靶向DLL3的抗体、抗原结合片段及其用途的制作方法

靶向dll3的抗体、抗原结合片段及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，尤其涉及一种靶向dll3的抗体、抗原结合片段及其用途。


背景技术：

2.细胞内的notch信号通路调节许多正常发育必须的基本过程，包括控制分化、存活、增殖和血管生成。notch信号通路由notch受体,notch配体和csl dna结合蛋白等构成。研究发现notch通路与肿瘤关系密切，参与肿瘤增殖、侵袭转移及新生血管形成等过程。
3.dll3，即δ样配体(delta-like ligand 3，dll3)，为细胞表面的单次跨膜蛋白，属于notch配体家族。人dll3蛋白由619个氨基酸组成，包含1个dsl结构域、1个胞内结构域和6个表皮生长因子样结构域。胞外结构域n端的dsl基因序列在配体家族中高度保守，是与notch受体结合所必须的功能结构域。dll3在正常肺、包含肺鳞状细胞的原发肿瘤(nsclc-sqcc)中无表达，在肺腺癌(nsclc-adeno)、肺大细胞神经内分泌癌(lcnec)、天然小细胞肺癌(sclc)、复发/难治性小细胞肺癌(r/r sclc)表达较高。
4.肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,sclc)和非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,nsclc)。nsclc包括腺癌、鳞癌及大细胞肺癌。最常见的组织学分类是腺癌，其次是小细胞癌，鳞状细胞癌或神经内分泌肿瘤次之。我国肺癌发病率及死亡率在恶性肿瘤中居首位。为患者确定新的治疗途径，是一个迫切的临床需求领域。
5.针对以上，制备对抗dll3抗体，将其作为改善和/或治疗癌症，尤其是高表达dll3的癌症，具有重大意义。如何提供一种针对dll3高亲和力的抗dll3抗体，以及将其用于改善和/治疗高表达dll3的癌症，成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明提供一种抗dll3抗体或其抗原结合片段,能结合dll3。
7.本发明还提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸；含有所述核酸的质粒；含有所述核酸的慢病毒载体；含有所述核酸的细胞；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述细胞的药物组合物；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合物的试剂盒；所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合物在预防、治疗、检测或诊断与dll3相关的疾病的应用；抗dll3抗体或其抗原结合片段在制备抗体-药物偶联物(adc)中的应用以及抗dll3抗体-药物偶联物；抗dll3抗体或其抗原结合片段在制备嵌合抗原受体(car)中的应用以及靶向dll3嵌合抗原受体的细胞。
8.本发明的第一个方面提供一种抗dll3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含下述3个轻链互补决定区和3个重链互补决定区，
9.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:5所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:7所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如
10.seq id no:1所示hcdr1，如seq id no:2所示的hcdr2,如seq id no:3所示的hcdr3；
11.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:5所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:12所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:1所示hcdr1，如seq id no:9所示的hcdr2,如seq id no:10所示的hcdr3；
12.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:18所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:9所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如
13.seq id no:14所示hcdr1，如seq id：15所示的hcdr2,如seq id no:16所示的hcdr3；
14.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:5所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:25所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:21所示hcdr1，如seq id：22所示的hcdr2,如seq id no:23所示的hcdr3；
15.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:34所示lcdr1,如seq id no:35所示lcdr2,如seq id no:36所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:32所示hcdr1，如seq id：31所示的hcdr2,如seq id no:30所示的hcdr3；
16.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:42所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:43所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:38所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2,如seq id no:40所示的hcdr3；
17.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:34所示lcdr1,如seq id no:35所示lcdr2,如seq id no:47所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:44所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2,如seq id no:45所示的hcdr3；
18.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:48所示lcdr1,如seq id no:6所示lcdr2,如seq id no:19所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:44所示hcdr1，如seq id：46所示的hcdr2,如seq id no:45所示的hcdr3；
19.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:52所示lcdr1,如seq id no:53所示lcdr2,如seq id no:54所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:49所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2,如seq id no:50所示的hcdr3；
20.所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:58所示lcdr1,如seq id no:53所示lcdr2,如seq id no:64所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:60所示hcdr1，如seq id：61所示的hcdr2,如seq id no:62所示的hcdr3；
