聚A标记的产品的纯化的制作方法

聚a标记的产品的纯化
发明领域
1.本发明涉及从合成或生物组合物纯化多标记的产品，例如mrna的方法。所述方法包括将组合物与寡d(t)-官能化的色谱介质接触，所述色谱介质包含基于对流的色谱材料。
2.背景
3.信使rna(mrna)是分子生物学的中心教条中的关键中介物。单链mrna从基因的dna链之一转录并与之互补，并且其蛋白质编码区指定蛋白质的氨基酸序列。在mrna作为蛋白质编码模板的角色之前，mrna通过一系列事件进行处理，这些事件主要发生在细胞核中，无论是转录后还是与从dna基因模板的转录同时发生。这些关键事件包括5'-加帽、内含子剪接、3'端的聚腺苷酸化(聚a)以及从细胞核到细胞质的穿梭。所有这些特征都有其自己的目的，对于整体mrna稳定性和翻译效率的调节至关重要。5'帽和聚a尾都是mrna的独特特征。
4.合成mrna领域的技术进步使合成mrna成为人们关注的焦点，并且目前在针对各种疾病的若干临床前和临床研究中进行评估。
5.通过体外转录(ivt)生产合成mrna涉及关键组分1)dna模板，2)核糖核苷酸和3)rna聚合酶。utr序列和蛋白质编码序列由dna模板定义。3'聚a尾可以在dna模板内设计，也可以不在dna模板内设计。如果包括在dna模板中，则聚a尾的长度是可控的，而当不在dna模板内设计时，可以使用聚a聚合酶的ivt后聚a加尾。存在几种不同的5'加帽策略，有共转录和转录后方法。
6.寡(dt)产品通常用于“开放式纯化系统”，例如磁性颗粒或离心柱。在杂交期间(结合阶段)，mrna聚a-尾在高盐缓冲液中与寡(dt)配体杂交。高电导率限制了聚a的带负电荷主链与寡(dt)配体的静电排斥。然后进行洗涤并使用破坏ta对的稳定性并允许洗脱的低电导率缓冲液或水温和洗脱。在杂交或洗涤阶段期间，不需要的污染物，例如蛋白质、未反应的核糖核苷酸、dna、cap类似物和缺少聚a部分的部分转录物，不会保留在固体载体上。
7.磁性产品的寡(dt)配体的长度范围通常在14-30个核苷酸之间。小粒径提供了大的颗粒表面积/ml，并且颗粒的尺寸范围通常在1-5μm之间。小规模mrna纯化的方案长度通常短于1h。值得注意的是，这些产品被设计并且通常用于从细胞裂解物中纯化mrna池，而不是用于从ivt反应中纯化mrna。此外，已知的产品被设计为在微量离心管中操作，并且鉴于其小尺寸，以及因此低磁性，这些产品中的任何一种都完全不可能扩展用于处理较大的样品体积。此外，与更传统的色谱树脂相比，作为色谱介质填充的这种小颗粒具有显著受损的流动性质。
8.此外，使用已知的吸附材料进行色谱mrna分离存在若干缺点。
9.涉及膜和整料的分离可以在远高于基于多孔珠的系统的流速下运行，典型的停留时间为大约0.2-0.5分钟。然而，在动态流动下，整料和膜在10％靶标穿透时的典型结合容量低于多孔珠。整料和膜材料的结合容量较差(与基于多孔珠的材料相比)可以通过利用较高的流速在一定程度上抵消。在(膜)吸附色谱中，与凝胶渗透色谱相比，流体的组分(例如单个分子、缔合物或颗粒)结合至与流体接触的固体表面，而无需通过扩散在孔中传输，并且分子可以通过对流传输到达固相的活性表面。膜吸附器相对于填充色谱柱的优势在于它
们适合以更高得多的流速运行。
10.这也称为基于对流的色谱。基于对流的色谱基质包括任何基质，其中在基质的流入和流出之间施加液压差迫使基质灌注，实现物质实质上对流传输进入基质或离开基质，这在高流速下非常迅速地发生。
11.基于对流的色谱和膜吸附器在例如us20140296464a1、us20160288089a1、us2019308169a1和us2019234914a1中描述，特此全文并入作为参考。
12.需要能够从体外转录(ivt)反应分离mrna以使治疗性产品能够以工业规模回收的色谱材料。色谱材料还应共有基于多孔珠的材料具有所需分子的高结合容量，以及整料/膜材料可实现的较高流速。色谱材料还必须是充分多孔的，因此大的mrna能够到达结合区域，从而可实现适当高的流速。
13.发明简述
14.发明人已发现，基于对流的色谱材料可用寡d(t)配体官能化，并用于从不需要的材料分离聚a标记的产品，例如mrna。他们已发现这种材料在停留时间低至10秒时具有很高的mrna容量。本发明中使用的材料提供了最佳的孔径分布，为聚a标记的产品提供了高结合容量。孔隙率足够大，使得扩散与获得最大结合容量无关。寡dt与聚a标记的产品之间的相互作用对停留时间具有决定性作用。
