改进细胞培养物中的蛋白质滴度的方法与流程

改进细胞培养物中的蛋白质滴度的方法
1.本技术要求于2021年1月20日提交的美国申请序列号63/139,494的优先权，并且通过引用并入。
技术领域
2.本发明涉及用于培养细胞以改进滴度并且用于产生重组蛋白的方法。本发明具体地涉及用于使用杂质减少的培养基培养细胞以改进滴度并且用于产生蛋白质生物制药的方法，以及细胞和根据所述方法生长的细胞培养物和由所述细胞和所述细胞培养物产生的蛋白质。


背景技术：

3.生物药剂，尤其是蛋白质和多肽，通常被开发为新型生物制药产品。产生高水平的特定所关注蛋白质的经工程化的细胞对于这些生物制药产品的成功商业生产已经变得至关重要。细胞培养条件的控制和优化各不相同，并且对细胞培养中产生的治疗性蛋白质的水平和质量有很大影响。
4.通常在分批或补料分批过程中通过细胞培养来制备蛋白质。小瓶解冻之后接种物生长的早期阶段包含在种子培养物中培养细胞。通常，细胞以指数生长速率生长，如在种子扩大培养生物反应器中，以使细胞群体的大小和/或体积逐渐增大。在细胞团块通过几个生物反应器阶段按比例增加之后，在细胞仍处于指数生长(对数期)的同时，然后将细胞转移到补料分批生产生物反应器中(gambhir,a等人,2003,《生物科学和生物工程杂志(j bioscience bioeng)》95(4):317-327)。
5.在转移至补料分批培养后，将细胞培养一定时间段，而对培养基的组成进行监测和控制以允许所关注蛋白质或多肽的产生。在达到特定产率或细胞活力、废物积累或营养物耗竭确定培养应该终止后，分离所产生的蛋白质或多肽。在过去十年，为了改进重组蛋白产率，已经取得了许多重要进展，所述重组蛋白产率目前达到了每升几克的滴度。蛋白质制备工艺的进步，以及细胞系工程化和细胞培养基和补料开发的进步，都有助于蛋白质产率的增益。例如，用于优化细胞培养基和补料的方案包含营养补充和用化学限定的不含血清的培养基支持连续细胞生长和最佳产物分泌的设计。
6.然而，本领域仍然需要用于培养细胞的培养基和方法，其中所述培养基允许健康和稳健的细胞生长和维持，以及重组蛋白的高滴度产生。


技术实现要素：

7.一方面，提供了一种用于在生产重组蛋白时通过培养重组真核细胞来改进重组蛋白滴度的方法。在某些实施例中，所述方法包括(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液，并且具有相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于
约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。
8.在某些实施例中，相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约5％。
9.在某些实施例中，所述真核细胞可以是哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞或酵母细胞。在具体实施例中，所述真核细胞可以为cho细胞。在其它实施例中，所述重组蛋白可以选择fc融合蛋白、受体-fc融合蛋白、trap型蛋白，如trap型蛋白或微型trap蛋白、抗体、抗体片段或scfv-fc融合蛋白或任何其它重组蛋白，包含本技术中公开的那些。
10.在某些实施例中，所述所关注重组蛋白的表达可以在生产期、生长期或两者期间发生。在其它实施例中，所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞在生产期、生长期或两者期间发生。
11.在又其它实施例中，所述方法改进细胞培养性能，包含改进细胞生长，其中所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。
12.在本发明的其它方面中，提供了一种杂质减少的限定细胞培养基。在某些实施例中，所述培养基包括杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液，并且具有相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约800ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(800μmol hepes杂质mw267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约80ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(80μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)。
13.在本发明的又其它方面中，提供了一种用于选择在细胞培养中用于改进细胞培养性能的限定细胞培养基的方法。在某些实施例中，所述方法总体上包括：(a)提供限定细胞培养基，所述限定细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液；(b)分析包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基，以确定所述限定细胞培养基中存在的分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质的量和分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质的量；(c)如果确定包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基具有相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)，则选择包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基用于细胞培养；其中相比于非hepes相关杂质减少的培养基中的细胞培养性能，对具有相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述培养基中的hepes缓冲液的总量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)的包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基的使用会改进细胞培养性能。在某些实施例中，改进的细胞培养性能包含改进的细胞培养滴度和/或细胞生长。
14.在本发明的又其它方面中，提供了一种用于选择在细胞培养用于改进细胞培养性
能的hepes缓冲液的方法。在某些实施例中，所述方法总体上包括：(a)提供4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液；(b)分析所述hepes缓冲液，以确定所述hepes缓冲液中存在的分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质的量和分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质的量；(c)如果确定所述hepes缓冲液具有相对于要结合细胞培养使用的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于要结合所述细胞培养使用的hepes缓冲液的总量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质，则选择所述hepes缓冲液用于所述细胞培养；其中相比于在存在具有较高量的所述杂质的hepes缓冲液的情况下的细胞培养性能，对具有相对于要结合所述细胞培养使用的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于要结合所述细胞培养使用的hepes缓冲液的总量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)的所述hepes缓冲液的使用会改进细胞培养性能。在某些实施例中，改进的细胞培养性能包含改进的细胞培养滴度和/或细胞生长。
15.本发明的其它方面提供了细胞培养物，其包括(i)至少一种重组真核细胞，所述至少一种重组真核细胞可以表达重组蛋白；以及(ii)细胞培养基，其中所述细胞培养物是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。
16.所述真核细胞可以选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞，可以选自由以下组成的组：cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。例如，所述真核细胞可以为cho细胞。
17.所关注重组蛋白的表达可以在生产期、生长期或两者期间发生。所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞可以在生产期、生长期或两者期间发生。所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长可以高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度可以提高至少约5％。
18.所述重组蛋白可以包括fc结构域。所述重组蛋白可以是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。所述重组蛋白选自由以下组成的组：抗pd1抗体、抗pdl-1抗体、抗dll4抗体、抗ang2抗体、抗angptl3抗体、抗pdgfr抗体、抗erb3抗体、抗prlr抗体、抗tnf抗体、抗egfr抗体、抗pcsk9抗体、抗gdf8抗体、抗gcgr抗体、抗vegf抗体、抗il1r抗体、抗il4r抗体、抗il6r抗体、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5
抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗rsv抗体、抗ngf抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗cd48抗体、抗cd3/抗cd20双特异性抗体、抗cd3/抗muc16双特异性抗体以及抗cd3/抗psma双特异性抗体。例如，所述重组蛋白可以选自由以下组成的组：阿利库单抗(alirocumab)、阿替韦单抗(atoltivimab)、玛替韦单抗(maftivimab)、奥西韦单抗(odesivimab)、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗(casirivimab)、伊德维单抗(imdevimab)、西米普利单抗(cemiplimab)、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗(dupilumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗(fasimumab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、曲戈卢单抗(trevogrumab)、利努苏单抗(rinucumab)和沙利鲁单抗(sarilumab)。
19.所述重组蛋白还可以选自由以下组成的组：fc融合蛋白、受体-fc融合蛋白(trap)、微型trap蛋白和scfv-fc融合蛋白或任何其它重组蛋白。
20.本发明的其它方面提供了在细胞培养物中产生的重组蛋白，所述细胞培养物包括(i)至少一种重组真核细胞，所述至少一种重组真核细胞可以表达所述重组蛋白；以及(ii)细胞培养基，其中所述重组蛋白是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。
21.所述真核细胞可以选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞，可以选自由以下组成的组：cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。例如，所述真核细胞可以为cho细胞。
22.所关注重组蛋白的表达可以在生产期、生长期或两者期间发生。所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞可以在生产期、生长期或两者期间发生。所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长可以高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度可以提高至少约5％。
23.所述重组蛋白可以包括fc结构域。所述重组蛋白可以是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。所述重组蛋白选自由以下组成的组：抗pd1抗体、抗pdl-1抗体、抗dll4抗体、抗ang2抗体、抗angptl3抗体、抗pdgfr抗体、抗erb3抗体、抗prlr抗体、抗tnf抗体、抗egfr抗体、抗pcsk9抗体、抗gdf8抗体、抗gcgr抗体、抗vegf抗体、抗il1r抗体、抗il4r抗体、抗il6r抗体、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗rsv抗体、抗ngf抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗cd48抗体、抗cd3/抗cd20双特异性抗体、抗cd3/抗muc16双特异性抗体以及抗cd3/抗psma双特异性抗体。例如，所述重组蛋白可以选自由以下组成的组：阿利库单抗、
阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。
24.所述重组蛋白还可以选自由以下组成的组：fc融合蛋白、受体-fc融合蛋白(trap)、微型trap蛋白和scfv-fc融合蛋白或任何其它重组蛋白。
25.提供了根据本发明的细胞、细胞培养物、重组蛋白和方法。
26.虽然在整个申请中公开多个实施例，但本领域的技术人员从以下详细描述将显而易见本发明的仍其它实施例，以下详细描述示出并描述本发明的说明性实施例。如将认识到的，本发明能够在各个方面进行修改，所有这些修改均不脱离本发明的精神和范围。因此，详细描述被认为本质上是说明性的而不是限制性的。
附图说明
27.图1展示了根据本发明的一个实施例的hepes相关杂质与蛋白质滴度之间的关系。
28.图2a-2b展示了根据本发明的一个实施例的hepes相关杂质与蛋白质滴度之间的负相关。图2a基于来自地点1的数据。图2b基于来自地点2的数据。图2a朝向右侧具有数据点重叠，所述数据点重叠还在图1中在批次1117000128和批次1117000130处描绘。
29.图3在地点1和地点2处展示了根据本发明的一个实施例的hepes相关杂质与蛋白质滴度之间的关系。
30.图4a-4b展示了根据本发明的一个实施例的hepes相关杂质与蛋白质滴度之间的负相关。图4a基于来自地点1的数据。图4b基于来自地点2的数据。图4a具有两次数据点重叠。第一次重叠接近中间，所述重叠还在图3中在批次1117000129和批次1117000138中描绘。第二次重叠朝向右侧，所述重叠还在图3中在批次1117000128和批次1117000130处描绘。
31.图5a展示了hepes杂质的hilic分离。
32.图5b展示了通过混合模式柱分离对hepes杂质的分离。
33.图6a为来自hepes原材料的hepes-[ch4](还被称为“221”)的rp-lcms图。
[0034]
图6b为来自hepes原材料的hepes-[ch4]的hilic-lcms图。
[0035]
图7示出了来自hepes原材料的hepes-[ch4](还被称为“221”)的ms/ms片段化。
[0036]
以下实例仅出于说明性目的提供，并且并不旨在限制本发明的范围。
具体实施方式
[0037]
