一种鱼露的制备方法

1.本发明涉及食品加工领域，具体涉及风味蛋白酶、米曲霉、植物乳杆菌、酵母连续发酵制备低生物胺鱼露的方法。


背景技术：

2.鱼露，也称之为鱼酱油，它是一种传统的调味品，主要以低值的水产品加工下脚料为原料生产鱼露，经过自然发酵，利用鱼体所含的蛋白酶及其它酶，以及在多种微生物共同参与下，对原料鱼中的蛋白质，脂肪等成分进行发酵分解，酿制而成。其滋味鲜美，风味独特，在烹饪食品时常作为风味增强剂或替代盐的作用。鱼露的制备一般分为传统发酵工艺和快速发酵工艺，传统发酵工艺是将原料曝晒于太阳下，利用原料自带的微生物酶和空气中的其他微生物发酵而成；快速发酵工艺可分为保温发酵、加酶发酵、加曲发酵以及混合发酵，保温发酵是利用原料中的微生物自溶的最佳温度进行保温发酵；加酶发酵是在原料中添加合适的蛋白酶进行发酵；加曲发酵是添加曲霉种曲进行发酵，利用曲霉繁殖产生大量的蛋白酶进行发酵；混合发酵则是在添加酶的基础上再加入曲霉进行混合发酵。传统鱼露的发酵的周期较长，生产效率较低，高盐易产生生物胺等有害物质；随着发酵工艺的发展，外加菌种发酵缩短发酵周期以及产品质量成为研究热点。
3.鳜鱼是臭鳜鱼加工生产的原料，臭鳜鱼产品是一种地道的徽州发酵鱼制产品，对鳜鱼的需求量大，2022年安徽黄山地区的鳜鱼年产量可达200吨，鳜鱼主要分布于我国各主要江河湖泊，鳜鱼属于肉食性淡水鱼，动作敏捷、运动能力强、肌肉发达，肉质肥美、味道鲜嫩，具有较高的营养价值和经济价值。生产臭鳜鱼需要大量的鳜鱼，所以在这个过程中会有大量的鳜鱼下脚料，例如鳜鱼的内脏、鱼鳃，大多会被直接扔掉，这就造成了资源的浪费和环境的污染。此外鳜鱼的下脚料含有氨基酸、蛋白质、维生素和矿物质等人类所需要的营养物质,所以鳜鱼的下脚料作为生产鱼露产品具有潜在开发价值。
4.随着鱼露产品的开发，消费者对鱼露的安全性以及风味有更高的要求，鱼露的发酵时间、发酵剂以及发酵条件的不同会影响鱼露产品的风味以及安全性，生物胺是对鱼露安全性影响较大的一类物质。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鱼露的制备方法。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种鱼露的制备方法，包含如下步骤：
7.步骤1：米曲霉种曲的制备、植物乳杆菌接种物的制备和酵母菌接种物的制备；
8.步骤2：原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，加水后制成肉糜；
9.步骤3：在肉糜中加入风味蛋白酶进行酶解，得到酶解产物；
10.步骤4：加菌发酵：在酶解产物中依次加入米曲霉种曲、植物乳杆菌接种物和酵母菌接种物进行发酵，获得发酵产物；
11.步骤5：发酵完成后过滤分离固体滤渣、对滤液进行巴氏杀菌后得到鱼露。
12.优选的技术方案为：所述米曲霉种曲的制备包括：
13.将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28-30℃培养65-80d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液于经灭菌的麸皮培养基中，在28-32℃条件下培养36-48h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲，米曲霉为as3.042米曲霉；
14.植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在30-40℃下培养36-48h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在30-40℃下培养24-28h，获得接种物，将液体培养基在3000-4000rpm/min的转速下离心，倒掉上清液，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水制成菌悬液；
15.酵母菌接种物的制备：将活化后的汉逊德巴利酵母菌划线接种在pda琼脂培养基中、30-40℃下培养45-50h后，用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8-9log cfu/m l。
16.优选的技术方案为：麦麸培养基的组成为：麸皮45-55重量份，水45-55重量份，粉碎的鳜鱼下脚料4-6重量份，在121℃下灭菌30min；
17.优选的技术方案为：植物乳杆菌接种物的浓度为7-10log cfu/m l；
18.优选的技术方案为：每升mrs琼脂培养基含有：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温80 1.0g、琼脂15-20g，ph6.5
±