15.在一个实施方案中，本发明涉及从体外转录(ivt)反应纯化合成的mrna的方法。所述方法包括将样品与本发明的官能化色谱材料接触。
16.在第一方面，本发明涉及从包含聚a标记的产品的组合物回收所述产品的方法，所述方法包括将组合物与色谱材料接触，所述色谱材料包含用寡(dt)-配体官能化的基于对流的色谱材料。
17.所述寡(dt)-配体优选为(d)t
10-50
配体，更优选为(d)t
12-30
配体。
18.根据本发明，色谱材料上的寡(dt)-配体密度为10-20μmole/g。优选地，寡(dt)-配体通过c3-c12接头，例如c6或c12接头与色谱材料偶联。
19.色谱材料可包含一种或多种非织造聚合物纳米纤维，优选纤维素纳米纤维。可选地，色谱材料包括3d打印的材料。进一步的实例可以在下面的发明详细部分中找到。
20.优选地，色谱材料呈一个或多个膜或片的形式，并且所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片以及任选的一个或多个滤板或其它间隔材料的支架。
21.可选地，在膜或片之间放置可加热的金属结构，这有助于在设备加热时洗脱聚a标记的产品。
22.根据本发明，所述组合物与官能化的色谱介质接触10-15秒的时间。
23.一种使用设备的方法包括以下步骤：
24.(i)将组合物与官能化的色谱介质接触；
25.(ii)任选地用低离子浓度的液相洗涤官能化的色谱介质；和
26.(iii)通过将官能化的色谱介质与低/极低离子强度的液相接触，选择性地洗脱聚a标记的产品和产品相关杂质。
27.在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
28.(i)将包含组合物的溶液与官能化的色谱材料接触；和
29.(ii)收集在步骤(i)中接触官能化的色谱材料的溶液，所述溶液包含聚a标记的产
品。
30.所述方法可在不进行原位清洗(cip)的情况下重复至少10次。
31.在第二方面，本发明涉及一种色谱材料，所述色谱材料包含用寡d(t)-配体官能化的基于对流的色谱材料。
32.所述色谱材料包含例如聚合物纳米纤维或3d打印的结构。
33.所述色谱材料优选呈一个或多个膜或片的形式。当提供至少两个膜或片时，在两个膜或片之间可任选地提供至少一个可加热的金属结构，例如金属网。该结构可在洗脱聚a标记的产品期间被加热。
34.附图简述
35.图1a是显示用寡d(t)配体(fibro)官能化的本发明的色谱材料上对于不同长度的mrna的动态结合容量(dbc)的图；图1b是显示不同mrna的长度以及其不同性质和运行参数的表格；和
36.图2a是显示与图1a-b相同的材料上在10％动态结合容量(dbc)下的流速影响的图；图2b是显示图2a所示的各种停留时间的结果的表格。
37.图3是分别显示两种不同配体长度(dt)30和dt(20)的动态结合容量和配体密度的图。
38.图4是显示使用与图3相同的配体长度，两种不同的接头c12和c6对动态结合容量的影响的图。
39.图5是显示如实施例部分所述的在无需原位清洗(cip)的情况下对于10个连续循环的压力曲线的图。
40.图6a是显示如实施例部分所述的运行1的电导率和吸光度结果的色谱图。图6b是显示如实施例部分所述的运行2的电导率和吸光度结果的色谱图。
41.图7显示了如实施例部分所述的计算动态结合容量(dbc)的穿透曲线。
42.发明详述
43.现在将结合一些非限制性实施例和附图更紧密地描述本发明。
44.根据本发明的色谱材料包含基于对流的色谱材料。基于对流的色谱材料可以是，例如吸附膜，其中通过这种材料的流动是对流的，而不是扩散的。吸附膜可以例如是聚合物纳米纤维膜，例如纤维素、醋酸纤维素和纤维素纤维，它们已被处理用作吸附剂。作为选择，吸附膜可以是整料材料或通过乳化制成的常规膜。另一种选择是3d打印的材料。