根据本发明的各方面，已经意外地发现，相对于此类非杂质减少的细胞培养基，对杂质减少的细胞培养基的使用会改进细胞培养性能，包含改进细胞培养中的细胞生长和通过细胞进行的蛋白质产生。
[0038]
更具体地，意外地发现包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液的细胞培养基中的杂质影响细胞培养性能。根据本发明，hepes相关杂质已被鉴定为影响细胞培养性能(例如，蛋白质滴度)，即表现出与细胞培养性能的强烈负相关。在一个实施例中，hepes相关杂质包括分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质、分子量为221.06的hepes相关杂质以及其组合。在某些实施例中，发现相比于不具有此减少量的hepes相关杂质的细胞培养基，对具
有如此减少量的这些hepes相关杂质的细胞培养基的使用会改进细胞培养性能。
[0039]
在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。本文描述的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法进行，并且如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的那样，除非另有说明。参见例如，sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,第3版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.)(2001)以及ausubel等人,《分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》,格林出版协会(greene publishing associates)(1992)、harlow和lane《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(1990)以及julio e.celis,《细胞生物学：实验室手册(cell biology:alaboratory handbook)》,第2版,纽约州纽约的学术出版社(academic press,new york,n.y.)(1998)以及dieffenbach和dveksler,《pcr引物：实验室手册(pcr primer:alaboratory manual)》,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(1995)。
[0040]
定义
[0041]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似或等效于本文所描述的任何方法和材料的那些方法和材料可以用于实践本发明，但现在对特定方法和材料进行描述。
[0042]
在数值和范围的上下文中，术语“约”是指近似于或接近于所叙述值或范围，使得本发明可以如所预期的进行的值或范围，如具有期望的速率、量、程度、增加、减少或表达的程度、浓度或时间，如从本文所包含的教导中显而易见的。因此，此术语包含超出了简单地由系统误差引起的那些值的值。
[0043]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在全文中可互换使用并且是指包括通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。肽、多肽和蛋白质还可以包含修饰，如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和adp-核糖基化。肽、多肽和蛋白质可以具有科学或商业意义，包含基于蛋白质的药物。肽、多肽和蛋白质尤其包含抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。肽、多肽和蛋白质是使用细胞培养方法通过重组动物细胞系产生的。
[0044]
如本文所用，术语“异源多核苷酸序列”是指编码所关注蛋白质的核酸聚合物，如生产为生物制药药物物质的嵌合蛋白(如trap分子)、抗体或抗体部分(例如，vh、vl、cdr3)。异源多核苷酸序列可以通过基因工程化技术(例如，编码嵌合蛋白的序列，或密码子优化的序列，无内含子序列等)制备，并且可以引入到细胞中，在所述细胞中，其可以作为游离体驻留在细胞的基因组中或可以整合到细胞的基因组中。异源多核苷酸序列可以是被引入到产生细胞基因组内的异位位点中的天然存在的序列。异源多肽序列可以是来自另一种生物体的天然存在的序列，如编码人类直系同源物的序列。
[0045]“抗体”是指由四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域，即ch1、ch2和ch3。每个轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(cl)组成。vh区和vl区可以进一步细分为被称作互补决定区(cdr)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(fr)的区。每个vh和vl由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。术语“抗体”包
含提及任何同种型或亚类的糖基化的免疫球蛋白和非糖基化的免疫球蛋白两者。术语“抗体”包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，如从被转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。术语抗体还包含双特异性抗体，所述双特异性抗体包含可以与多于一个不同表位结合的异四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体总体上在美国专利申请公开第2010/0331527号中描述。
[0046]
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包含(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，即包括在铰链区处通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)dab片段(ward等人,(1989)《自然(nature)》241:544-546)，其由vh结构域组成；(vi)分离的cdr；以及(vii)scfv，其由fv片段的两个结构域vl和vh组成，所述两个结构域通过合成接头连接以形成单个蛋白质链，其中vl区和vh区配对以形成单价分子。其它形式的单链抗体，如双抗体也涵盖在术语“抗体”下(参见例如，holliger等人(1993)《美国国家科学院院刊(pnas usa)》90:6444-6448；poljak等人(1994)《结构(structure)》2:1121-1123)。
[0047]
仍进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附分子的一部分，所述较大免疫粘附分子是通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的。此类免疫粘附分子的实例包含使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scfv分子(kipriyanov等人(1995)《人抗体和杂交瘤(human antibodies and hybridomas)》6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标志物肽和c末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scfv分子(kipriyanov等人(1994)《分子免疫学(mol.immunol.)》31:1047-1058)。抗体部分，如fab和f(ab
′
)2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，如通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用本领域公知的标准重组dna技术获得(参见sambrook等人,1989)。
[0048]
术语“人抗体”旨在包含具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr区中，并且具体地在cdr3区中。然而，如本文所用，术语“人抗体”并非旨在包含其中源自另一个哺乳动物物种，如小鼠的种系的cdr序列已经被移植到人类框架序列上的抗体。
[0049]
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体库中分离的抗体、从针对人免疫球蛋白基因而转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，taylor等人,(1992)《核酸研究(nucl.acids res.)》20:6287-6295)，或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，所述方式涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列上。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体经历体外诱变(或者，当使用针对人ig序列而转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系vh和vl序列并与所述人种系vh和vl序列相关，但可能并非天然存在于体内的人抗体种系库内的序列。
[0050]“fc融合蛋白”包括两种或更多种蛋白质的部分或全部，所述蛋白质之一是免疫球蛋白分子的fc部分，所述两种或更多种蛋白质的部分或全部不以其它方式一起存在于自然界中。以下中已经描述了包括与源自抗体的多肽的不同部分(包含fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备，例如，ashkenazi等人,《美国国家科学院院刊》88:10535,1991；byrn等人,《自然》344:677,1990；以及hollenbaugh等人,“免疫球蛋白融合蛋白的构建(construction of immunoglobulin fusion proteins)”,《当代免疫学实验指南(current protocols in immunology)》,增刊4,第10.19.1-10.19.11页,1992。“受体fc融合蛋白”包括与fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施例中，所述fc部分包括铰链区，随后是免疫球蛋白的ch2结构域和ch3结构域。在一些实施例中，fc融合蛋白含有与一种或多种配体结合的两条或更多条不同的受体链。例如，fc融合蛋白是包括fc的trap，例如il-1trap(例如，利纳西普(rilonacept)，其含有与和higg1的fc融合的il-1r1胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利第6,927,044号，或vegf trap(例如，阿柏西普(aflibercept)，其含有与和higg1的fc融合的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利第7,087,411号和第7,279,159号)。
[0051]
此外，还包含微型trap，其是使用多聚化组分(mc)而不是fc部分的trap蛋白，并且在美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中公开。
[0052]
以上的衍生物、组分、结构域、链和片段也包含在内。
[0053]
本文所述的所有数值限制和范围包含与范围或限制的数字有关或在所述数字之间的所有数字或值。本文描述的范围和限制明确地命名并列出了范围或限制中定义和包含的所有整数、小数和分数值。因此，除非本文中另外指明，否则本文中对值的范围的叙述仅旨在充当单独地提及落入所述范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值如同在本文中单独叙述一样并入到本说明书中。
[0054]
细胞培养基
[0055]
一方面，本发明提供了一种杂质减少的细胞培养基。在某些实施例中，所述细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液，并且所述减少的杂质为hepes相关杂质。在某些实施例中，所述细胞培养基可以是如本文所讨论的化学限定细胞培养基。
[0056]
更具体地，根据本发明，所述细胞培养基包含相对于所述细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)。
[0057]
在大多数生物ph下，hepes是两性离子磺酸缓冲剂，并且通常作为缓冲液在ph为6.8至8.2时是有效的。hepes广泛应用于细胞培养，部分是由于与碳酸氢盐缓冲液相比，尽管二氧化碳浓度发生变化，其仍能够维持生理ph。用于细胞培养应用的缓冲液强度通常在10mm至25mm的范围内。hepes的缓冲溶液可以通过几种方法中的任何方法制备。例如，hepes游离酸可以添加到水中，然后用大约一半摩尔当量的氢氧化钠或氢氧化钾滴定到期望的ph，已经公布了用于制备0.05m hepes/naoh的简单混合表。可替代地，等摩尔浓度的hepes游离酸和hepes钠可以按大约相等的体积混合，用任一种溶液反滴定到适当的ph。其它形式的hepes包含hepes钾和hepes半钠。任何合适的hepes缓冲液可以与本发明结合使用，使得
hepes缓冲液的本文讨论的杂质减少。
[0058]
术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于使细胞(例如，真核细胞)生长的营养液，其通常提供增强细胞生长所必需的营养物，如碳水化合物能量源、必需氨基酸(例如，苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(例如，丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、微量元素、能量源、脂质、维生素等。细胞培养基可以含有供应支持细胞生长的原材料的提取物，例如血清或蛋白胨(水解产物)。培养基可以含有酵母源性提取物或大豆提取物，而不是动物源性提取物。化学限定培养基是指细胞培养基，其中所有的化学组分都是已知的(即，具有已知的化学结构)。化学限定培养基完全不含动物源性组分，如血清源性或动物源性蛋白胨。在一个实施例中，所述培养基是化学限定培养基。
[0059]
培养基还可以含有增强最小速率以上的生长和/或存活的组分，包含激素和生长因子。培养基优选地被调配成对细胞存活和增殖最佳的ph和盐浓度。
[0060]
在某些方面中，细胞培养基可以不含血清。“不含血清”适用于不含有动物血清，如胎牛血清的细胞培养基。不含血清的培养基可以含有≤16g/l的水解产物，如大豆水解产物。本发明还提供了杂质减少的化学限定培养基，所述化学限定培养基不仅不含血清，而且不含水解产物。“不含水解产物”适用于不含有外源蛋白水解产物，如动物或植物蛋白水解产物，例如蛋白胨、胰蛋白胨等的细胞培养基。
[0061]“基础培养基”是细胞在其中繁殖的初始培养基(例如，存在于种子扩大培养中和/或细胞培养物产生的第0天)，并且含有所有必需的营养物，所述必需的营养物包含氨基酸的基础混合物。基础培养基的各种配方(即，调配物)可以以可商购获得的批次制造或购买。同样，“基础补料培养基”含有补充性营养物的混合物，所述补充性营养物通常在产生培养期间被消耗，并且在补料策略中被利用(用于所谓的“补料分批”培养)。各种基础补料培养基可商购获得。“补料”包含定期添加或以规则间隔添加到培养基中，如根据方案，包含连续补料培养系统，如在恒化器中(参见c.altamirano等人,《生物技术进展(biotechnol prog.)》2001年11月-12月；17(6):1032-41)或根据补料分批过程(y.m.huang等人,《生物技术进展》2010年9月-10月；26(5):1400-10)。例如，培养物可以每天、每隔一天、每三天补料一次，或者可以在被监测的特定培养基组分的浓度落在期望范围之外时补料。