0.2，121℃下灭菌20min；mrs液体培养基与mrs琼脂培养基不同之处在于，不添加琼脂；pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，自然ph；培养基制备方法：将马铃薯先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用4层纱布过滤于锥形瓶中，在滤液中加入葡萄糖和琼脂，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，115℃灭菌20min。
19.优选的技术方案为：风味蛋白酶的酶活≥30000u/g,有效温度为30-60℃，最佳温度为50-55℃，最适ph为6-7；按照底物重量的1-2％添加，酶解时间为4-8h，酶解温度为45-55℃。
20.优选的技术方案为：加入米曲霉种曲之前，在酶解产物中，以原料质量计算，添加其质量3-8％的食盐。
21.优选的技术方案为：以原料质量的5-10％加入米曲霉种曲，混合后作为第一次发酵，发酵时间为3-5d，发酵温度为28-32℃。
22.优选的技术方案为：以原料质量的1-2％加入植物乳杆菌进行第二次发酵，发酵时间为1.5-2.5d，发酵温度为30-40℃。
23.优选的技术方案为：以原料质量的1-2％添加酵母菌进行第三次发酵，发酵时间为2.5-3.5d，发酵温度为30-40℃。
24.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
25.1、添加了米曲霉种曲进行发酵的鱼露中氨基氮的含量达到了一级鱼露的标准以上，每100ml鱼露中氨基氮的含量可达1.07g，与不接米曲霉发酵组相比提高了44.59％。
26.2、通过加米曲霉和植物乳杆菌连续发酵，鱼露中的生物胺含量明显降低了，只检测到了三种生物胺，分别是色胺、腐胺和组胺，与对照组比少了两种生物胺，这三种生物胺
分别降低了30.56％、68.62％和27.22％。
27.3、接米曲霉、植物乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌复合发酵的鱼露中氨基酸和风味物质的含量都分别增加了5.91％和12.87％。
附图说明
28.附图1为发酵工艺流程图。
29.附图2为不同发酵阶段的鱼露。
30.附图3为三种菌发酵后鱼露的对比图。
①
为米曲霉发酵、过滤、灭菌后的鱼露样品；
②
米曲霉与植物乳杆菌发酵、过滤、灭菌后的鱼露样品；
③
米曲霉、植物乳杆菌与酵母菌发酵、过滤、灭菌后的鱼露样品。
具体实施方式
31.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
32.请参阅图1-3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
33.生物材料的保藏：
34.一株植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)yr07，已于2022年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m20221303。
35.以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。
36.实施例1：一种鱼露的制备方法
37.1、米曲霉种曲的制备：将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28-30℃培养3d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液(约有107个孢子)于经灭菌的麸皮培养基中，在30℃条件下培养36h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲。
38.2、植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在35℃下培养36-48h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在35℃下培养24-28h，获得接种物，将液体培养基在3500rpm/min的转速下离心，倒掉上清液,沉淀用无菌生理盐水洗涤两次,再用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8-9log cfu/ml。
39.3、汉逊德巴利酵母菌接种物的制备：将活化后的汉逊德巴利酵母菌划线接种在pda琼脂培养基中、35℃下培养48h后，用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8-9log cfu/ml。