45.任选地，吸附膜包含聚合物纳米纤维。通常，聚合物纳米纤维呈一个或多个非织造片的形式，每个片包含一个或多个所述聚合物纳米纤维。包含一个或多个聚合物纳米纤维的非织造片是所述一个或多个聚合物纳米纤维的垫子，其中每个纤维基本上是随机取向的，即，它没有被制造成使得所述一个或多个纤维采用特定的模式。包含聚合物纳米纤维的非织造片通常由已知的方法提供。在某些情况下，非织造片可由单一聚合物纳米纤维组成。或者，非织造片可以包含两个或更多个聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个聚合物纳米纤维。
46.所述聚合物纳米纤维可以是电纺聚合物纳米纤维。这种电纺聚合物纳米纤维是本领域技术人员公知的。也可以使用生产聚合物纳米纤维的替代方法，例如拉延。
47.用于本发明的聚合物纳米纤维通常具有10nm至1000nm的平均直径。对于某些应
用，平均直径从200nm到800nm的聚合物纳米纤维是合适的。平均直径从200nm到400nm的聚合物纳米纤维可能适用于某些应用。
48.用于本发明的聚合物纳米纤维的长度没有特别限制。因此，传统的方法，例如电纺，可以生产数百米或甚至数千米长的聚合物纳米纤维。然而通常，所述一个或多个聚合物纳米纤维的长度为至多10km，优选10m至10km。
49.非织造片通常具有1至40g/m2的面积密度，优选5至25g/m2，在某些情况下1至20或5至15g/m2。
50.非织造片通常具有5至120μm的厚度，优选10至100μm，在某些情况下50至90μm，在其它情况下5至40、10至30或15至25μm。
51.用于生产用于本发明的方法的纳米纤维的聚合物没有特别限制，前提是该聚合物适合用于色谱应用。因此通常，聚合物是适合在色谱方法中用作色谱介质，即吸附剂的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺(例如尼龙)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚砜(例如聚醚砜(pes))、聚己内酯、胶原蛋白、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、醋酸琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素及其组合。聚醚砜(pes)、纤维素和醋酸纤维素是优选的。在某些情况下，纤维素和醋酸纤维素是优选的。
52.通常，官能化的色谱材料是官能化的纤维素色谱材料。优选地，官能化的色谱材料由一个或多个非织造片形成，每个非织造片包含一个或多个纤维素或醋酸纤维素纳米纤维。醋酸纤维素例如通过电纺，很容易形成纳米纤维，并且在电纺后可以很容易地转化为纤维素。
53.尽管在特别优选的实施方案中，官能化的色谱材料包含一个或多个聚合物纳米纤维，但在替代的实施方案中，官能化的色谱材料可包含一个或多个任何类型的聚合物纤维。这种聚合物纤维可以具有与上述纳米纤维相同的任何或所有特性。通常，这种聚合物纤维可具有从10nm到1000μm，优选从10nm到750μm，更优选从10nm到500μm，甚至更优选从10nm到400μm，甚至更优选从10nm到300μm，甚至更优选从10nm到200μm，甚至更优选从10nm到100μm，甚至更优选从10nm到75μm，甚至更优选从10nm到50μm，甚至更优选从10nm到40μm，甚至更优选从10nm到30μm，甚至更优选从10nm到20μm，甚至更优选从10nm到10μm，甚至更优选从10nm到5μm，甚至更优选从10nm到4μm，甚至更优选从10nm到3μm，甚至更优选从10nm到2μm，甚至更优选从10nm到1μm(1000nm)的平均直径。
54.所述纳米纤维用寡(dt)-配体，例如(d)t
10-50
配体，优选(d)t
12-30
进行官能化。
55.使用聚合物纳米纤维的多个非织造片能够制备具有较大吸附容量的较厚材料。因此，官能化的色谱介质通常通过提供一个在另一个之上堆叠的两个或更多个非织造片，每个所述片包含一个或多个聚合物纳米纤维，并同时加热和压制片堆叠以熔合相邻片的纳米纤维之间的接触点来形成。
56.压制和加热聚合物纳米纤维/非织造片的优选加工条件可以在wo-a-2015/052460和wo-a-2015/052465中找到，其全部通过引用并入本文。
