得的提取物，在营养、制药和药妆工业中具有巨大的潜力；包括巨型鱿鱼皮、太平洋鳕鱼、刺头黄花鱼、海参和米氏黄花鱼，不仅能有效清除自由基，还能竞争性地结合基质金属蛋白酶的结合位点，抑制基质金属蛋白酶的活性，从而缓解光老化过程。申请号为cn201410036356.0的中国发明专利提出了一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，用鱼鳞作原料，经过预处理、干燥、脱脂、脱灰、辐照处理、酶解、提取、纯化等步骤提取。由于对鱼鳞原料进行电子束辐照处理后用胃蛋白酶结合柠檬酸进行酶解、提取和纯化，可以缩短酶解时间。
4.但是，本技术人发现现有技术至少还存在以下问题：目前已有水生生物多肽具有抗氧化、降血压、吸水性、保水性等功能的活性肽，但是并未实现对其进行高提取率的制备，并且也没有利用鱼鳞提取物对紫外线照射后的皮肤进行保护以及损伤修复的相关技术。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种复合鱼鳞提取物及其制备方法、应用，以解决并未实现对鱼鳞提取物进行高提取率的制备，并且也没有利用鱼鳞提取物对紫外线照射后的皮肤进行保护以及损伤修复的相关技术的问题。
6.基于上述目的，本发明提供了一种复合鱼鳞提取物的制备方法，包括：步骤一，脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用表面活性剂和磷酸酶溶液振荡洗涤；步骤二，脱钙：将步骤一中的鱼鳞与等离子体活化水均匀混合，进行超声波处理，将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞；步骤三，酶解：将步骤二中的脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解；步骤四，萃取：将步骤三所得的酶解鱼鳞进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，得到鱼鳞提取液；步骤五，冷冻干燥：步骤四中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞
胶粉末。
7.可选的，所述表面活性剂为所述表面活性剂为0.01-0.2%triton溶液，磷酸酶溶液浓度为40-100u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度150-300rpm，时间为2-24小时。
8.可选的，所述等离子体活化水的ph值是2.5，鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1:6~12进行混合。
9.可选的，所述超声处理功率为100~150w，处理时长30-60min。
10.可选的，所述酶解条件为：酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60～120 min。
11.可选的，所述萃取温度100-120℃，鱼鳞与水的比例为1:1~4，处理时间为1-2h。
12.一种如上述制备方法制备得到的复合鱼鳞提取物，所述复合鱼鳞提取物包括鱼鳞胶原多肽粉末。
13.一种上述的复合鱼鳞提取物在制备皮肤外用剂中的应用，所述皮肤外用剂可用来对紫外线照射后皮肤保护及细胞损伤修复。
14.一种皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包括复合鱼鳞提取物。
15.可选的，所述皮肤外用剂包括去离子水，将鱼鳞胶原多肽粉末分别添加去离子水，制备浓度为1%-10%的鱼鳞胶原多肽水凝胶。
16.本发明的有益效果：通过表面活性剂triton溶液与核酸酶的共同作用，可去除鱼鳞表面杂蛋白以及核酸等抗原物质，提高脱细胞效果，无人畜共患病毒传播的风险，提取率更高，生产成本更低。采用本方法对鱼鳞进行处理后，鱼鳞脱钙率达到90%以上，脱钙方法简单，生产周期短，没有后续酸碱溶液处理得负担，不仅有效降低生产成本，而且胶原损失低。本发明经酶解后水提的鱼鳞胶原多肽分子量分布相对集中，水解产物稳定，能够锁住水分子防止流失，具有较强的吸湿性和保湿性，能更好的保持皮肤的水分。
17.采用本发明方法对鱼鳞提取，所得的鱼鳞胶原多肽提取量达到16%以上，且具有明显的抗氧化活性，对abts和dpph自由基具有较强的清除能力。鱼鳞胶原多肽能有效地保护紫外线照射的细胞活力，降低紫外线照射下的氧化损伤，延缓紫外线导致的皮肤光老化，在预防和治疗紫外线方面发挥巨大潜力。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为本发明实施例一种鱼鳞提取物制备方法的鱼鳞处理前后照片对比图；图2中a为本发明实施例冻干后鱼鳞提取物的形态图；b为不同浓度的鱼鳞胶原多肽溶液的颜色和透明度对比图；图3为本发明实施例不同浓度的有鱼鳞胶原多肽的紫外线吸收图谱；图4为本发明实施例鱼鳞胶原多肽水凝胶对紫外线辐照l929细胞中sod和mda的影响统计图；
图5为本发明实施例紫外线辐照2天和5天后小鼠背部皮肤宏观图；
具体实施方式
20.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
21.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例一：
22.本发明提供一种复合鱼鳞提取物制备方法，包括以下步骤：（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.05%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度50u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:10 (w/v)，振荡速度200rpm，洗涤时间24小时。
23.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1：6进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为100w，处理时长30min；将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
24.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60min。
25.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度100℃，鱼鳞与水的比例为1:4，处理时间为1h，得鱼鳞提取液；（5）冷冻干燥：将（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
实施例二：