[0062]
不希望受到限制，本发明可以用多种基础培养基中的任何一种或多种或其组合来实践。基础培养基通常在本领域中是已知的，并且尤其包含伊格尔氏meme(最小必需培养基)(eagle,《科学(science)》,1955,112(3168):501-504)、ham's f12(ham,《美国国家科学院院刊》1965,53:288-293)、f-12k培养基、杜氏培养基(dulbecco's medium)、杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium)(《美国国家科学院院刊》1952年8月；38(8):747-752)、dmem/ham's f12 1:1、trowell's t8、a2培养基(holmes和wolf,《生物物理、生物化学与细胞学(biophys.biochem.cytol.)》,1961,10:389-401)、维莫斯培养基(waymouth media)(davidson和waymouth,《生物化学杂志(biochem.j.)》,1945,39(2):188-199)、williams e培养基(william等人,《实验细胞研究(exp.cell res.)》,1971,69:105及以下)、rpmi 1640(moore等人,《美国医学协会杂志(j.amer.med.assoc.)》,1967,199:519-524)、mcdb 104/110培养基(bettger等人,《美国国家科学院院刊》1981,78(9):5588-5592)、ventrex hl-1培养基、白蛋白-球蛋白培养基(orr等人,《应用微生物学
(appl.microbiol.)》,1973,25(1):49-54)、rpmi-1640培养基、rpmi-1641培养基、伊斯科夫氏改良杜氏培养基(iscove's modified dulbecco'smedium)、mccoy's 5a培养基、leibovitz's l-15培养基和不含血清的培养基，如ex-cell
tm 300系列(堪萨斯州莱内克萨的jrh生物科学公司(jrh biosciences,lenexa,kans.))、精蛋白-锌-胰岛素培养基(weiss等人,1974,美国专利第4,072,565号)、生物素-叶酸培养基(cartaya,1978,us re30,985)、转铁蛋白-脂肪酸培养基(baker,1982,美国专利第4,560,655号)、转铁蛋白-egf培养基(hasegawa,1982,美国专利第4,615,977号；chessebeuf,1984,美国专利第4,786,599号)以及其它培养基排列(参见inlow,美国专利第6,048,728号；drapeau,美国专利第7,294,484号；mather,美国专利第5,122,469号；furukawa,美国专利第5,976,833号；chen,美国专利第6,180,401号；chen,美国专利第5,856,179号；etcheverry,美国专利第5,705,364号；etcheverry,美国专利第7,666,416号；ryll,美国专利第6,528,286号；singh,美国专利第6,924,124号；luan,美国专利第7,429,491号；等等)。
[0063]
在某些实施例中，本发明的杂质减少的细胞培养基包括含有用于活细胞培养的所有必要营养物和hepes缓冲液的基础培养基。hepes缓冲液可以是基础培养基的组成部分，或者其可以添加到细胞培养基中。根据本发明的各方面，杂质减少的细胞培养基包含相对于所述细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于所述细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)。
[0064]
举例来说，相对于存在的hepes缓冲液的量的hepes相关杂质的量总体上涉及相对于培养基中的hepes归一化的杂质的丰度。例如，相对量可以使用标准分析技术，如hplc、lc-ms等来确定，其中相对量(杂质，ppm)＝峰面积(杂质)/峰面积(hepes+hepes二聚体+hepes加合物)x 1,000,000。
[0065]
在某些实施例中，培养基包含相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约4000ppm、少于约3500ppm、少于约3200ppm、少于约3000ppm、少于约2900ppm、少于约2500ppm、少于约2200ppm、少于约2000ppm、少于约1800ppm、少于约1500ppm、少于约1200ppm、少于约1000ppm、少于约800ppm等分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质。换言之，每摩尔总hepes少于约4000μmol、少于约3500μmol、少于约3200μmol、少于约3000μmol、少于约2900μmol、少于约2500μmol、少于约2200μmol、少于约2000μmol、少于约1800μmol、少于约1500μmol、少于约1200μmol、少于约1000μmol、少于约800μmol等mw为267.07的hepes杂质。在某些实施例中，培养基包含相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约500ppm、少于约450ppm、少于约400ppm、少于约390ppm、少于约370ppm、少于约350ppm、少于约320ppm、少于约300ppm、少于约250ppm、少于约200ppm、少于约150ppm、少于约100ppm、少于约80ppm、少于约75ppm、少于约70ppm等分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质。换言之，每摩尔总hepes少于约500μmol、少于约450μmol、少于约400μmol、少于约390μmol、少于约370μmol、少于约350μmol、少于约320μmol、少于约300μmol、少于约250μmol、少于约200μmol、少于约150μmol、少于约100μmol、少于约80μmol、少于约75μmol、少于约70μmol等mw为221.06的hepes杂质。
[0066]
在某些实施例中，培养基包含相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于
约4000ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质(4000μmol hepes杂质mw 267.07/摩尔总hepes)以及相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约400ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质(400μmol hepes杂质mw 221.06/摩尔总hepes)。在其它实施例中，培养基包含相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约3900ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质和相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于390ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质。在又实施例中，培养基包含相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于约800ppm分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质和相对于细胞培养基中存在的hepes缓冲液的量少于80ppm分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质。如本文所用，1ppm hepes杂质＝1μmol hepes杂质/摩尔总hepes。
[0067]
在其它实施例中，hepes缓冲液本身具有减少的hepes相关杂质，如本文所述。例如，hepes缓冲液可以包含相对于要结合细胞培养(例如，在培养基中)使用的hepes缓冲液的总量少于约4000ppm、少于约3500ppm、少于约3200ppm、少于约3000ppm、少于约2900ppm、少于约2500ppm、少于约2200ppm、少于约2000ppm、少于约1800ppm、少于约1500ppm、少于约1200ppm、少于约1000ppm、少于约800ppm等分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质。换言之，每摩尔总hepes少于约4000μmol、少于约3500μmol、少于约3200μmol、少于约3000μmol、少于约2900μmol、少于约2500μmol、少于约2200μmol、少于约2000μmol、少于约1800μmol、少于约1500μmol、少于约1200μmol、少于约1000μmol、少于约800μmol等mw为267.07的hepes杂质。在某些实施例中，培养基包含相对于要结合细胞培养(例如，在培养基中)使用的hepes缓冲液的总量少于约500ppm、少于约450ppm、少于约400ppm、少于约390ppm、少于约370ppm、少于约350ppm、少于约320ppm、少于约300ppm、少于约250ppm、少于约200ppm、少于约150ppm、少于约100ppm、少于约80ppm、少于约75ppm、少于约70ppm等分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质。换言之，每摩尔总hepes少于约500μmol、少于约450μmol、少于约400μmol、少于约390μmol、少于约370μmol、少于约350μmol、少于约320μmol、少于约300μmol、少于约250μmol、少于约200μmol、少于约150μmol、少于约100μmol、少于约80μmol、少于约75μmol、少于约70μmol等mw为221.06的hepes杂质。
[0068]
更具体地，根据本发明的各方面，hepes相关杂质的化学式和分子量(mw)在表1中呈现。
[0069]
表1
[0070]
推定id式m/z(负)hepes+[o2]-[h2]c8 h16 n2 o6 s267.07hepes-[ch4]c7 h14 n2 o4 s221.06
[0071]
尽管不旨在受理论限制，但基于化学式和分子量(mw)，提出了hepes相关杂质的以下化学结构。然而，本发明并不限于这些提出的化学结构的呈现，并且设想了与hepes相关杂质的化学式和分子量(mw)相对应的其它化学结构在本发明的范围内。
[0072][0073]
细胞培养基也可以周期性地补料(如在所谓的“补料分批”培养中)，根据要培养的细胞的要求或期望的细胞培养参数，添加或不添加另外的成分，如聚胺或增加浓度的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等。
[0074]
在某些方面中，细胞培养基可以在重组蛋白产生过程中耗竭氨基酸，其中不提供另外的氨基酸补充，或者细胞培养基可以是“非耗竭的”，其中为耗竭的氨基酸提供氨基酸补充(如下文所描述)。
[0075]
在一个实施例中，培养基另外地含有100μm
±
15μm鸟氨酸、或300μm
±
45μm鸟氨酸、或600μm
±
90μm鸟氨酸或甚至900μm
±
135μm鸟氨酸。在另一实施例中，培养基含有至少约5mg/l
±
1mg/l鸟氨酸.hcl、或至少约10mg/l
±
2mg/l鸟氨酸.hcl,15mg/l
±
2.25mg/l鸟氨酸.hcl、或至少约50mg/l
±
7.5mg/l鸟氨酸.hcl、或至少约100mg/l
±
15mg/l鸟氨酸.hcl、或至少约150mg/l
±
22.5mg/l鸟氨酸.hcl。
[0076]
腐胺可以任选地添加到补充的培养基中。腐胺已经以低浓度作为组分而被包含在一些细胞培养基调配物中；参见例如wo 2005/028626，其描述了0.02-0.08mg/l腐胺；美国专利第5,426,699号(0.08mg/l)；美国专利第re30,985号(0.16mg/l)；美国专利第5,811,299号(0.27mg/l)；美国专利第5,122,469号(0.5635mg/l)；美国专利第5,063,157号(1mg/l)；wo 2008/154014(～100 82m-～1000μm)；美国专利申请第2007/0212770号(0.5-30mg/l聚胺；2mg/l腐胺；2mg/l腐胺+2mg/l鸟氨酸；2mg/l腐胺+10mg/l鸟氨酸)。
[0077]
在一些实施例中，细胞培养基进一步用鸟氨酸和腐胺的组合补充，其中腐胺的浓度可以为至少约150μm至720μm。在一些实施例中，培养基进一步用浓度约为170μm至230μm的腐胺补充。在一个实施例中，除了≥90μm
±
15μm鸟氨酸外，培养基还含有200μm
±
30μm腐胺。在一个实施例中，除了≤15mg/l
±
2.25mg/l鸟氨酸外，培养基含有≤30mg/l
±
4.5mg/l腐胺.2hcl。在另一实施例中，除了≥15mg/l
±
2.25mg/l鸟氨酸.hcl外，培养基含有≥30mg/l
±
4.5mg/l腐胺.2hcl。(参见于2014年9月18日发布的国际公开第wo2014/144198a1号)
[0078]
在仍其它实施例中，鸟氨酸以范围为0.09
±
0.014mm至0.9
±
0.14mm，如0.09
±
0.014mm、0.3
±
0.05mm、0.6
±
0.09mm或0.9
±
0.14mm鸟氨酸的浓度存在于培养基中。在一些实施例中，培养基还含有至少0.20
±
0.03mm腐胺。在一些实施例中，另外的腐胺的浓度范围为0.20
±
0.03mm至0.714
±
0.11mm，如0.20
±
0.03mm、0.35
±
0.06或0.714
±
0.11mm腐胺。
[0079]
仍其它实施例，培养基可以用浓度(以毫摩尔/升表示)为至少约0.1mm、0.2mm、
0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm的牛磺酸补充。
[0080]
可以向培养基中添加各种其它补充物，并且所述补充物在本领域的技术人员的技能范围内以确定另外的适当条件。在一些实施例中，培养基用氨基酸的混合物补充，以便不被耗竭或作为需要的补充性营养物，所述氨基酸选自由以下组成的组：天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸。
[0081]
在一个实施例中，培养基进一步用约170μm至175μm核苷补充。在一个实施例中，培养基含有累积浓度为至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、至少75μm、至少80μm、至少85μm、至少90μm、至少95μm、至少100μm或至少105μm的嘌呤衍生物。在一个实施例中，培养基含有约100μm至110μm的嘌呤衍生物。嘌呤衍生物包含次黄嘌呤以及核苷腺苷和鸟苷。在一个实施例中，培养基含有累积浓度为至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm或至少65μm的嘧啶衍生物。在一个实施例中，培养基含有约65μm至75μm的嘧啶衍生物。嘧啶衍生物包含核苷、胸苷、尿苷和胞苷。在一个特定实施例中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。
[0082]