57.官能化的色谱材料具有取决于mrna的尺寸的动态结合容量(dbc)，并且具体示例在下面的实施例中给出。10％穿透的dbc可以根据标准方法，例如使用akta pure系统或等效的fplc系统确定。
58.10％穿透的dbc通常根据以下测定方法确定：
59.1)使加载材料通过包含在aktapure系统(cytiva)上的支架内的官能化材料；
60.2)在确定的膜体积/分钟流速(mv/min)下加载材料，直到支架出口后的浓度超过加载浓度的10％，如通过uv流动池测定的；
61.3)考虑系统和支架装置中的死体积，通过在unicorn软件(cytiva)中分析色谱图，确定在10％穿透时加载到盘上的蛋白质总量。
62.官能化的色谱材料可以容纳在色谱柱或支架中。所述柱通常包含本发明的一种或多种官能化的色谱介质。所述柱通常是圆柱形的。
63.通常，色谱柱包含堆叠或缠绕在通常圆柱形的支架内的本发明的一种或多种官能化的色谱介质。色谱柱可以设计为在轴向或径向流动下操作。
64.本发明的方法可以在高流速下操作。因此，通常在本发明的色谱过程中，组合物与官能化的色谱材料接触1分钟或更短的时间，优选低至10秒。
65.在mrna纯化中，将样品引入柱捕获色谱系统，例如在本发明中使用的官能化的色谱材料，其被配置为用于循环纯化过程以提取目标产品。循环过程包括将进料加载到装置上，清洗装置，洗脱目标产品，然后在用新进料加载装置之前清洁装置。理想的是在装置需要清洁之前能够运行装置数个循环。
66.通常，本发明的方法包括以下步骤：
67.(i)将本文定义的组合物与本文定义的官能化的色谱材料接触；
68.(ii)在高离子强度下加载，任选用与加载相同的缓冲液和/或较低离子强度洗涤官能化的色谱材料；和
69.(iii)通过将官能化的色谱材料与低/极低离子强度的液相(例如水)接触，选择性地洗脱mrna产品和产品相关杂质。
70.在洗脱步骤之后，所述方法还可以包括再生官能化的色谱材料的步骤。通常，这通过使mrna产品和/或产品相关杂质已从中洗脱的官能化的色谱材料与缓冲液接触来实现。这可以按照已知用于此类色谱方法的再生阶段的常规方法进行。
71.通常，根据本发明的回收mrna产品的方法包括单个结合-洗脱步骤或单个流通步骤。或者，根据本发明的方法可以包括串联的一个以上的结合-洗脱步骤，例如两个、三个、四个、五个或更多个结合-洗脱步骤。或者，根据本发明的方法可以包括串联的一个以上的流通步骤，例如两个、三个、四个、五个或更多个流通步骤。或者，根据本发明的方法可以包括串联的结合-洗脱和流通步骤的组合，例如总共两个、三个、四个、五个或更多个步骤。
72.实验部分
73.材料和方法
74.本发明中生成和呈现的数据是在具有在基于对流的色谱材料上固定的寡(dt)
30
配体或寡(dt)
20
配体的原型设备上进行的。原型a是用胺化的c6接头固定在fibro vs(乙烯基砜)膜上的寡(dt)
20
配体。
75.寡-dt配体的合成
76.所有寡-dt配体均采用以下标准循环来合成：酸催化的脱三苯甲基化(3％v/v二氯乙酸/甲苯)、偶联(5-(苄基巯基)-1h-四唑(bmt)作为活化剂，0.3m/乙腈)、加帽(cap a，20％v/vn-甲基咪唑/乙腈以及等体积的b1(40％v/v乙酸酐/乙腈)和b2(60％v/v二甲基吡啶/乙腈)作为cap b原位混合用于加帽)，以及基于碘的氧化(0.05m碘/含10％v/v水的吡
啶)，使用在自动化固相合成仪( oligopilotplus 100)上的5g unylinker聚苯乙烯载体和β-氰乙基亚磷酰胺单体。将亚磷酰胺单体在无水乙腈中溶解至0.150m的浓度，并在分子筛(0.3nm，rods 1.6mm)的存在下使用。未修饰的亚磷酰胺使用的循环时间为3min(1.8摩尔当量)，并且胺间隔基亚磷酰胺使用的循环时间为5min(2.5摩尔当量)。发现逐步偶联效率为》99.0％。寡聚物配体合成后，通过在55℃下用25％nh3水溶液处理树脂12-16小时，进行从固体载体的裂解和保护基团的脱保护。此外，收集上清液并用水和50％etoh/水洗涤载体。在旋转蒸发器上将集合的级分蒸发。将粗配体沉淀溶解在水中，并在uv-vis分光光度计中在260nm处测量浓度。在iex-uplc上以tris和高氯酸钠作为运行缓冲液分析配体的纯度。