40.4、原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，按照1:1的比例添加蒸馏水，均质成肉糜。
41.5、在上述肉糜样品中加入1.5％风味蛋白酶，在50℃、ph7的条件下酶解6h，得到酶
解产物；
42.6、加菌发酵：首先在酶解产物中添加6％的盐，再加入6％as3.042米曲霉(以原料质量的6％添加)混合后进行第一次发酵，发酵时间为4d，发酵温度为30℃；第一次发酵后加入1％植物乳杆菌(以原料质量的1％添加)进行第二次发酵，发酵时间为2d，发酵温度为35℃；向第二次发酵后的混合物中添加2％汉逊德巴利酵母菌(以原料质量的2％添加)进行第三次发酵，发酵时间为3d，发酵温度为35℃。
43.7、三次发酵完成后用3层100目纱布过滤分离固体滤渣并灭菌得到鱼露，记为f3组。
44.对比例1：一种鱼露的制备方法
45.1、米曲霉种曲的制备：将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28-30℃培养3d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液(约有107个孢子)于经灭菌的麸皮培养基中，在30℃条件下培养36h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲。
46.2、植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在35℃下培养36-48h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在35℃下培养24-28h，获得接种物，将液体培养基在3500rpm/min的转速下离心，倒掉上清液,沉淀用无菌生理盐水洗涤两次,再用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8-9log cfu/ml。
47.3、原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，按照1:1的比例添加蒸馏水，均质成肉糜。
48.4、在上述肉糜样品中加入1.5％风味蛋白酶，在50℃、ph7的条件下酶解6h，得到酶解产物；
49.5、加菌发酵：首先在酶解产物中添加6％的盐，再加入6％as3.042米曲霉(以原料质量的6％添加)混合后进行第一次发酵，发酵时间为4d，发酵温度为30℃；第一次发酵后加入1％植物乳杆菌(以原料质量的1％添加)进行第二次发酵，发酵时间为2d，发酵温度为35℃。
50.6、二次发酵完成后用3层100目纱布过滤分离固体滤渣并灭菌得到鱼露，记为f2组。
51.对比例2：一种鱼露的制备方法
52.1、米曲霉种曲的制备：将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28-30℃培养3d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液(约有107个孢子)于经灭菌的麸皮培养基中，在30℃条件下培养36h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲。
53.2、原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，按照1:1的比例添加蒸馏水，均质成肉糜。
54.3、在上述肉糜样品中加入1.5％风味蛋白酶，在50℃、ph7的条件下酶解6h，得到酶解产物；
55.4、加菌发酵：首先在酶解产物中添加6％的盐，再加入6％as3.042米曲霉(以原料质量的6％添加)混合后进行发酵，发酵时间为4d，发酵温度为30℃。
56.5、发酵完成后用3层100目纱布过滤分离固体滤渣并灭菌得到鱼露，记为f1组。
57.对比例3：一种鱼露的制备方法
58.1、原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，按照1:1的比例添加蒸馏水，均质成肉糜。
59.2、在上述肉糜样品中加入1.5％风味蛋白酶，在50℃、ph7的条件下酶解6h，得到酶解产物；
60.4、将酶解产物用3层100目纱布过滤分离固体滤渣并灭菌得到鱼露，记为c组。
61.1、氨基态氮含量的测定：对c组和f1组鱼露的氨基氮含量进行测定，检测方法采用茚三酮比色法，方法如下：
62.取1ml样品，稀释500倍，分散均匀，静置取稀释液4ml，加1ml茚三酮溶液和磷酸盐缓冲液，摇匀，水浴加热15min，静置15min，用蒸馏水作为空白对照，测a570，通过标曲计算得到样品氨基氮含量。
63.实验结果如下：
64.表1c组和f1组鱼露的氨基氮含量(单位：g/100ml)
[0065] cf1氨基氮含量0.74
±