除了包含任何上述添加剂之外，在一个实施例中，培养基进一步用微摩尔量的脂肪酸(或脂肪酸衍生物)和生育酚补充。在一个实施例中，脂肪酸包含亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、二十四酸、肉豆蔻酸和辛酸中的任何一种或多种。在一个实施例中，培养基含有生育酚、亚油酸和硫辛酸。
[0083]
在一个实施例中，培养基还可以进一步用累积浓度为至少约700μm或至少约2mm的维生素的混合物补充，所述混合物包含其它营养物和必需营养物。在一个实施例中，维生素的混合物含有d-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、hcl吡哆醇、d-泛酸(hemica)、核黄素、hcl硫胺、维生素b12等中的一者或多者。在一个实施例中，维生素的混合物包含d-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、hcl吡哆醇、d-泛酸(hemica)、核黄素、hcl硫胺和维生素b12中的全部。
[0084]
杂质减少的本发明的培养基的各个实施例包含上述实施例的任何组合，包含化学限定培养基、hepes缓冲液，加上尤其(a)氨基酸；(b)任选地核苷；(c)二价阳离子的盐；(d)脂肪酸和生育酚；以及(e)维生素。
[0085]
在一具体实施例中，杂质减少的细胞培养基可以是化学限定的，并且可以包括：hepes缓冲液；本文讨论的氨基酸混合物；cacl
2 2h2o；kcl；mgso4；nacl；na2hpo4或其它磷酸盐；丙酮酸盐；d-生物素；氯化胆碱；叶酸；肌醇；烟酰胺；hcl吡哆醇；d-泛酸；核黄素；hcl硫胺；维生素b12；ρ-氨基苯甲酸；hcl乙醇胺；泊咯沙姆188；dl-a-生育酚磷酸盐；亚油酸；na2seo3；硫辛酸；和葡萄糖；以及任选地腺苷；鸟苷；胞苷；尿苷；胸苷；和次黄嘌呤2na。
[0086]
在一个实施例中，本发明的培养基的起始渗透压为200-500mosm、250-400mosm、275-350mosm或约300mosm。在细胞在本发明的培养基中生长期间，并且具体地在根据补料分批方案进行任何补料之后，培养物的渗透压可以增加至约350mosm、400mosm、450mosm、500mosm或至约550mosm。
[0087]
在其中培养基的渗透压小于约300的一些实施例中，渗透压可以通过添加超过指
定量的一种或多种盐调节至约300。在一个实施例中，渗透压通过添加渗透物中的一种或多种渗透物增加到期望的水平，所述渗透物选自氯化钠、氯化钾、镁盐、钙盐、氨基酸盐、脂肪酸盐、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、作为盐的螯合剂、糖(例如，半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、岩藻糖等)以及其组合。在一个实施例中，添加的渗透物超过并且高于其在已经存在于限定培养基中的组分中的浓度(例如，添加的糖超过并且高于糖组分的指定浓度)。
[0088]
以上所述的培养基以及包含本文所述的减少量的hepes相关杂质的任何其它培养基的每个实施例被称为杂质减少的培养基或具有减少的hepes相关杂质的培养基。相反，包含量高于本文讨论的那些水平的hepes相关杂质的培养基在以下被称为非杂质减少的培养基或非hepes相关杂质减少的培养基。在一些实施例中，除了存在本文讨论的杂质之外，非杂质减少的培养基包括与杂质减少的介质的基础培养基和补充物相同的基础培养基和补充物。
[0089]
细胞培养
[0090]
本发明的一方面提供了一种细胞培养物，其包括在本文所述的杂质减少的培养基中表达所关注重组蛋白的细胞系。常规用于产生重组蛋白的细胞系的实例尤其包含原代细胞、bsc细胞、hela细胞、hepg2细胞、llc-mk细胞、cv-1细胞、cos细胞、vero细胞、mdbk细胞、mdck细胞、crfk细胞、raf细胞、rk细胞、tcmk-1细胞、llcpk细胞、pk15细胞、llc-rk细胞、mdok细胞、bhk细胞、bhk-21细胞、cho细胞、cho-k1细胞、ns-1细胞、mrc-5细胞、wi-38细胞、3t3细胞、293细胞、per.c6细胞和鸡胚细胞。在一个实施例中，细胞系为cho细胞系或针对大规模蛋白质产生而优化的几种特定cho细胞变体中的一种或多种，例如cho-k1。
[0091]
本发明的另一方面涉及一种使用如本文所述的杂质减少的培养基培养细胞的方法，其中相比于此类细胞在非杂质减少的培养基中的培养，对此类培养基的使用会增强重组真核细胞的生长，同时通过此类细胞改进一种或多种所关注重组蛋白的滴度并维持细胞活力，具体地通过在产生培养和/或种子扩大培养中使用。
[0092]
在一些方面中，相对于在非杂质减少的培养基中生长的细胞，重组蛋白滴度有所改进。在一些实施例中，从本发明的杂质减少的培养基中的细胞培养物中产生的蛋白质滴度比从在非杂质减少的培养基中培养的细胞中产生的蛋白质滴度(产率)高至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、高至少约22％、高至少约23％、高至少约24％、高至少约25％、高至少约26％、高至少约27％、高至少约28％、高至少约29％、高至少约30％、高至少约35％、高至少约40％或高至少约50％。在一些实施例中，从本发明的杂质减少的培养基中的细胞培养物中产生的蛋白质滴度大于在非杂质减少的培养基中培养的类似或相同细胞的蛋白质滴度。
[0093]
在一些方面中，相对于在非杂质减少的培养基中生长的细胞，细胞生长(例如，倍增速率)、活细胞密度、细胞活力以及其组合有所改进。
[0094]
在一些实施例中，本发明的杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比在非杂质减少的培养基中培养的细胞的倍增速率高至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、
至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或为所述倍增速率的至少3倍。在一些实施例中，本发明的杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比非杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率高约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
[0095]
在一些实施例中，在杂质减少的培养基中，活跃循环的哺乳动物细胞的倍增时间少30小时、少29小时、少28小时、少27小时、少26小时、少25小时、少24小时、少23小时、少22小时、少21小时、少20小时、少19小时或少18小时。在一些实施例中，在杂质减少的培养基中，活跃生长的哺乳动物细胞的倍增时间少28小时。在一些实施例中，在杂质减少的培养基中，哺乳动物细胞的倍增时间为约27
±
1小时、约26
±
1小时、约25
±
1小时、约24
±
1小时、约23
±
1小时、约22
±
1小时或约21
±
1小时。在一些实施例中，在杂质减少的培养基中，活跃循环的哺乳动物细胞的倍增时间为约24
±
1小时。在一些实施例中，在杂质减少的培养基中培养的活跃分裂的细胞的倍增时间比在非减少杂质的培养基中培养的活跃循环的细胞的倍增时间短至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。
[0096]
关于细胞活力，在杂质减少的培养基中生长的细胞显示出活力比在非杂质减少的培养基中生长的细胞的活力高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％或为所述活力的至少3倍。
[0097]
在产生培养容器或生物反应器中，在种子培养或生长期后，将基础培养基和细胞供应到培养容器中。在某些实施例中，产生培养后采集细胞上清液或细胞裂解物。在其它实施例中，使用本领域众所周知的技术，从培养基或细胞裂解物中回收所关注多肽或蛋白质，或者根据所关注蛋白质的位置的任何情况。
[0098]“细胞系”是指通过细胞的连续传代或传代培养从特定谱系衍生的一个或多个细胞。术语“细胞”与“细胞群体”可互换使用。
[0099]
术语“细胞”包含任何适于表达重组核酸序列的细胞。细胞包含真核生物的那些细胞，如非人动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合体，例如杂交瘤或正交瘤。在某些实施例中，细胞是人类细胞、猴类细胞、猿类细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在其它实施例中，细胞选自以下细胞：cho细胞(例如，cho k1细胞、dxb-11cho细胞、veggie-cho细胞)、cos(例如，cos-7细胞)、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞(例如，hek293细胞、293ebna细胞、msr 293细胞、mdck细胞、hak细胞、bhk21细胞)、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞，例如jurkat细胞(t淋巴细胞)或daudi细胞(b淋巴细胞)、a431细胞(表皮细胞)、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。在一些实施例中，细胞包括一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，per.细胞)。在一些实施例中，细胞为cho细胞。在其它实施例中，细胞为cho k1细胞。
[0100]
在重组蛋白生产期中，“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”是指以如下方式进行的分批培养：最初，将动物细胞和培养基供应到培养容器中，并且在培养期间，在终止培养之前进行或不进行周期性细胞和/或产物采集的情况下，将另外的培养营养物缓慢地、连
续地或以不连续的增量进给到培养物中。补料分批培养包含“半连续补料分批培养”，在半连续补料分批培养中，周期性地将全部培养物(其可以包含细胞和培养基)去除并且用新鲜培养基替代。补料分批培养区别于简单的“分批培养”，而在分批培养中，在培养过程开始时，将用于细胞培养的所有组分(包含动物细胞和所有培养营养物)供应到培养容器中。补料分批培养可以进一步区别于灌注培养，因为在过程期间不从培养容器中去除上清液，而在灌注培养中，通过例如过滤将细胞限制在培养物中，并且连续或间歇地将培养基引入到培养容器中并且从培养容器中去除。然而，设想了在补料分批细胞培养期间出于测试目的去除样品。补料分批过程继续到确定达到最大工作体积和/或蛋白质产生。
[0101]
当在本文中使用时，短语“连续细胞培养”涉及用于使细胞持续，通常在特定的生长期生长的技术。例如，如果需要恒定的细胞供应，或者需要产生所关注特定多肽或蛋白质，则细胞培养可能需要维持在特定的生长期。因此，必须持续地监测并相应地调整条件，以便将细胞维持在所述特定期。
[0102]
本发明的一方面涉及种子培养，其中细胞群体在蛋白质产生和产生培养中采集之前扩增。在某些实施例中，杂质减少的细胞培养基可以与种子细胞培养物一起使用，如本文进一步描述的。
[0103]
本发明的另一方面涉及其中产生和采集蛋白质的产生培养。在生产期之前，通常存在生长期(也被称为种子扩大培养(seed train)或种子培养)，其中在培养过程开始时，将用于细胞培养的所有组分供应到培养容器中，然后使细胞群体扩增，直到准备好产生规模。因此，根据起始细胞系，培养容器以合适的接种密度接种细胞以用于初始细胞生长期。在一些方面中，杂质减少的细胞培养基可以与种子细胞培养物一起使用以进一步改进或增强细胞在随后的生产期的生产力。在其它实施例中，杂质减少的细胞培养基可以与产生细胞培养物一起使用，如本文进一步描述的。
[0104]
培养容器包含但不限于孔板、t形烧瓶、摇瓶、搅拌容器、旋转器烧瓶、中空纤维、气升式生物反应器等。合适的细胞培养容器为生物反应器。生物反应器是指被制造或工程化为操纵或控制环境条件的任何培养容器。此类培养容器在本领域中是众所周知的。
[0105]
已经开发了生物反应器工艺和系统来优化气体交换，以供应足够的氧气以维持细胞生长和生产力，并且去除co2。维持气体交换的效率是确保细胞培养和蛋白质产生的成功按比例增加的重要标准。此类系统对于本领域的技术人员来说是众所周知的。
[0106]
在一个实施例中，根据补料分批过程，在细胞培养期间以一定间隔补充培养基。补料分批培养在本领域通常是已知的，并且用于优化蛋白质产生(参见y.m.huang等人,《生物技术进展》2010年9月-10月；26(5):1400-10)。补料分批过程通常在生产期期间使用。
[0107]
补充补料可以在产生培养的持续时间内，以一定间隔，以每天或每2-3天的频率进行，以包含另外的营养物，如维生素、氨基酸和如上文所描述的其它营养物。补充补料可以在整个2周或更长时间培养的产生培养持续时间内，进行至少2次或至少8次(添加含有营养物的补充培养基)。在另一实施例中，补充补料可以在培养的持续时间内每天进行。还设想了替代性培养物补料时间表。
[0108]
还可以进行另外的氨基酸补充以提供非耗竭的培养基，其中耗竭的氨基酸根据本领域已知的和本文所描述的方法来确定。当采用此方案时，另外的氨基酸在产生培养的持续时间内，以一定间隔，优选地以每天或每2-3天的频率补充或添加，这取决于对氨基酸耗
竭的确定。在一个实施例中，在第1天或约第1天、在第2天或约第2天、在第3天或约第3天、在第4天或约第4天、在第5天或约第5天、在第6天或约第6天、在第7天或约第7天、在第8天或约第8天、在第9天或约第9天、在第10天或约第10天、在第11天或约第11天、在第12天或约第12天、在第13天或约第13天、在第14天或约第14天，将用于维持非耗竭的细胞培养基的另外的氨基酸的混合物添加到培养物中，持续2周或更长时间的培养。还设想了替代性培养物补料时间表。
[0109]
真核细胞，如cho细胞，可以在小规模培养中培养，如在具有约25ml培养基的125ml容器中、具有约50ml至100ml培养基的250ml容器中、具有约100ml至200ml培养基的500ml容器中。可替代地，培养可以是大规模的，例如具有约300ml至1000ml培养基的1000ml容器、具有约500ml至3000ml培养基的3000ml容器、具有约2000ml至8000ml培养基的8000ml容器以及具有约4000ml至15000ml培养基的15000ml容器。用于制备的培养物可以含有10,000l培养基或更多培养基。大规模细胞培养，例如用于蛋白质治疗剂的临床制备，通常维持数天，或甚至数周，同时细胞产生期望的蛋白质。在此时间期间，培养物可以用经浓缩的补料培养基补充，所述补料培养基含有在培养过程期间消耗的组分，如营养物和氨基酸。经浓缩的补料培养基可以基于任何细胞培养基调配物。此经浓缩的补料培养基可以含有细胞培养基的大部分组分，例如约5
×
、6
×
、7
×
、8
×
、9
×
、10
×
、12
×
、14
×
、16
×
、20
×
、30
×
、50
×
、100
×
、200
×
、400
×
、600
×
、800
×
或甚至约1000
×
于其正常有用量。经浓缩的补料培养基通常用于补料分批培养过程。
[0110]