77.因为制备用于固定的配体，优选使用胺化配体代替硫醇化配体，尽管可以使用其中任何一种。硫醇化配体提供有接头作为二聚体，其然后需要还原和脱盐步骤，然后与纤维反应。胺化配体提供有末端胺基团，其能够在无需任何事先反应的情况下与纤维反应。两种配体的合成中存在细微差异，例如硫醇或亚酰胺(amidite)的不同摩尔当量(5-10)、循环时间(10-40分钟)、用于氧化的碘浓度(20-50mm)、氧化时间(2-4分钟)。
78.缩水甘油乙烯基砜纤维素膜(fibro-vs)的制备
79.用蒸馏水(4x600ml)洗涤50个醋酸纤维素圆盘。除去洗涤液，用350ml 0.5m koh溶液代替。用koh溶液搅拌处理圆盘10分钟，然后加入100ml缩水甘油。将反应介质在圆盘上剧烈搅拌2小时。在此之后，除去上清液并用蒸馏水(4x600ml)洗涤圆盘，得到干净的中间体，其无需进一步修改用于下一步骤。
80.此后，从缩水甘油步骤中取出25个圆盘，并悬浮在含有37.5gna2co3和150ml mecn的500ml h2o中。将混合物剧烈搅拌，同时在60分钟内滴加100ml二乙烯基砜。然后将反应混合物剧烈搅拌16小时。在此之后，倾析上清液，并用600ml丙酮:h2o(1:1)洗涤圆盘3次以及用蒸馏水(1x600ml)洗涤。干净的中间体无需进一步修改用于下一步骤。
81.硫醇化寡dt-配体对fibro vs膜的官能化
82.将硫醇化寡dt溶液在 pure上用50ml脱盐柱脱盐至150mm nacl。使用25mm dtt、0.1m nahco3、0.01m na2co3还原所得溶液1小时，然后如前所述进一步脱盐。所得溶液使用20ml vivaspin柱mwco 5kda浓缩。然后将溶液稀释至5.9mg/ml，并加入至可密封容器中的fibro vs片，然后添加硫酸钠(～3g)。将容器密封并置于轨道振荡器上16小时。在此之后，弃去上清液并将di水(50ml)加入至每个托盘。在执行任何进一步的步骤之前，这总共重复了5次。
83.胺化寡dt-配体对fibro vs膜的官能化
84.将胺化寡dt样品溶解在150mmnacl缓冲液(50ml)中。通过向寡dt溶液(7ml)中加入di水(43ml)，将溶液稀释至6.2mg/ml的浓度和50ml的体积。加入硫酸钠(7.1g)并测量ph。将该溶液添加至可密封容器中的fibro vs的t1片，并放置在轨道振荡器上16小时。在此之后，弃去上清液并将di水(50ml)加入托盘，然后放回轨道振荡器上。在执行任何进一步的步骤之前，此过程重复4次。
85.二乙烯基砜反应性基团的阻断
86.为了阻断用寡dt官能化的fibro vs上任何剩余的乙烯基砜基团，通过在搅拌下将磷酸氢二钠十二水合物(3.58g)和edta二钠二水合物(37mg)溶解在水(95ml)中，制备硫代
甘油的磷酸盐缓冲溶液(2.5v/v％硫代甘油，ph 8.3)。加入硫代甘油(2.5ml)，并使用饱和naoh溶液将所得溶液碱化至ph 8.3并稀释至100ml。
87.将官能化材料的片置于可密封容器中并浸没在25ml缓冲硫代甘油溶液中，然后在轨道振荡器上放置至少16小时。在此之后，弃去硫代甘油溶液，并将di水(50ml)加入至片，然后放回轨道振荡器上至少15分钟。这个洗涤过程再重复3次。将最后的洗涤替换为甘油:乙醇:水(50ml，20:20:60v/v％)并浸泡1小时，然后取出湿品，再注塑到所需的装置中。
88.fibro寡dt20原型a的结合容量分析
89.材料
90.mrna：通过体外转录产生未加帽的flucv01(2000nt，具有100nt聚a尾)，并通过licl沉淀纯化以达到94％或更高的纯度。将mrna以约2mg/ml浓度重悬于水中，并在-20℃储存，直到用于色谱实验。
91.色谱柱：将fibro寡dt20(原型a)以1层膜填装在peek设备中，最终柱体积为0.2ml。
92.溶液：
93.在无rnase的水中制备的nacl 5m
94.edta 500mm，ph 8.0(无rnase)
95.tris 1m，ph 7.5(无rnase)
96.结合缓冲液(入口a1)：nacl 300mm，tris 10mm，edta 1mmph7.5
97.洗脱缓冲液(入口b1)：无rnase的水
98.原位清洗缓冲液(入口b2)：naoh 0.1m