0.021.07
±
0.06
[0066]
注：c组为酶解产物，f1组为酶解加米曲霉发酵组
[0067]
鱼露氨基氮的含量是一个重要的指标，一般氨基氮含量大于等于0.9g/100ml被定为一级鱼露；添加米曲霉后的鱼露中的氨基氮含量较对照组增加了0.33g/100ml，并且f1组的氨基氮含量达到了一级鱼露的标准。
[0068]
2、生物胺含量的测定：采用高效液相(hplc)对f1组和f2组鱼露的生物胺含量进行检测，检测方法如下：
[0069]
样品处理：取1ml鱼露，加适量0.6m hclo4溶液和125μl内标(1,7-二氨基庚烷)后混匀，然后离心，离心后取上清并重复上述步骤，最后合并上清液定容到10ml容量瓶，得样液；
[0070]
样品以及标品的衍生：取样液0.2ml，标品系列0.2ml加入50μl内标，加入40μl 2m naoh、60μl饱和nahco3、400μl 10mg/ml丹磺酰氯，震荡均匀后加入20μl nh4oh，在40℃水浴45min，在暗处反应30min后加乙腈至1ml，过滤，待进样；
[0071]
hplc的条件：使用反相hplc,乙酸铵(0.1m；溶剂a)和乙腈(溶剂b)用作流动相。使用以下梯度进行洗脱:0分钟，50％ b；25分钟，90％ b；35分钟，90％ b；45,50％ b。流速为0.8毫升/分钟，温度为30℃。样品在254nm下检测，进样体积为10μl。
[0072]
表2f1组和f2组发酵鱼露的生物胺含量(单位：mg/l)
[0073] f1f2色胺363.61
±
19.83252.49
±
17.32苯胺12.62
±
1.38nd腐胺130.20
±
10.1840.86
±
7.68尸胺12.58
±
0.71nd组胺153.22
±
5.10111.51
±
5.62
[0074]
注：f1组为酶解加米曲霉发酵，f2组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌发酵
[0075]
添加植物乳杆菌发酵的鱼露可以有效地降低生物胺的含量，在f1(未接植物乳杆菌)组中检测到了色胺、苯胺、腐胺、尸胺和组胺，而在f2组(接植物乳杆菌)中只检测到色胺、腐胺和组胺，而且这三种生物胺的含量均比f1组低。
[0076]
3、氨基酸含量的测定：采用全自动氨基酸分析仪对f2组和f3组鱼露的氨基酸含量进行检测，检测方法如下：
[0077]
取样品5ml，添加25ml 5％三氯乙酸溶液，超声2次，每次15min，静置1个小时后，用0.22μm的针头过滤器过滤，装瓶，上机分析。
[0078]
表3f2和f3组发酵鱼露的氨基酸含量(单位：mg/kg)
[0079][0080][0081]
注：f2组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌发酵，f3组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌发酵
[0082]
f3组添加酵母后的鱼露中游离氨基酸的总含量增加了5.9％，其中甜味氨基酸的含量增加最多，比f2组(未接酵母)增加了6.9％，鲜味和苦味氨基酸分别增加了6.2％、4.6％，说明添加了酵母后有利于增加鱼露的氨基酸，提高了鱼露的滋味。
[0083]
4、挥发性风味化合物的测定：采用固相微萃取气质联用(hpms-hs-gc-ms)对f2组和f3组鱼露的挥发性风味化合物的测定，测定方法如下：
[0084]
每个样品取5ml于20ml顶空瓶中，并加入万分之一浓度的内标(2,4,6-三甲基吡啶)10μl。将萃取头插入顶空瓶中，温度70℃，萃取时间40min。
[0085]
色谱柱为:db-wax毛细管色谱柱(30mx0.20 mm0.25 m)，进样口温度:250c，程序升温初始温度为30
°
，保持1min。以4℃/min上升至92℃，保持2min.以5℃/min上升至200℃，以
6℃/min上升至240℃保持6min。载气流速1ml/min，不分流进样。质谱条件:电离方式(ei)；电子能量70ev；接口温度250℃:离子源温度250℃；质谱扫描范围29-450m/z，采集模式为全扫。
[0086]
结果如下：
[0087]
表4f2和f3组发酵鱼露的挥发性风味化合物含量(单位：μg/100g)
[0088][0089]
注：f2组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌发酵，f3组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌发酵
[0090]