在一些实施例中，在细胞生长或蛋白质产生的过程期间，细胞培养物可以进一步用“使用点添加物”，也被称为添加物、使用点成分或使用点化学品补充。使用点添加物包含生长因子或其它蛋白质、缓冲液、能量源、盐、氨基酸、金属和螯合剂中的任何一种或多种。其它蛋白质包含转铁蛋白和白蛋白。生长因子，包含细胞因子和趋化因子，是本领域通常已知的，并且已知刺激细胞生长，或者在一些情况下，刺激细胞分化。生长因子通常是蛋白质(例如，胰岛素)、小肽或类固醇激素，如雌激素、dhea、睾酮等。在一些情况下，生长因子可以是促进细胞增殖或蛋白质产生的非天然化学品，例如四氢叶酸(thf)、甲氨蝶呤等。蛋白质和肽生长因子的非限制性实例包含血管生成素、骨形态发生蛋白(bmp)、脑源性神经营养因子(bdnf)、表皮生长因子(egf)、红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胶质细胞系源性神经营养因子(gdnf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、生长分化因子-9(gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝癌源性生长因子(hdgf)、胰岛素、胰岛素样生长因子(igf)、迁移刺激因子、肌生长抑制素(gdf-8)、神经生长因子(ngf)以及其它神经营养因子、血小板源性生长因子(pdgf)、血小板生成素(tpo)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-β)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、血管内皮生长因子(vegf)、wnt信号传导通路激动剂、胎盘生长因子(pigf)、胎牛生长激素(fbs)、白介素-1(il-1)、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7等。在一个实施例中，细胞培养基用使用点添加生长因子胰岛素补充。在一个实施例中，培养基中的胰岛素的浓度，即添加之后细胞培养基中的胰岛素的量，为约0.1μm至10μm。
[0111]
缓冲液在本领域中通常是已知的。本发明不限于任何特定的一种或多种缓冲液，并且本领域的普通技术人员可以选择适当的缓冲液或缓冲液系统以与产生特定蛋白质的特定细胞系一起使用。在一个实施例中，使用点添加缓冲液为nahco3。在另一实施例中，缓
冲液为hepes。在其它实施例中，使用点添加缓冲液包括nahco3和hepes两者。在其中缓冲液包括hepes的实施例中，hepes缓冲液包括减少量的如本文所述的hepes相关杂质。
[0112]
在细胞培养中用作使用点添加物的能量源在本领域也是众所周知的。非限制性地，在一个实施例中，使用点添加物能量源为葡萄糖。考虑到特定细胞系和要产生的蛋白质的特定和具体要求，在一个实施例中，可以将葡萄糖在培养基中添加到约1mm至20mm的浓度。在一些情况下，葡萄糖可以以20g/l或更高的高水平添加。
[0113]
螯合剂在细胞培养和蛋白质产生领域同样是众所周知的。edta四钠脱水物和柠檬酸盐是本领域中使用的两种常见螯合剂，但是在本发明的实践中还可以采用其它螯合剂。在一个实施例中，使用点添加螯合剂为edta四钠二水合物。在一个实施例中，使用点添加螯合剂为柠檬酸盐，如na3c6h5o7。
[0114]
在一个实施例中，细胞培养基可以另外地用作为能量源的一种或多种使用点添加氨基酸，例如谷氨酰胺补充。在一个实施例中，细胞培养基用最终浓度为约1mm至13mm的使用点添加谷氨酰胺补充。
[0115]
其它使用点添加物包含各种金属盐，例如铁盐、镍盐、锌盐和铜盐中的一者或多者。在一个实施例中，细胞培养基用硫酸铜、硫酸锌、氯化铁和硫酸镍中的任何一种或多种补充。
[0116]
蛋白质产生
[0117]
除了杂质减少的培养基和在此培养基中培养细胞的方法外，本发明提供了用于改进细胞培养性能的方法，所述方法包含在生产重组蛋白时通过培养重组真核细胞来改进重组蛋白滴度。在一些实施例中，重组真核细胞包括编码重组蛋白的稳定整合的核酸。在其它实施例中，本发明的方法提供了改进的细胞生长(例如，倍增速率)、活细胞密度、细胞活力以及其组合。
[0118]
在一些实施例中，本发明的方法包含提供本发明的杂质减少的细胞培养基；在所述培养基中培养重组真核细胞；从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及相对于在非杂质减少的培养基中培养的类似或相同重组真核细胞的滴度，在杂质减少的培养基中培养的重组真核细胞产生重组蛋白的更高的度。
[0119]
在一些实施例中，来自在杂质减少的培养基中培养的细胞的可以以克蛋白质产物/升培养基表示的蛋白质产生产率或滴度为至少100mg/l、至少1g/l、至少1.2g/l、至少1.4g/l、至少1.6g/l、至少1.8g/l、至少2g/l、至少2.5g/l、至少3g/l、至少3.5g/l、至少4g/l、至少4.5g/l、至少5g/l、至少5.5g/l、至少6g/l、至少6.5g/l、至少7g/l、至少7.5g/l、至少8g/l、至少8.5g/l、至少9g/l、至少9.5g/l、至少10g/l、至少15g/l或至少20g/l。
[0120]
在一些实施例中，从在杂质减少的培养基中培养的细胞中产生的蛋白质滴度比来自在非杂质减少的培养基中培养的类似或相同细胞的蛋白质滴度(产率)高至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、高至少约23％、高至少约24％、高至少约25％、高至少约26％、高至少约27％、高至少约28％或至少约29％。
[0121]
在一些实施例中，通过在本文所述的杂质减少的培养基中培养的哺乳动物细胞产生的蛋白质滴度(产率)比通过在非杂质减少的培养基中培养的类似或相同细胞产生的蛋
白质滴度高至少100mg/l、至少0.5g/l、至少1g/l、至少1.2g/l、至少1.4g/l、至少1.6g/l、至少1.8g/l、至少2g/l、至少2.5g/l。
[0122]
本发明的方法可用于通过细胞培养过程改进蛋白质产生。本发明中使用的细胞系可以被基因工程化为表达具有商业或科学意义的重组蛋白。对细胞系进行基因工程化涉及用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，或以其它方式改变(例如，通过同源重组和基因活化或重组细胞与非重组细胞的融合)以使宿主细胞表达期望的重组多肽。用于对细胞或细胞系进行基因工程化以表达所关注多肽的方法和载体是本领域的技术人员众所周知的；例如，在以下中展示了各种技术：《当代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology.)》ausubel等人编辑(纽约的约翰威利父子公司(wiley&sons,new york),1988，以及季刊更新)；sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,(冷泉港实验室出版社,1989)；kaufman,r.j.,《大规模哺乳动物细胞培养(large scale mammalian cell culture)》,1990,第15-69页。适于在培养物中生长的多种细胞系可从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯)和商业供应商处获得。
[0123]
在一些实施例中，蛋白质产物(所关注蛋白质)为抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab
′
)2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg1抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg2抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg1抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg1/igg4抗体。
[0124]
在一些实施例中，所述抗体选自由以下组成的组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0203579a1号中所描述的抗pd1抗体)、抗程序性细胞死亡配体-1(例如，如美国专利申请公开第us2015/0203580a1号中所描述的抗pd-l1抗体)、抗dii4抗体、抗血管生成素-2抗体(例如，如美国专利第9,402,898号中所描述的抗ang2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如美国专利第9,018,356号中所描述的抗angptl3抗体)、抗血小板源性生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,265,827号中所描述的抗pdgfr抗体)、抗erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利第9,302,015号中所描述的抗prlr抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0313194a1号中所描述的抗c5抗体)、抗tnf抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号中所描述的抗egfr抗体，或者如美国专利申请公开第us2015/0259423a1号中所描述的抗egfrviii抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或美国专利申请公开第us2014/0044730a1号中所描述的抗pcsk9抗体)、抗生长和分化因子-8抗体(例如，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所描述的抗gdf8抗体，也被称为抗肌肉生长抑制素抗体)、抗胰高血糖素抗体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0337045a1号或第us2016/0075778a1号中所描述的抗gcgr抗体)、抗vegf抗体、抗il1r抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271681a1号或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号中所描述的抗il4r抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中所描述的抗il6r抗体)、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗
体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271658a1号或第us2014/0271642a1号中所描述的抗il33抗体)、抗呼吸道合胞体病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271653a1号中所描述的抗rsv抗体)、抗分化簇3(例如，如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号以及美国申请第62/222,605号中所描述的抗cd3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号以及美国专利第7,879,984号中所描述的抗cd20抗体)、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗分化簇-48(例如，如美国专利第9,228,014号中所描述的抗cd48抗体)、抗fel d1抗体(例如，如美国专利第9,079,948号中所描述的)、抗中东呼吸道综合征病毒(例如，如美国专利申请公开第us2015/0337029a1号中所描述的抗mers抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第us2016/0215040号中所描述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗lag3抗体或抗cd223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开第us2016/0017029号以及美国专利第8,309,088号和第9,353,176号中所描述的抗ngf抗体)以及抗活化素a抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的组：抗cd3
×
抗cd20双特异性抗体(如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号中所描述的)、抗cd3
×
抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗cd3
×
抗muc16双特异性抗体)和抗cd3
×
抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗cd3
×
抗psma双特异性抗体)。
[0125]
在一些实施例中，所关注蛋白质选自由以下组成的组：阿利库单抗、阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。
[0126]
在一些实施例中，所关注蛋白质是含有fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如，fc融合蛋白)。在一些实施例中，fc融合蛋白是受体fc融合蛋白，所述受体fc融合蛋白含有与fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施例中，fc部分包括铰链区，随后是igg的ch2结构域和ch3结构域。在一些实施例中，受体fc融合蛋白含有与单个配体或多个配体结合的两条或更多条不同的受体链。例如，fc融合蛋白是trap蛋白，例如il-1trap(例如，利纳西普，其含有与和higg1的fc融合的ii-1r1胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利第6,927,044号)或vegf trap(例如，阿柏西普或ziv-阿柏西普)，其含有与和higg1的fc融合的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利第7,087,411号和第7,279,159号)。在其它实施例中，fc融合蛋白是scfv-fc融合蛋白，所述scfv-fc融合蛋白含有与fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(如可变重链片段和可变轻链片段)中的一个或多个抗原结合结构域。
[0127]
此外，还包含微型trap，其是使用多聚化组分(mc)而不是fc部分的trap蛋白，并且在美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中公开。
[0128]
以上的衍生物、组分、结构域、链和片段也包含在内。
[0129]
本发明不限于用于重组蛋白产生的任何特定类型的细胞。适于重组蛋白产生的细胞类型的实例包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、细菌细胞和酵母细胞。细胞可以是用载体转化以用于重组基因表达的干细胞或重组细胞，或者是用病毒转染以用于产生病毒产物的细胞。细胞可以含有编码所关注蛋白质的重组异源多核苷酸构建体。所述构建体可
以是游离体，或者其可以是物理地整合到细胞的基因组中的元件。细胞还可以在没有在异源多肽构建体上编码的蛋白质的情况下产生所关注蛋白质。换句话说，细胞可以天然地编码所关注蛋白质，如产生抗体的b细胞。细胞也可以是原代细胞，如鸡胚细胞，或原代细胞系。
[0130]
有用细胞的实例包含cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。在各个实施例中，所述细胞系为cho细胞衍生物，如cho-k1、cho dux b-11、cho dg-44、veggie-cho、gs-cho、s-cho或cho iec突变体系。
[0131]