99.方法：
100.运行1
101.对于第一次运行，通过用无rnase的水稀释原液mrna，制备5ml 0.6mg/ml的flucv01 mrna，然后使用原液调节nacl、tris和edta浓度，使mrna样品含有nacl 300mm、tris 10mm、edta 1mmph 7.5。将样品加载到superloop上，并首先通过旁路注入，以通过监测uv 260nm来测量amax(或100％穿透)。为了测量动态结合容量(dbc)，将mrna样品注入到含有0.2ml fibro寡dt20(原型a)的peek设备上，同时连续监测260nm处的uv、电导率、柱前压力和其它因素。所有阶段均使用2ml/min的流速，但在样品应用期间，流速设置为0.4ml/min以实现30s停留时间。洗脱后，合并含有mrna的级分以计算回收百分比。
102.以下阶段用于结合和洗脱mrna。
[0103]-平衡：来自入口a1的8ml结合缓冲液
[0104]-样品应用：在amax的50％时中断样品应用，或直到superloop耗尽
[0105]-未结合物洗涤：来自入口a1的2ml结合缓冲液
[0106]-洗脱：来自入口b1的8ml无rnase的水
[0107]
以下阶段用于洗涤柱并为下一次实验做准备
[0108]-柱水洗涤：来自入口b1的8ml无rnase的水
[0109]-cip：来自入口b2的8ml 0.1mnaoh
[0110]-平衡：来自入口a1的8ml结合缓冲液
[0111]
由以下公式计算dbc：
[0112]
图7显示了计算dbc的穿透曲线。
7.5；b1：水；b2：naoh 0.1m；系统流速：2ml/min，加载除外。
[0131]
结果
[0132]
图1a-b显示了不同长度的mrna可以用本发明的官能化的色谱介质成功纯化。原型a是寡(dt)
20
配体，用胺化c6接头固定在fibro vs膜上。如图1b的表格所示，mrna长度在约400nt至4100nt之间。
[0133]
图2a显示了在不同停留时间(rt)下流速对动态结合容量的影响效果。在图中从左到右，曲线分别表示以下停留时间：7.5秒、15秒、30秒、60秒、2分钟、4分钟、8分钟和20分钟。洗脱数据、10％dbc(mg/ml)、静态结合容量和压力如图2b所示。
[0134]
图3显示了寡(dt)配体长度对动态结合容量和配体密度的影响。通过加载在结合缓冲液中稀释的聚(da)
30
寡核苷酸(mrna替代物)直至10％穿透(24秒停留时间)，测定动态结合容量。结合缓冲液由10mm tris、400mmnacl、1mm edtaph 7.4组成。配体密度通过phosphor icp-sfms测定。
[0135]
图4显示了配体接头对动态结合容量的影响。如图3所述，测定动态结合容量。
[0136]
图5显示了在没有cip的情况下连续10个循环的一致压力曲线。这些运行使用聚(da)
30
寡核苷酸作为mrna替代物进行，如图3所示。
[0137]
原型的优异流动特性优选用于较大的设备。50ml设备可能提供可接受的容量，并且与0.4ml设备的2500分钟相比，对于1l进料具有对应于20分钟的缩短加载时间。
[0138]
动态结合容量(dbc)实验
[0139]
在两个独立的实验中，使用内部生产的mrna在pure色谱系统中测试了fibro寡dt20(原型a)的动态结合容量。
[0140]
运行1
[0141]
图6a显示了运行1的色谱图。
[0142]
由于对于本次运行，在样品耗尽之前没有检测到穿透，因此dbc只能估计为大于当前结合的质量dbc*。
[0143]
dbc》dbc*＝结合的mrna质量(mg)/柱体积(ml)＝0.6mg/ml*5ml/0.2ml＝15mg/ml。
[0144]
运行2
[0145]
图6b显示了运行2的色谱图。
[0146]
尽管在运行2期间加载了更多的mrna，但在样品耗尽之前仍未检测到穿透，dbc只能估计为大于当前结合的质量dbc*。
[0147]
dbc》dbc*＝结合的mrna质量(mg)/柱体积(ml)＝0.29mg/ml*14ml/0.2ml＝20.3mg/ml。
[0148]