26.本发明提供一种鱼鳞提取物制备方法，还可以包括以下步骤：（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.1%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度50u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比1:30(w/v)，振荡速度200rpm，洗涤时间12小时。
27.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1：12进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为100w，处理时长50min，将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
28.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为120 min。
29.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度120℃，鱼鳞与水的比例为1:1，处理时间为2h，得鱼鳞提取液。
30.（5）冷冻干燥：将步骤（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
实施例三：
31.本发明提供一种鱼鳞提取物制备方法，还可以包括以下步骤：
（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.1%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度100u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:10 (w/v)，振荡速度300rpm，洗涤时间24小时。
32.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1:6进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为150w，处理时长40min。将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
33.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60 min。
34.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度120℃，鱼鳞与水的比例为1:3，处理时间为1h，得鱼鳞提取液。
35.（5）冷冻干燥：将（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
实施例四：
36.本发明提供一种鱼鳞提取物制备方法，还可以包括以下步骤：（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.05%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度50u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:10 (w/v)，振荡速度150rpm，洗涤时间12小时。
37.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1：12进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为120w，处理时长50min，将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
38.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60 min。
39.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度100℃，鱼鳞与水的比例为1:2，处理时间为1h，得鱼鳞提取液。
40.（5）冷冻干燥：将步骤（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
实施例五：
41.本发明提供一种鱼鳞提取物制备方法，还可以包括以下步骤：（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.2%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度100u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:30 (w/v)，振荡速度150rpm，洗涤时间12小时。
42.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1:10进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为120w，处理时长50min。将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
43.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为120 min。
44.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度100℃，鱼鳞与水的比例为1:2，处理时间为2h，得鱼鳞提取液。
45.（5）冷冻干燥：将（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
实施例六：
46.本发明提供一种鱼鳞提取物制备方法，还可以包括以下步骤：（1）脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用0.2%triton溶液和磷酸酶溶液振荡洗涤；磷酸酶溶液为浓度50u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:20(w/v)，振荡速度150rpm，洗涤时间24小时。
47.（2）脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1:10进行均匀混合，进行超声波处理，超声处理功率为150w，处理时长60min。将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞。
48.（3）酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解，酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60 min。
49.（4）萃取：将步骤（3）所得的酶解鱼鳞采用水浴加热进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，萃取温度110℃，鱼鳞与水的比例为1:1，处理时间为1h，得鱼鳞提取液。