生产期可以以任何规模的培养进行，从摇瓶或波形袋，至一升生物反应器，以及至大规模工业生物反应器。同样，种子扩大培养扩增期可以以任何规模的培养进行，从摇瓶或波形袋，至一升或更大的生物反应器。大规模过程可以以约100升至20,000升或更多的体积进行。可以使用几种方式中的一种或多种方式以控制蛋白质产生，如温度变换或化学诱导。生长期可以在比生产期更高的温度下发生。例如，生长期可以在约35℃至38℃的第一温度下发生，并且生产期可以在约29℃至37℃，任选地约30℃至36℃或约30℃至34℃的第二温度下发生。另外，蛋白质产生的化学诱导剂，如咖啡因、丁酸盐、他莫昔芬、雌激素、四环素、强力霉素和六亚甲基双乙酰胺(hmba)可以在温度变换的同时、之前或之后添加。如果在温度变换之后添加诱导剂，则其可以在温度变换之后一小时至五天添加，例如在温度变换之后一天至两天添加。产生细胞培养物可以作为连续补料培养系统运行，如在恒化器中(参见c.altamirano等人,2001，同上)，或根据补料分批过程(huang,2010，同上)。
[0132]
培养基和缓冲液选择
[0133]
本发明的又其它方面涉及筛选细胞培养基或hepes缓冲液以供选择以用于细胞培养，以由此改进细胞培养性能，例如，改进蛋白质滴度、改机细胞生长、改机活细胞密度等的方法。此类方法可以用于选择用于细胞培养的根据本发明的杂质减少的培养基，或可以用于选择用于细胞培养的杂质减少的hepes缓冲液。
[0134]
在一些实施例中，提供了用于选择在细胞培养中用于改进细胞培养性能的细胞培养基的方法。所述方法总体上可以包含：提供包括hepes缓冲液的细胞培养基；对包括所述hepes缓冲液的所述细胞培养基进行分析，以确定所述细胞培养基中存在的分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质的量和分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质的量；以及如果确定包括所述hepes缓冲液的所述细胞培养基具有本文讨论的减少的hepes相关杂质，则选择包括hepes缓冲液的所述细胞培养基用于细胞培养。根据本发明，相对于在非hepes杂质减少的细胞培养基中的细胞培养性能，对根据此方法选择的细胞培养基的使用会改进细胞培养性能。
[0135]
在其它实施例中，提供了一种用于选择在细胞培养用于改进细胞培养性能的hepes缓冲液的方法。所述方法总体上可以包含：提供hepes缓冲液；对所述hepes缓冲液进行分析，以确定所述hepes缓冲液中存在的分子量(mw)为267.07的hepes相关杂质的量和分子量(mw)为221.06的hepes相关杂质的量；以及如果确定所述hepes缓冲液具有本文讨论的减少的hepes相关杂质，则选择所述hepes缓冲液用于细胞培养。根据本发明，相对于在非杂
质减少的hepes缓冲液的情况下的细胞培养性能，对根据此方法选择的hepes缓冲液的使用会改进细胞培养性能。
[0136]
用于对培养基或hepes缓冲液进行分析以定量地确定hepes相关杂质的存在的任何合适的方法可以与本文公开的方法结合使用。根据本发明使用的分析方法包含hplc、lc-ms和其它方法，包含本文公开的所有分析、分离和纯化方法。
[0137]
本发明的范围不受本文描述的具体实施例的限制，所述实施例旨在作为本发明的单独方面或实施例的说明。功能等效的方法和组分在本发明的范围内。除了在此描述的那些修改之外，对于本领域的技术人员来说，根据前述描述和附图，本发明的各种修改是明显的。此类修改落入发明的范围内。
[0138]
实例
[0139]
以下实例仅出于说明性目的提供，并且并不旨在限制本发明的范围。
[0140]
实例1-鉴定hepes相关杂质
[0141]
在“高滴度”进行细胞培养运行中使用的批次与“低滴度”进行细胞培养运行中的批次之间，对化学限定培养基的53种不同组分的批次谱系学进行了anova分析。hepes酸和盐被鉴定为“高风险”组分，所述高风险组分显示出与最终滴度的最强相关(所述相关比滴度与整体的培养基之间的相关更强)。在一项独立的基于风险的分析中，hepes也被鉴定为“高风险组分”，所述分析考虑了培养基调配物中的组分的重量分数、组分的coa纯度以及其制备方法。
[0142]
随后，对培养基批次进行ftir和拉曼光谱分析。培养基中的ftir光谱的某些区中的吸收与最终滴度之间存在强相关，这归因于hepes(基于hepes光谱的已知特征)并且之后通过与来自hepes保留物的ftir光谱进行比较得到了证实。表现出“低滴度”的批次与表现出“高滴度”的批次之间的光谱差异与观察到的滴度结果一致。从另外的培养基批次中获取数据，并且将所述数据用于建立传入培养基批次的滴度性能的预测模型。
[0143]
还发现cdm1b的拉曼光谱中的几个带与最终滴度具有强相关。与ftir分析类似，这些带通过将培养基的拉曼光谱与hepes保留样品的光谱相匹配而分配给hepes。
[0144]
在将hepes鉴定为与最终滴度具有强相关的“高风险”组分后，对hepes缓冲液批次的化学组成进行了分析，包含lc-ms和滴度相关评估。基于这些研究，鉴定了两种hepes相关杂质，所述杂质显示出与所分析的所有产生运行的滴度具有负相关。
[0145]
确定两种鉴定的hepes相关杂质具有以下表2中呈现的化学式和分子量(mw)。
[0146]
表2
[0147][0148][0149]
以下表3中示出了鉴定的所有杂质，包含hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]。
[0150]
表3
[0151][0152]
令人惊讶的是，以下表4中鉴定的杂质(表4化合物)没有对细胞滴度产生不利影响，尽管许多杂质的存在多于hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]的存在。表4化合物中的一种或多种可以存在于培养基中而不会对细胞产生不适当的不利影响。
[0153]
表4
[0154][0155]
尽管不旨在受理论限制，但基于化学式和分子量(mw)，提出了hepes相关杂质的以下化学结构。然而，本发明并不限于这些提出的化学结构的呈现，并且设想了与hepes相关杂质的化学式和分子量相对应的其它化学结构也在本发明的范围内。
[0156]
[0157]
实例2-hepes相关杂质与滴度负相关
[0158]
在多个地点进行大规模生产以生产度普利尤单抗。根据本发明，发现如本文所讨论的hepes相关杂质的量影响蛋白质滴度。基于这些发现，并且根据本发明，通过使用根据本发明的具有减少的hepes相关杂质的培养基可以获得改进的蛋白质滴度。
[0159]
图1展示了hepes+[o2]-[h2]的相对量与蛋白质滴度之间的关系。图2a和2b表明滴度与用于在两个不同地点处进行度普利尤单抗的多次产生运行的hepes+[o2]-[h2]之间的负相关(图2a，地点1处20次产生运行；图2b，地点2处7次产生运行)。拟合汇总数据示出在以下图2a和2b中的每幅图中。
[0160]
图3展示了hepes-[ch4]的相对量与蛋白质滴度之间的关系。图4a和4b表明滴度与用于在两个不同地点处进行度普利尤单抗的多次产生运行的hepes-[ch4]之间的负相关(图4a，地点1处20次产生运行；图4b，地点2处7次产生运行)。拟合汇总数据示出在以下图4a和4b中的每幅图中。
[0161]
如图中示出的，在地点1和地点2两处，hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]两者显示出在较低滴度产生运行中丰度较高，并且表现出与滴度的负相关。在不同生产地点看到的相似结果提高确定hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]的丰度与滴度具有负相关的置信度。
[0162]
实例3
–
hepes缓冲液中的杂质的结构解析
[0163]
使用亲水相互作用液相色谱(hilic)柱将hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]与hepes分离(图5a显示出目标)。使用混合模式柱以将hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]进一步与在来自hilic分离的级分中收集的其它hepes杂质分离(图5b显示出目标)。可以使用两个柱的组合以进一步纯化hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]。
[0164]
使用反相液相色谱质谱(rp-lcms)、亲水相互作用液相色谱质谱(hilic-lcms)和ms/ms碎片化确认hepes+[o2]-[h2]和hepes-[ch4]的结构。图6a为源自hepes原材料的hepes-[ch4](还被称为“221”)的rp-lcms图。图6b为源自hepes原材料的hepes-[ch4]的hilic-lcms图。图7示出了源自hepes原材料的hepes-[ch4]的ms/ms片段化。
[0165]
实例4-蛋白质
[0166]
本发明可以用于产生生物产物和制药产物，并且适用于包括编码所关注蛋白质的基因的细胞的繁殖，并且本技术中公开的每个实施例和实例可以与以下鉴定的一起用于产生生物产物和制药产物。这些蛋白质可以包含但不限于抗体、受体、融合蛋白、拮抗剂、抑制剂、酶(如用于酶替代疗法的那些)、因子和辅因子、细胞因子、趋化因子、阻遏子、激活子、配体、报告蛋白、选择蛋白、蛋白激素、蛋白毒素、结构蛋白、储存蛋白、转运蛋白、神经递质和收缩蛋白。可以根据本发明产生的特定类型的蛋白质在下面更详细地讨论。
[0167]
抗体(也被称为“免疫球蛋白”)是具有多条多肽链和广泛的翻译后修饰的蛋白质的实例。典型的免疫球蛋白(例如，igg)包括四条多肽链，即两条轻链和两条重链。每条轻链通过半胱氨酸二硫键与一条重链连接，并且两条重链通过两个半胱氨酸二硫键彼此结合。在哺乳动物系统中产生的免疫球蛋白还在各个残基(例如，天冬酰胺残基)处通过各种多糖糖基化，并且可能因物种而有所区别，这可能影响治疗性抗体的抗原性。butler和spearman,“哺乳动物细胞宿主的选择及糖基化工程化的可能性(the choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering)”,《生物技术当前述评(curr.opin.biotech.)》30:107-112(2014)。
[0168]
抗体重链恒定区包括三个结构域，即ch1、ch2和ch3。每条轻链包括轻链可变区(在本文缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域cl。vh区和vl区可以进一步细分为被称作互补决定区(cdr)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(fr)的区。每个vh和vl由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(重链cdr可以简称为hcdr1、hcdr2和hcdr3；轻链cdr可以简称为lcdr1、lcdr2和lcdr3)。术语“高亲和力”抗体是指与其目标的结合亲和力为至少10-9
m、至少10-10
m；至少10-11
m；或至少10-12
m的那些抗体，如通过表面等离子体共振测量的，例如，biacore
tm
或溶液亲和elisa。
[0169]
抗体轻链包含来自任何生物体的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则还包含人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(vl)结构域通常包含三个轻链cdr和四个框架(fr)区。通常，全长轻链从氨基末端到羧基末端包含vl结构域和轻链恒定结构域，所述vl结构域包含fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。可以与这些发明一起使用的轻链包含，例如，不与由抗原结合蛋白选择性结合的第一抗原或第二抗原选择性结合的那些轻链。合适的轻链包含可以通过筛选现有抗体文库(湿文库或计算机文库)中最常用的轻链来鉴定的那些轻链，其中轻链不会实质上干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。合适的轻链包含可以与通过抗原结合蛋白的抗原结合区结合的一个或两个表位结合的那些轻链。
[0170]
抗体可变结构域包含免疫球蛋白轻链或重链(根据需要进行修饰)的氨基酸序列，按从n末端到c末端的顺序，所述氨基酸序列包括以下氨基酸区(除非另有说明)：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。“可变结构域”包含能够折叠成具有双β片结构的规范结构域(vh或vl)的氨基酸序列，其中β片通过第一β片与第二β片的残基之间的二硫键连接。
[0171]
抗体互补决定区(“cdr”)包含由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或t细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个框架区之间。例如，cdr可以由种系序列或重排的或未重排的序列编码，并且例如可以由原初或成熟b细胞或t细胞编码。在一些情况下(例如，对于cdr3)，cdr可以由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述序列不是连续的(例如，在未重排的核酸序列中)，但在b细胞核酸序列中是连续的，例如，这是拼接或连接序列(例如，v-d-j重组以形成重链cdr3)的结果。以上抗体组分中的每一种可以根据本发明产生。
[0172]
双特异性抗体包含能够与两个或更多个表位选择性地结合的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，其中每条重链与不同表位特异性地结合——在两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子(例如，同一抗原)上特异性地结合。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性地结合，那么第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个、三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的目标上(实例，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条重链具有三个重链cdr，随后是(n末端至c末端)ch1结构域、铰链、ch2结
构域和ch3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或者可以与每条重链缔合且可以与由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位结合，或者可以与每条重链缔合且使得所述重链中的一条或两条重链能够与一个或两个表位结合，并且可以根据本发明产生。
[0173]
例如，对于抗体实施例，本发明可修改为基于所有主要抗体类别，即igg、iga、igm、igd和ige进行诊断和治疗的研究和产生用途。igg是优选的类别，如igg1(包含igg1λ和igg1κ)、igg2和igg4。要根据本发明产生的示例性抗体包含阿利库单抗、阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。另外的抗体实施例包含人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg1抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg2抗体。在一个实施例中，所述抗体为igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg4抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg1抗体。在一个实施例中，所述抗体为嵌合igg2/igg1/igg4抗体。
[0174]