添加酵母后鱼露的风味总含量增加，其中与f2组(未接酵母)相比，酸类、酯类、烯烃类和芳烃类化合物的含量增加，醇类、醛酮类化合物的含量是减少的；醇类化合物一般在发酵后会氧化成酸、醛、酮化合物以及与酸酯化成酯类化合物，从上述变化来看，添加酵母的f3组生成更多的酸和酯，酯的含量增加更多，f3组(接酵母)生成更少的具有不良气味的醛酮化合物，说明酵母菌的添加提高了鱼露的风味。
[0091]
表5f2和f3组发酵鱼露的醇类化合物含量(单位：μg/100g)
[0092][0093][0094]
表6f2和f3组发酵鱼露的醛类化合物含量(单位：μg/100g)
[0095][0096]
注：f2组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌发酵，f3组为酶解加米曲霉、加植物乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌发酵
[0097]
接酵母菌组的醇类化合物减少，但其中1-辛烯-3-醇含量增加，1-辛烯-3-醇是发酵鱼制品中常见的风味化合物，具有蘑菇香气，对风味有促进作用，3-甲基-丁醇具有刺激难闻的气味，f3组(接酵母)中3-甲基-丁醇含量是减少的，减少了接菌组风味的不良气味。辛醛、己醛、壬醛等直链饱和醛具有鱼腥味，上述结果中f3接酵母组的这些醛类的含量减少，减少了鱼露中的鱼腥味，苯甲醛、3-甲基丁醛等具有坚果气味，可以增强鱼露的风味，f3中苯甲醛、3-甲基丁醛的含量与f2组(未接酵母)相比增加了，综上说明接酵母菌发酵组的鱼露风味更好。
[0098]
实施例2：一种鱼露的制备方法
[0099]
一种鱼露的制备方法，包含如下步骤：
[0100]
步骤1：米曲霉种曲的制备、植物乳杆菌接种物的制备和酵母菌接种物的制备；
[0101]
步骤2：原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，加水后制成肉糜；
[0102]
步骤3：在肉糜中加入风味蛋白酶进行酶解，得到酶解产物；
[0103]
步骤4：加菌发酵：在酶解产物中依次加入米曲霉种曲、植物乳杆菌接种物和酵母菌接种物进行发酵，获得发酵产物；
[0104]
步骤5：发酵完成后过滤分离固体滤渣、对滤液进行巴氏杀菌后得到鱼露。
[0105]
优选的技术方案为：所述米曲霉种曲的制备包括：
[0106]
将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28℃培养65d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液于经灭菌的麸皮培养基中，在28℃条件下培养36h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲，米曲霉为as3.042米曲霉；
[0107]
植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在30℃下培养36h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，获得接种物，将液体培养基在3000rpm/min的转速下离心，倒掉上清液，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水制成菌悬液；
[0108]
酵母菌接种物的制备：将活化后的汉逊德巴利酵母菌划线接种在pda琼脂培养基中、30℃下培养45h后，用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8log cfu/m l。
[0109]
优选的实施方式为：麦麸培养基的组成为：麸皮45重量份，水45重量份，粉碎的鳜鱼下脚料4重量份，在121℃下灭菌30min；
[0110]
优选的实施方式为：植物乳杆菌接种物的浓度为7log cfu/m l；
[0111]
优选的实施方式为：每升mrs琼脂培养基含有：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温80 1.0g、琼脂15-20g，ph6.5
±
0.2，121℃下灭菌20min；mrs液体培养基与mrs琼脂培养基不同之处在于，不添加琼脂；pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，自然ph；培养基制备方法：将马铃薯先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸20分钟，能被玻璃棒戳破即可，用4层纱布过滤于锥形瓶中，在滤液中加入葡萄糖和琼脂，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，115℃灭菌20min。
[0112]
优选的实施方式为：风味蛋白酶的酶活≥30000u/g,有效温度为30℃，最佳温度为50℃，最适ph为6；按照底物重量的1％添加，酶解时间为4h，酶解温度为45℃。