50.（5）冷冻干燥：将步骤（4）中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。
51.将上述六个实施例中脱细胞后dna残留量、脱钙鱼鳞的脱钙率以及获得的水凝胶中蛋白质含量进行检测，试验结果如表1所示。
52.表1鱼鳞脱细胞后dna残留量，脱钙鱼鳞的脱钙率以及水凝胶中蛋白质含量
53.由表1可以看出，酶法工艺能达到良好的去除核酸残留的效果（行业公认限度为50ng/mg），随着等离子体活化水用量和超声处理时间的增加，脱钙效果越明显，处理40分钟可达到90%以上的脱钙率，处理60分钟脱钙率在95%以上。经过酶解后水提鱼鳞胶原多肽的提取率在2h时可达到18%以上，原辅料利用率高。
54.如图1所示，脱钙处理后的鱼鳞更加轻薄柔软，有韧性，透明度更高。
55.本发明还提供一种鱼鳞提取物在皮肤外用剂中的应用，用于对紫外线照射后皮肤保护以及细胞损伤修复。
56.将本发明实施例二所得的鱼鳞胶原多肽粉末，配置成胶原蛋白多肽溶液，通过凝胶渗透色谱来检测其分子量大小，结果显示其分子量分布相对集中，平均分子量为11kda。将鱼鳞胶原多肽粉末分别添加去离子水，制备不同浓度的鱼鳞胶原多肽水凝胶，鱼鳞胶原多肽粉末的浓度分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，8%，10%。实验结果如图2所示，冷冻干燥后鱼鳞胶原多肽为海绵状固体，颜色为白色，鱼鳞胶原多肽溶于水呈透明状态，粘度较高，如图2中a。当温度降低到4℃时，鱼鳞胶原多肽水凝胶溶液变为鱼鳞胶原多肽水凝胶，如图2中b所
示，图2b中a至j的鱼鳞胶原多肽粉末的浓度分别为10%， 8%，6%，5%，4%，3%，2%，1%。
57.如图3所示，从鱼鳞胶原多肽水凝胶的紫外吸收图谱可以看出，鱼鳞胶原多肽水凝胶对uvc(200 nm-280 nm)有较强的吸收，对uvb(280 nm-310 nm)有较弱的吸收，对uva（310nm-400nm）几乎没有吸收。
58.如图4所示，其中a为鱼鳞胶原多肽水凝胶预处理培养1h后l929细胞内sod和mda含量情况；b为鱼鳞胶原多肽水凝胶预处理培养24h后l929细胞内sod和mda含量情况；c为鱼鳞胶原多肽水凝胶预处理共培养24h后l929细胞内sod和mda含量情况。
59.将l929细胞在紫外线照射后与鱼鳞胶原多肽水凝胶共培养24 h。结果表明，鱼鳞胶原多肽水凝胶能有效降低紫外线照射下的氧化损伤，并通过提高抗氧化酶活性以剂量依赖性的方式修复紫外线照射引起的损伤细胞。
60.如图5所示，对实验鼠背部进行紫外线照射，并用鱼鳞胶原多肽水凝胶处理，紫外线照射后皮肤的变化在鱼鳞胶原多肽水凝胶组得到改善，表明鱼鳞胶原多肽水凝胶对紫外线引起的宏观皮肤损伤有抑制作用，且与浓度呈正相关。鱼鳞胶原多肽水凝胶对皮肤有保护和修复作用。
61.所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
62.本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，包括：步骤一，脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用表面活性剂和磷酸酶溶液振荡洗涤；步骤二，脱钙：将步骤一中的鱼鳞与等离子体活化水均匀混合，进行超声波处理，将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞；步骤三，酶解：将步骤二中的脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解；步骤四，萃取：将步骤三所得的酶解鱼鳞进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，得到鱼鳞提取液；步骤五，冷冻干燥：步骤四中的鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。2.根据权利要求1所述的一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为所述表面活性剂为0.01-0.2%triton溶液，磷酸酶溶液浓度为40-100u/ml的磷酸酶溶液，磷酸酶处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度150-300rpm，时间为2-24小时。3.根据权利要求1所述的一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，所述等离子体活化水的ph值是2.5，鱼鳞与等离子体活化水按照料液比1:6~12进行混合。4.根据权利要求1所述的一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，所述超声处理功率为100~150w，处理时长30-60min。5.根据权利要求1所述的一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，所述酶解条件为：酶解温度恒定为50℃、加酶量为鱼鳞干重的3%，酶解时间为60～120 min。6.根据权利要求1所述的一种复合鱼鳞提取物的制备方法，其特征在于，所述萃取温度100-120℃，鱼鳞与水的比例为1:1~4，处理时间为1-2h。7.一种如权利要求1-6任意一项制备方法制备得到的复合鱼鳞提取物，其特征在于，所述复合鱼鳞提取物包括鱼鳞胶原多肽粉末。8.一种如权利要求7所述的复合鱼鳞提取物在制备皮肤外用剂中的应用，所述皮肤外用剂可用来对紫外线照射后皮肤保护及细胞损伤修复。9.一种皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂包括如权利要求7所述的复合鱼鳞提取物。10.根据权利要求9所述的一种皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂包括去离子水，将鱼鳞胶原多肽粉末分别添加去离子水，制备浓度为1%-10%的鱼鳞胶原多肽水凝胶。。

技术总结
本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种复合鱼鳞提取物及其制备方法、应用，包括：脱细胞：选取新鲜鲤鱼鳞，先后采用表面活性剂和磷酸酶溶液振荡洗涤；脱钙：将鱼鳞与等离子体活化水均匀混合，进行超声波处理，将超声处理后的混合物过滤、清洗得脱钙鱼鳞；酶解：将脱钙鱼鳞采用中性蛋白酶在生物酶反应器中催化酶解；萃取：将酶解鱼鳞进行灭酶处理，之后采用热水提取法进行萃取，得到鱼鳞提取液；冷冻干燥：鱼鳞提取液采用冷冻干燥剂进行冷冻干燥，得鱼鳞胶粉末。提高脱细胞效果，无人畜共患病毒传播的风险，提取率更高，生产成本更低。所制备的复合鱼鳞提取物对紫外线照射后的皮肤具有保护及细胞损伤修复的功能。护及细胞损伤修复的功能。护及细胞损伤修复的功能。


技术研发人员：陈西广 张欣 程晓杰 刘艺璇
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/7