在另外的实施例中，所述抗体选自由以下组成的组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0203579a1号中所描述的抗pd1抗体)、抗程序性细胞死亡配体-1(例如，如美国专利申请公开第us2015/0203580a1号中所描述的抗pd-l1抗体)、抗dll4抗体、抗血管生成素-2抗体(例如，如美国专利第9,402,898号中所描述的抗ang2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如美国专利第9,018,356号中所描述的抗angptl3抗体)、抗血小板源性生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,265,827号中所描述的抗pdgfr抗体)、抗erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利第9,302,015号中所描述的抗prlr抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0313194a1号中所描述的25抗c5抗体)、抗tnf抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号中所描述的抗egfr抗体，或者如美国专利申请公开第us2015/0259423a1号中所描述的抗egfrviii抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或美国专利申请公开第us2014/0044730a1号中所描述的抗pcsk9抗体)、抗生长和分化因子-8抗体(例如，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所描述的抗gdf8抗体，也被称为抗肌肉生长抑制素抗体)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利申请公开第us2015/0337045a1号或第us2016/0075778a1号中所描述的抗gcgr抗体)、抗vegf抗体、抗il1r抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271681a1号或美国专利第8,735,095或第8,945,559号中所描述的抗il4r抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中所描述的抗il6r抗体)、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271658a1号或第us2014/0271642a1号中所描述的抗il33抗体)、抗呼吸道合胞体病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第us2014/0271653a1号中所描述的抗rsv抗体)、抗分化簇3(例如，如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号以及美国申请第62/222,605号中所描述的抗cd3抗体)、抗分化簇20(例
如，如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号以及美国专利第7,879,984号中所描述的抗cd20抗体)、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利第9,228,014号中所描述的抗cd48抗体)、抗fel d1抗体(例如，如美国专利第9,079,948号中所描述的)、sars-cov-2治疗(regn-cov
tm
，其包括卡西瑞单抗和伊德维单抗)、抗中东呼吸道综合征病毒(例如，如美国专利申请公开第us2015/0337029a1号中所描述的抗mers抗体)、针对埃博拉的抗体混合物(regn-eb3，其包括阿替韦单抗、玛替韦单抗和奥西韦单抗-ebgn)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第us2016/0215040号中所描述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗lag3抗体或抗cd223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开第us2016/0017029号以及美国专利第8,309,088号和第9,353,176号中所描述的抗ngf抗体)以及抗活化素a抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的组：抗cd3 x抗cd20双特异性抗体(如美国专利申请公开第us2014/0088295a1号和第us20150266966a1号)、抗cd3 x抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗cd3 x抗muc16双特异性抗体)和抗cd3 x抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗cd3x抗psma双特异性抗体)。还参见美国专利公开第us 2019/0285580 a1号。
[0175]
抗体衍生物和片段可根据本发明进行修改以用于产生，并且包含但不限于：抗体片段(例如，scfv-fc、dab-fc、半抗体)、多特异性(例如，igg-scfv、igg-dab、scfv-fc-scfv、三特异性)和fc融合蛋白(例如，fc融合(n末端)、fc融合(c末端)、单fc融合、双特异性fc融合)。短语“含fc的蛋白质”包含抗体、双特异性抗体、含有fc的抗体衍生物、含有fc的抗体片段、fc融合蛋白、免疫粘附素以及包括至少免疫球蛋白ch2和ch3区的功能部分的其它结合蛋白。“功能部分”是指可以与fc受体的ch2和ch3区(例如，fcyr；或fcrn(新生儿fc受体)结合，和/或可以参与补体活化。如果ch2和ch3区含有缺失、取代和/或插入或使其不能够与任何fc受体结合，并且也不能活化补体的其它修饰，则ch2和ch3区不是功能性的。
[0176]
抗原结合分子(abm)和具有非天然形式的abm缀合物，如非天然构型的fab结构域，可以根据本发明表达，并且在wo 2021/026409 a1中公开。多特异性结合分子(mbm)和mbm缀合物可以根据本发明产生，并且在wo 2021/091953a1和wo 2021/030680a1中公开。
[0177]
含fc的蛋白质可以包括免疫球蛋白结构域中的修饰，包含其中修饰影响结合蛋白的一种或多种效应功能(例如，影响fcyr结合、fcrn结合并且由此影响半衰期和/或cdc活性的修饰)。这些修饰包含但不限于，参照免疫球蛋白恒定区的eu编号的以下修改和其组合：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
[0178]
例如，并且不是通过限制的方式，结合蛋白是含fc的蛋白质，并且表现出增强的血清半衰期(与没有所叙述的修饰的同一含fc的蛋白质相比)，并且具有位于以下位置处的修饰：250(例如，e或q)；250和428(例如，l或f)；252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)；或位于428和/或433(例如，l/r/si/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)处的修饰；或位于250和/或428处的修饰；或位于307或308(例如，308f、v308f)和434处
的修饰。在另一实例中，修饰可以包括428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、2591(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如，t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如，308f或308p)。
[0179]
如以上阐述的，本发明还适用于产生其它分子，包含融合蛋白。这些蛋白质可以包括在其自然状态下未融合的两种或更多种蛋白质的一部分或全部，所述蛋白质之一是免疫球蛋白分子的fc部分。fc融合蛋白包含fc融合(n末端)、fc融合(c末端)、单fc融合和双特异性fc融合。以下中已经描述了包括与抗体源性多肽的不同部分(包含fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备：例如，ashkenazi等人,《美国国家科学院院刊》88:10535-39(1991)；byrn等人,《自然》344:677-70,1990；以及hollenbaugh等人,“免疫球蛋白融合蛋白的构建(construction of immunoglobulin fusion proteins)”《当代免疫学实验指南》,增刊4,第10.19.1-10.19.11页(1992)。受体含fc的蛋白质还在以下中描述：c.huang,“受体-fc融合治疗剂、trap和mfmetibody技术(receptor-fc fusion therapeutics,traps,and mfmetibody technology)”20(6)《生物技术当前述评》692-9(2009)。
[0180]
受体fc融合蛋白包括与fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域中的一个或多个胞外结构域，在一些实施例中，所述fc部分包括铰链区，随后是免疫球蛋白的ch2结构域和ch3结构域。在一些实施例中，fc融合蛋白含有两个或更多个不同的受体链，所述受体链与单个或多于一个配体结合。一些受体fc融合蛋白可以含有多种不同受体的配体结合结构域。
[0181]
在一些实施例中，fc融合蛋白是受体fc融合蛋白，所述受体fc融合蛋白含有与fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施例中，fc部分包括铰链区，随后是igg的ch2结构域和ch3结构域。在一些实施例中，受体fc融合蛋白含有与单个配体或多个配体结合的两条或更多条不同的受体链。例如，fc融合蛋白是trap蛋白，例如il-1trap(例如，利纳西普，其含有与和higg1的fc融合的il-1r1细胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利第6,927,044号)或vegf trap(实例，阿柏西普或ziv-阿柏西普)，其含有与和higg1的fc融合的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利第7,087,411号和第7,279,159号)。在其它实施例中，fc融合蛋白是scfv-fc融合蛋白，所述scfv-fc融合蛋白含有与fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(如可变重链片段和可变轻链片段)中的一个或多个抗原结合结构域。
[0182]
微型trap蛋白是使用多聚化组分(mc)而不是fc部分的trap蛋白，并且在美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中公开，并且可以根据发明产生。
[0183]
尽管已参考示例性实施例描述了本发明，但本领域的技术人员将理解，在不背离本发明的范围的情况下，可以做出各种改变并且可以用等效物取代本发明的要素。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可以做出许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，本发明并不旨在局限于作为设想用于实施本发明的最佳模式而公开的特定实施例，而是本发明将包含落入所附权利要求的范围内的所有实施例。

技术特征：
1.一种用于在生产重组蛋白时通过培养重组真核细胞来改进重组蛋白滴度的方法，所述方法包括：(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述真核细胞为cho细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达所关注重组蛋白在生产期、生长期或两者期间发生。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞在生产期、生长期或两者期间发生。7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。8.根据权利要求1所述的方法，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约5％。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白为抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白包括fc结构域。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：fc融合蛋白、受体fc融合蛋白(trap)、抗体、抗体片段和scfv-fc融合蛋白。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：抗pd1抗体、抗pdl-1抗体、抗dll4抗体、抗ang2抗体、抗angptl3抗体、抗pdgfr抗体、抗erb3抗体、抗prlr抗体、抗tnf抗体、抗egfr抗体、抗pcsk9抗体、抗gdf8抗体、抗gcgr抗体、抗vegf抗体、抗il1r抗体、抗il4r抗体、抗il6r抗体、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗rsv抗体、抗ngf抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗cd48抗体、抗cd3/抗cd20双特异性抗体、抗cd3/抗muc16双特异性抗体以及抗cd3/抗psma双特异性抗体。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：阿利库单抗(alirocumab)、阿替韦单抗(atoltivimab)、玛替韦单抗(maftivimab)、奥西韦单抗(odesivimab)、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗(casirivimab)、伊德维单抗(imdevimab)、西米普利单抗(cemiplimab)、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗(dupilumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗(fasimumab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、曲戈卢单抗(trevogrumab)、利努苏单抗(rinucumab)和沙利鲁单抗(sarilumab)。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述重组蛋白为度普利尤单抗。15.一种杂质减少的细胞培养基，所述培养基包括杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液并且具有每摩尔总hepes少于约800μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约80μmol分子量为221.06的hepes相关杂质。16.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中所述培养基不含水解产物。17.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中所述培养基是化学限定的。18.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括胰岛素。19.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括≥0.09mm