[0113]
优选的实施方式为：加入米曲霉种曲之前，在酶解产物中，以原料质量计算，添加其质量3％的食盐。
[0114]
优选的实施方式为：以原料质量的5％加入米曲霉种曲，混合后作为第一次发酵，发酵时间为3d，发酵温度为28℃。
[0115]
优选的实施方式为：以原料质量的1％加入植物乳杆菌进行第二次发酵，发酵时间为1.5d，发酵温度为30℃。
[0116]
优选的实施方式为：以原料质量的1％添加酵母菌进行第三次发酵，发酵时间为2.5d，发酵温度为30℃。
[0117]
实施例3：一种鱼露的制备方法
[0118]
一种鱼露的制备方法，包含如下步骤：
[0119]
步骤1：米曲霉种曲的制备、植物乳杆菌接种物的制备和酵母菌接种物的制备；
[0120]
步骤2：原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，加水后制成肉糜；
[0121]
步骤3：在肉糜中加入风味蛋白酶进行酶解，得到酶解产物；
[0122]
步骤4：加菌发酵：在酶解产物中依次加入米曲霉种曲、植物乳杆菌接种物和酵母
菌接种物进行发酵，获得发酵产物；
[0123]
步骤5：发酵完成后过滤分离固体滤渣、对滤液进行巴氏杀菌后得到鱼露。
[0124]
优选的实施方式为：所述米曲霉种曲的制备包括：
[0125]
将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，30℃培养80d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液于经灭菌的麸皮培养基中，在32℃条件下培养48h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲，米曲霉为as3.042米曲霉；
[0126]
植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在40℃下培养48h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在40℃下培养28h，获得接种物，将液体培养基在4000rpm/min的转速下离心，倒掉上清液，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水制成菌悬液；
[0127]
酵母菌接种物的制备：将活化后的汉逊德巴利酵母菌划线接种在pda琼脂培养基中、40℃下培养50h后，用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为9log cfu/m l。
[0128]
优选的实施方式为：麦麸培养基的组成为：麸皮55重量份，水55重量份，粉碎的鳜鱼下脚料6重量份，在121℃下灭菌30min；
[0129]
优选的实施方式为：植物乳杆菌接种物的浓度为10log cfu/m l；
[0130]
优选的实施方式为：每升mrs琼脂培养基含有：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温80 1.0g、琼脂15-20g，ph6.5
±
0.2，121℃下灭菌20min；mrs液体培养基与mrs琼脂培养基不同之处在于，不添加琼脂；pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，自然ph；培养基制备方法：将马铃薯先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用4层纱布过滤于锥形瓶中，在滤液中加入葡萄糖和琼脂，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，115℃灭菌20min。
[0131]
优选的实施方式为：风味蛋白酶的酶活≥30000u/g,有效温度为60℃，最佳温度为55℃，最适ph为7；按照底物重量的2％添加，酶解时间为8h，酶解温度为55℃。
[0132]
优选的实施方式为：加入米曲霉种曲之前，在酶解产物中，以原料质量计算，添加其质量8％的食盐。
[0133]
优选的实施方式为：以原料质量的10％加入米曲霉种曲，混合后作为第一次发酵，发酵时间为5d，发酵温度为32℃。
[0134]
优选的实施方式为：以原料质量的2％加入植物乳杆菌进行第二次发酵，发酵时间为2.5d，发酵温度为40℃。
[0135]
优选的实施方式为：以原料质量的2％添加酵母菌进行第三次发酵，发酵时间为3.5d，发酵温度为40℃。
[0136]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

技术特征：