这两个实验显示了与市场上可用的其它寡dt形式相比，fibro寡dt的优异性能。对于2000bp的m-rna，dbc在15至20mg/ml的范围内，停留时间小于1分钟，并且产率高于85％，结果在表2中概述。
[0149]
使用的接头是c6胺化的，如果使用c12胺化的接头，dbc可以进一步改进，如图7中的数据所示。
[0150][0151]
表2：在peek设备中用m-rna(2000bp)的寡dt20c6运行的结果概述。

技术特征：
1.一种从包含聚a标记的产品的组合物回收所述产品的方法，所述方法包括将所述组合物与色谱材料接触，所述色谱材料包含用寡(dt)-配体官能化的基于对流的色谱材料，其中所述寡(dt)-配体是(d)t
10-50
配体，优选(d)t
12-30
配体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚a标记的产品是mrna或携带遗传信息到核糖体以翻译成氨基酸序列，即肽或蛋白质的任何聚合物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述色谱材料上的寡(dt)-配体密度为10-20μmole/g。4.根据上述一项或多项权利要求所述的方法，其中所述寡(dt)-配体通过接头，例如c3-c12接头与色谱材料偶联。5.根据上述一项或多项权利要求所述的方法，其中所述寡(dt)-配体被硫醇化或胺化。6.根据上述一项或多项权利要求所述的方法，其中所述色谱材料包含一种或多种非织造聚合物纳米纤维，优选纤维素纳米纤维。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱材料呈一个或多个膜或片的形式。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱材料呈膜或片的形式，并且所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片以及任选的一个或多个滤板或其它间隔材料的支架或柱。9.根据权利要求8所述的方法，其中在膜或片之间放置可加热的金属结构。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物与官能化的色谱材料接触1分钟或更短的时间，例如低至10秒。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括以下步骤：(i)使所述组合物与官能化的色谱材料接触；(ii)任选地用低离子浓度的液相洗涤官能化的色谱材料；和(iii)通过将官能化的色谱介质与低/极低离子强度的液相接触，选择性地洗脱聚a标记的产品和产品相关杂质。12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，包括以下步骤：(i)将包含所述组合物的溶液与官能化的色谱材料接触；和(ii)收集在步骤(i)中接触官能化的色谱材料的溶液，所述溶液包含聚a标记的产品。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述方法在不进行原位清洗(cip)的情况下重复至少10次。14.一种色谱材料，其包含用寡d(t)-配体官能化的基于对流的色谱材料，其中所述材料包含聚合物纳米纤维并且呈一个或多个膜或片的形式，其中所述寡(dt)-配体是(d)t
10-50
配体，优选(d)t
12-30
配体。15.根据权利要求13所述的色谱介质，其包含在所述配体和基于对流的材料之间的c3-c12接头。16.根据权利要求15所述的色谱介质，其中所述接头为c12接头，并且所述寡(dt)-配体为寡d(t)
20
配体。17.根据权利要求14、15或16所述的色谱介质，其中提供至少两个膜或片，并且在两个膜或片之间提供至少一个可加热的金属结构。

技术总结
本发明涉及从合成或生物组合物纯化多标记产品，例如mRNA的方法。所述方法包括将组合物与寡d(T)-官能化色谱介质接触，所述色谱介质包含基于对流的色谱材料。质包含基于对流的色谱材料。质包含基于对流的色谱材料。


技术研发人员：P
受保护的技术使用者：思拓凡生物工艺研发有限公司
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/9/16