±
0.014mm鸟氨酸、≥0.20
±
0.03mm腐胺或其组合。20.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括≥40
±
6mm氨基酸或其盐的混合物。21.根据权利要求20所述的细胞培养基，其中所述氨基酸的混合物由以下组成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。22.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括一种或多种脂肪酸和生育酚。23.根据权利要求22所述的细胞培养基，其中所述一种或多种脂肪酸选自由以下组成的组：亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、二十四酸、肉豆蔻酸和辛酸。24.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括核苷的混合物。25.根据权利要求24所述的细胞培养基，其中所述核苷的混合物包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤中的一者或多者。26.根据权利要求25所述的细胞培养基，其包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。27.根据权利要求15所述的细胞培养基，其进一步包括一种或多种二价阳离子的盐。28.根据权利要求27所述的细胞培养基，其中所述二价阳离子为镁、钙或两者。29.根据权利要求28所述的细胞培养基，其包括ca
2+
和mg
2+
。30.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中所述培养基为化学限定培养基并且包括：hepes缓冲液；氨基酸的混合物；任选地核苷的混合物；一种或多种脂肪酸和生育酚；一种或多种二价阳离子的盐；以及一种或多种维生素。31.根据权利要求30所述的细胞培养基，其进一步包括胰岛素。32.一种用于选择在细胞培养中用于改进细胞培养性能的限定细胞培养基的方法，所述方法包括：
(a)提供限定细胞培养基，所述限定细胞培养基包括4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液；(b)分析包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基，以确定所述限定细胞培养基中存在的分子量为267.07的hepes相关杂质的量和分子量为221.06的hepes相关杂质的量；(c)如果确定包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质，则选择包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基用于细胞培养；其中相比于非hepes相关杂质减少的培养基中的细胞培养性能，对具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质的包括所述hepes缓冲液的所述限定细胞培养基的使用会改进细胞培养性能。33.根据权利要求32所述的方法，其中改进的细胞培养性能包含改进的细胞培养滴度和/或细胞生长。34.一种用于选择在细胞培养中用于改进细胞培养性能的hepes缓冲液的方法，所述方法包括：(a)提供4-羟乙基哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液；(b)分析所述hepes缓冲液，以确定所述hepes缓冲液中存在的分子量为267.07的hepes相关杂质的量和分子量为221.06的hepes相关杂质的量；(c)如果确定所述hepes缓冲液具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质，则选择所述hepes缓冲液用于细胞培养；其中相比于在存在具有较高量的所述杂质的hepes缓冲液的情况下的细胞培养性能，对具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔要与所述细胞培养结合使用的总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质的所述hepes缓冲液的使用会改进细胞培养性能。35.根据权利要求34所述的方法，其中改进的细胞培养性能包含改进的细胞培养滴度和/或细胞生长。36.一种细胞培养物，其包括细胞和根据权利要求15至31中任一项所述的细胞培养基。37.根据权利要求36所述的细胞培养物，其中所述细胞为真核细胞。38.根据权利要求37所述的细胞培养物，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。39.根据权利要求36所述的细胞培养物，其中所述细胞能够表达选自由以下组成的组的抗体：阿利库单抗、阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。40.根据权利要求39所述的细胞培养物，在所述细胞能够表达度普利尤单抗时。41.根据权利要求8所述的方法，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约10％。
42.根据权利要求8所述的方法，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约15％。43.根据权利要求8所述的方法，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约25％。44.根据权利要求1所述的方法，其中杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比在非杂质减少的培养基中培养的细胞的倍增速率高至少5％。45.根据权利要求44所述的方法，其中杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比在非杂质减少的培养基中培养的细胞的倍增速率高至少10％。46.根据权利要求44所述的方法，其中杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比在非杂质减少的培养基中培养的细胞的倍增速率高至少15％。47.根据权利要求44所述的方法，其中杂质减少的培养基中的活细胞的倍增速率比在非杂质减少的培养基中培养的细胞的倍增速率高至少25％。48.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包括至少一种选自由以下组成的组的化合物：乙烯基磺酸、hepes+[o]-[h2]、乙酰胺基甲烷-磺酸、hepes+[o]、2,2-二羟基乙烷-磺酸、hepes-[c2h6]+[o][含so3]物种。49.一种细胞培养物，其包括(i)至少一种重组真核细胞，所述至少一种重组真核细胞能够表达重组蛋白；以及(ii)细胞培养基，其中所述细胞培养物是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。50.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。51.根据权利要求50所述的细胞培养物，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。52.根据权利要求51所述的细胞培养物，其中所述真核细胞为cho细胞。53.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中所述表达所关注重组蛋白在生产期、生长期或两者期间发生。54.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞在生产期、生长期或两者期间发生。55.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中在所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。
56.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约5％。57.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中所述重组蛋白为抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。58.根据权利要求49所述的细胞培养物，其中所述重组蛋白包括fc结构域。59.根据权利要求58所述细胞培养物，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：fc融合蛋白、受体fc融合蛋白(trap)、抗体、抗体片段和scfv-fc融合蛋白。60.根据权利要求59所述的细胞培养物，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：抗pd1抗体、抗pdl-1抗体、抗dll4抗体、抗ang2抗体、抗angptl3抗体、抗pdgfr抗体、抗erb3抗体、抗prlr抗体、抗tnf抗体、抗egfr抗体、抗pcsk9抗体、抗gdf8抗体、抗gcgr抗体、抗vegf抗体、抗il1r抗体、抗il4r抗体、抗il6r抗体、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗rsv抗体、抗ngf抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗cd48抗体、抗cd3/抗cd20双特异性抗体、抗cd3/抗muc16双特异性抗体以及抗cd3/抗psma双特异性抗体。61.根据权利要求59所述的细胞培养物，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：阿利库单抗、阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。62.根据权利要求61所述的细胞培养物，其中所述重组蛋白为度普利尤单抗。63.一种在细胞培养物中产生的重组蛋白，所述细胞培养物包括(i)至少一种重组真核细胞，所述至少一种重组真核细胞能够表达所述重组蛋白；以及(ii)细胞培养基，其中所述重组蛋白是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供杂质减少的限定细胞培养基，所述限定细胞培养基具有每摩尔总hepes少于约4000μmol分子量为267.07的hepes相关杂质和每摩尔总hepes少于约400μmol分子量为221.06的hepes相关杂质；(b)在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞；(c)从所述重组真核细胞表达所关注重组蛋白；以及(d)相对于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，在所述杂质减少的限定细胞培养基中产生所述重组蛋白的较高滴度。64.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。65.根据权利要求64所述的重组蛋白，其中所述真核细胞选自由以下组成的组：cho细胞、cos细胞、视网膜细胞、vero细胞、cv1细胞、肾细胞、hela细胞、hepg2细胞、wi38细胞、mrc 5细胞、colo25细胞、hb 8065细胞、hl-60细胞、淋巴细胞、a431细胞、cv-1细胞、u937细胞、3t3细胞、l细胞、c127细胞、sp2/0细胞、ns-0细胞、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞以及源自前述细胞的细胞系。66.根据权利要求65所述的重组蛋白，其中所述真核细胞为cho细胞。
67.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中所述表达所关注重组蛋白在生产期、生长期或两者期间发生。68.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中所述在所述杂质减少的限定细胞培养基中培养所述重组真核细胞在生产期、生长期或两者期间发生。69.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中在所述培养所述重组真核细胞期间的细胞生长高于类似或相同重组真核细胞在非杂质减少的培养基中的细胞生长。70.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中相比于在非减少杂质的培养基中培养的类似或相同细胞的滴度，所述重组蛋白的所述较高滴度提高至少约5％。71.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白为抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗、三抗或四抗、fab片段或f(ab')2片段、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体。72.根据权利要求63所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括fc结构域。73.根据权利要求72所述重组蛋白，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：fc融合蛋白、受体fc融合蛋白(trap)、抗体、抗体片段和scfv-fc融合蛋白。74.根据权利要求73所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：抗pd1抗体、抗pdl-1抗体、抗dll4抗体、抗ang2抗体、抗angptl3抗体、抗pdgfr抗体、抗erb3抗体、抗prlr抗体、抗tnf抗体、抗egfr抗体、抗pcsk9抗体、抗gdf8抗体、抗gcgr抗体、抗vegf抗体、抗il1r抗体、抗il4r抗体、抗il6r抗体、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗rsv抗体、抗ngf抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗cd48抗体、抗cd3/抗cd20双特异性抗体、抗cd3/抗muc16双特异性抗体以及抗cd3/抗psma双特异性抗体。75.根据权利要求73所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白选自由以下组成的组：阿利库单抗、阿替韦单抗、玛替韦单抗、奥西韦单抗、奥西韦单抗-ebgn、卡西瑞单抗、伊德维单抗、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc、度普利尤单抗、依维苏单抗、依维苏单抗-dgnb、法司努单抗、奈伐苏单抗、曲戈卢单抗、利努苏单抗和沙利鲁单抗。76.根据权利要求75所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白为度普利尤单抗。77.一种根据以上权利要求中任一项的细胞。78.一种根据以上权利要求中任一项的细胞培养物。79.一种根据以上权利要求中任一项的方法。80.一种根据以上权利要求中任一项的重组蛋白。

技术总结
提供了在细胞培养中使用杂质减少的细胞培养基来改进重组蛋白滴度和细胞滴度的方法，以及可以用于生产具有改进的滴度的重组蛋白和细胞的杂质减少的细胞培养基。所述杂质减少的细胞培养基包括HEPES缓冲液，并且所述减少的杂质为HEPES相关杂质。在某些方面中，方法和培养基改进蛋白质滴度、细胞生长和/或活细胞密度。密度。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/9/16