21.或者所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no:70所示
22.lcdr1,如seq id no:71所示lcdr2,如seq id no:72所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no:66所示hcdr1，如seq id：67所示的hcdr2,如seq id no:68所示的hcdr3。
23.在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供一种抗dll3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
24.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:13所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:11所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
25.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:20所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:17所示的氨基
酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
26.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:26所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:24所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
27.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:29所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:27所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
28.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:37所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:33所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
29.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:44所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:41所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
30.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:77所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:46所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
31.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:47所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:76所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
32.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:55所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:51所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
33.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:59所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:57所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
34.所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:65所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:63所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
35.或者所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:73所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no:69所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区。
36.在本发明的一个具体实施方式中，包含与seq id no:200所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链恒定区，和包含与seq id no:201所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链恒定区。
37.在本发明的方案中，本发明的所述抗体或其抗原结合片段包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv或dsfv片段等形式。
38.本发明的第二方面提供了一种核酸，编码所述抗体或其抗原结合片段。
39.本发明的第三方面提供了一种载体，其包含编码所述抗体或其抗原结合片段的所述核酸。所述载体可用于表达所述抗体或其抗原结合片段。优选地，所述载体可以是病毒载
体；优选地，所述病毒载体包含但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等；优选地，所述载体可以是非病毒载体；优选地，所述载体可以是哺乳细胞表达载体；优选地，所述表达载体可以是细菌表达载体；优选地，所述表达载体可以是真菌表达载体。
40.本发明的第四方面提供了一种细胞，所述细胞包括所述核酸或所述载体，所述细胞可表达所述抗体或其抗原结合片段。优选地，所述细胞为细菌细胞；优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞等；优选地，所述细胞为真菌细胞；优选地，所述真菌细胞为酵母细胞；优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞等；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、人胚胎肾细胞(293)、b细胞、t细胞、dc细胞或nk细胞等。
41.本发明的第五方面提供了一种药物组合物，其包所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，优选地，所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。
42.本发明的第六方面提供了一种试剂盒，其包含本发明所述抗体或其抗原结合片段，或包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸。
43.本发明的第七方面提供了所述抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞在制备治疗或预防疾病的药物组合物中的应用。
44.本发明的第八方面提供了所述抗体或其抗原结合片段或核酸在制备诊断、检测试剂盒中的应用。
45.本发明的第九方面提供了一种治疗或预防疾病的方法，包括将本发明的所述抗体或抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物施用于有需要的受试者。
46.本发明的第十方面提供了一种诊断、检测的方法，包括将本发明的所述抗体或抗原结合片段、核酸、试剂盒或药物组合物用于有需要的受试者或样本。