1.一种鱼露的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：步骤1：米曲霉种曲的制备、植物乳杆菌接种物的制备和酵母菌接种物的制备；步骤2：原料预处理：将鳜鱼下脚料清洗干净，加水后制成肉糜；步骤3：在肉糜中加入风味蛋白酶进行酶解，得到酶解产物；步骤4：加菌发酵：在酶解产物中依次加入米曲霉种曲、植物乳杆菌接种物和酵母菌接种物进行发酵，获得发酵产物；步骤5：发酵完成后过滤分离固体滤渣、对滤液进行巴氏杀菌后得到鱼露。2.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：所述米曲霉种曲的制备包括：将活化后的米曲霉划线于马铃薯葡萄糖平板上，28-30℃培养65-80d；用无菌生理盐水制备米曲霉孢子液，移取1ml孢子液于经灭菌的麸皮培养基中，在28-32℃条件下培养36-48h，待麦麸培养基中长出淡黄绿色的米曲霉即可作为备用发酵种曲，米曲霉为as3.042米曲霉；植物乳杆菌接种物的制备：将植物乳杆菌用接种环从斜面上转接到在mrs琼脂培养基中进行活化，在30-40℃下培养36-48h，将得到的培养物再用接种环转接到mrs液体培养基中，在30-40℃下培养24-28h，获得接种物，将液体培养基在3000-4000rpm/min的转速下离心，倒掉上清液，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水制成菌悬液；酵母菌接种物的制备：将活化后的汉逊德巴利酵母菌划线接种在pda琼脂培养基中、30-40℃下培养45-50h后，用无菌生理盐水制成菌悬液,调节菌浓度约为8-9 log cfu/m l。3.根据权利要求2所述的鱼露的制备方法，其特征在于：麦麸培养基的组成为：麸皮45-55重量份，水45-55重量份，粉碎的鳜鱼下脚料4-6重量份，在121℃下灭菌30min。4.根据权利要求2所述的鱼露的制备方法，其特征在于：植物乳杆菌接种物的浓度为7-10log cfu/m l。5.根据权利要求2所述的鱼露的制备方法，其特征在于：每升mrs琼脂培养基含有：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温80 1.0g、琼脂15-20g，ph6.5
±
0.2，121℃下灭菌20min；mrs液体培养基与mrs琼脂培养基不同之处在于，不添加琼脂；pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，自然ph；培养基制备方法：将马铃薯先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用4层纱布过滤于锥形瓶中，在滤液中加入葡萄糖和琼脂，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，115℃灭菌20min。6.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：风味蛋白酶的酶活≥30000u/g,有效温度为30-60℃，最佳温度为50-55℃，最适ph为6-7；按照底物重量的1-2%添加，酶解时间为4-8h，酶解温度为45-55℃。7.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：加入米曲霉种曲之前，在酶解产物中，以原料质量计算，添加其质量3-8%的食盐。8.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：以原料质量的5-10%加入米曲霉种曲，混合后作为第一次发酵，发酵时间为3-5d，发酵温度为28-32℃。9.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：以原料质量的1-2%加入植物乳杆菌进行第二次发酵，发酵时间为1.5-2.5d，发酵温度为30-40℃。
10.根据权利要求1所述的鱼露的制备方法，其特征在于：以原料质量的1-2%添加酵母菌进行第三次发酵，发酵时间为2.5-3.5d，发酵温度为30-40℃。

技术总结
一种鱼露的制备方法，通过加酶加菌连续发酵缩短鱼露的发酵周期，风味蛋白酶由米曲霉发酵制备而成，包含了内切蛋白酶和外切肽酶，可以去除低水解度产物的苦肽链，特异性地分解大分子蛋白；米曲霉中具有多种复合蛋白酶，可以将风味蛋白酶未剪切的肽链接着分解成小分子肽或者氨基酸；植物乳杆菌可以抑制副产物中携带的微生物，并降低鱼露中的生物胺，提高安全性；德巴利酵母具有分解乳糖、乳酸盐和蛋白质的能力，且代谢可产香味，通过添加酵母菌来改善鱼露的风味。善鱼露的风味。善鱼露的风味。


技术研发人员：杨柳 陈亚林 丁逸宁 孙汉巨 吴永祥
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/9/7