47.本发明的第十一方面提供了所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗、预防疾病的用途。
48.本发明的第十二方面提供了所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、试剂盒、或药物组合物用于检测、诊断的用途。
49.本发明的第十三方面提供了所述抗体或其抗原结合片段，所述的核酸，或所述的药物组合物用于预防、治疗、检测或诊断与dll3相关的疾病的应用。
50.在本发明的方案中，所述与dll3相关的疾病为癌症，进一步的，所述癌症包括但不限于肺腺癌(nsclc-adeno)、肺大细胞神经内分泌癌(lcnec)、天然小细胞肺癌( sclc)、复发/难治性小细胞肺癌(r/r sclc)的一种或多种。
51.本发明还提供了dll3抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗、检测或诊断与dll3相关的疾病的应用；所述dll3相关的疾病包括癌症；进一步的，所述癌症包括肺腺癌(nsclc-adeno)、肺大细胞神经内分泌癌(lcnec)、天然小细胞肺癌( sclc)、复发/难治性小细胞肺癌(r/r sclc)的一种或多种。
52.本发明还提供了dll3抗体或其抗原结合片段在制备抗体-药物偶联物(adc)中的应用。
53.本发明还提供了dll3抗体偶联物，所述抗dll3抗体偶联物包括(a)所述的dll3抗体或其抗原结合片段,和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。在一优选例中，所述药物选
自下组：化疗药物、放疗药物、激素治疗药物或免疫治疗药物。
54.本发明还提供了dll3抗体或其抗原结合片段在制备靶向dll3嵌合抗原受体中的应用。
55.本发明还提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与dll3特异性结合的dll3抗原结合结构域；优选的，car依次包括所述抗体或其抗原结合片段、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。
56.本发明还提供了表达所述嵌合抗原受体的工程化免疫细胞，所述免疫细胞是t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、nk细胞、表达tcr的细胞、树突状细胞或nk-t细胞。
57.本发明还提供包含所述工程化免疫细胞的药物组合物。
58.本发明提供的靶向dll3的抗体、抗原结合片段具有以下的一种或多种优势：
59.1、本发明提供的抗dll3抗体或其抗原结合片段对人dll3蛋白、以及表达dll3的细胞具有良好的亲和力，其亲和力为对照组的22倍以上；
60.2、本发明提供的抗dll3抗体或其抗原结合片段对恒河猴、食蟹猴、大鼠、小鼠来源的dll3蛋白均具有结合活性，在不同种属间具有交叉反应活性。
附图说明
61.图1为dll3蛋白免疫小鼠血清滴度结果图；
62.图2a-图2b为本技术抗体与人dll3-his蛋白的elisa结合活性结果图；
63.图3a-图3b为本申抗体与ct26-hdll3细胞的结合活性结果图；
64.图4a-4d为抗体对不同种属:小鼠、大鼠、食蟹猴、恒河猴来源的dll3蛋白的交叉反应结果图。
具体实施方式
65.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
66.实施例1.抗dll3单克隆抗体的产生
67.1.1方法材料
68.表1使用的免疫蛋白和小鼠
[0069][0070]
将dll3-fc、dll3-his两种标签的dll3抗原蛋白，采用腹部皮下注射的方式免疫小鼠，首免使用弗氏完全佐剂乳化抗原，二次免疫-四次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化抗原。使用表1蛋白免疫小鼠后，检测小鼠血清滴度结果如图1所示，图1展示的dll3蛋白免疫小鼠血清滴度中500x，2500x，12500x，以及62500x代表血清稀释比例。
[0071]
1.2噬菌体库的建立
[0072]
处死小鼠，解剖取出脾脏，把脾脏用注射器胶塞研磨破碎并用滤网过滤，把滤过的脾细胞冷冻备，提取rna后获得cdna，噬菌体库的建立依据通常方法进行。构建库的库容数据如表2所示。
[0073]
表2各毒株免疫小鼠构建噬菌体库库容
[0074]
库名q01q03q04q11库容(个)8.4
×
1082.0
×
1091.5
×
1092.0
×
109库名q08q09q10 库容(个)1.2
×
1099
×
1081.3
×
10
9 [0075]
1.3以两种方法进行筛选
[0076]
1.3.1平板筛选，用dll3-his蛋白包被平板。第二天加入噬菌体库孵育2h，洗涤4-10次后用洗脱缓冲液洗脱特异性结合的噬菌体。
[0077]
1.3.2磁珠筛选，将dll3-fc蛋白按照试剂盒步骤进行生物素化，再与thermo的磁珠结合，经bsa封闭后与噬菌体库孵育2h，洗涤4-10次后用elution buffer洗脱特异性结合的噬菌体。筛选获得的抗体克隆及来源库见表3。
[0078]
表3活性抗体来源
[0079]
抗体编号来源库抗体编号来源库dl3-ba83q4dl3-ba412q9dl3-ba108q8dl3-ba564q3dl3-ba303q4dl3-ba654q10dl3-ba304q4dl3-ba229q11dl3-ba306q4dl3-ba244q11dl3-ba136q9dl3-ba131q8dl3-ba332q1
ꢀꢀ
[0080]
实施例2.完整抗体的分子构建与生产
[0081]
构建13个阳性克隆igg1，抗体可变区氨基酸序列如下表4：(cdr区以下划线标识，分析系统为imgt系统)。
[0082]
表4.活性克隆氨基酸序列的可变区序列
[0083]
[0084]
[0085]
[0086][0087]
通过常规的分子生物学技术pcr(2
×
phanta max master mix厂家：vazyme货号：
[0088]
p515-p1-aa批号：7e351h9)扩增抗体可变区基因，通过同源重组分别将抗体重链可变区基因连接入带有抗体重链恒定区序列的核酸序列的载体pcdna3.4(life technology)，将抗体轻链可变区基因连接入带有抗体轻链恒定区序列的核酸序列的载体pcdna3.4。
[0089]
本技术实施例中各抗体的可变区序列参见表4，重链和轻链恒定区序列见表5。
[0090]
表5重链和轻链恒定区序列
[0091][0092]
将测序后的阳性克隆提取质粒后共转染进入hek293细胞在37℃\8％ co2\125rpm摇床中培养，瞬时表达7天后上清通过protein a亲和层析，纯化获得抗体，并通过uv280结合理论消光系数确定抗体浓度。
[0093]
实施例3.anti-dll3单克隆抗体分子的表征
[0094]
3.1 elisa检测抗体与人dll3-his蛋白的结合
[0095]
用ph 9.6 cbs稀释人dll3-his蛋白至0.1μg/ml包被酶标板,100μl/孔，4℃孵育过夜；洗板后用脱脂奶粉封闭。洗板后每孔加入pbst梯度稀释好的抗体100μl，37℃孵育1h；洗板后加入pbst稀释的hrp标记的羊抗人igg(h+l)抗体，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μl tmb显色，10min后每孔加入50μl 2m h2so4终止显色，用酶标仪读取od450，图2a-2b为抗体与人dll3-his蛋白的elisa结合活性，结果显示42个抗体均表现出较佳的结合活性。图2a-2b中的isotype为自制的其他靶点的无关igg1抗体，作为空白对照。isotype未显示结合活性，以抗体浓度为0.1μg/ml为例，isotype od450＝0.127，抗体组od450为2.8-4.5，抗体组od450为isotype的22倍以上。
[0096]
3.2流式细胞仪检测抗体与ct26-hdll3细胞的结合
[0097]
用pbs将对数生长期的ct26-hdll3细胞(康源博创，kc-1129)稀释至2e6/ml，将梯度稀释的抗体和细胞混合：100μl体系＝50μl抗体+50μl细胞，4℃静置孵育1h。离心弃上清后，用pbs重悬洗涤细胞，加入100μl/w二抗fitc anti-human igg fc，混合均匀，避光4℃孵育0.5h。用pbs洗涤细胞后用100μl/孔pbs重悬细胞，用流式细胞仪检测。各抗体与细胞的结合活性曲线如图3a-3b所示，图3a-3b展示了抗体与ct26-hdll3细胞的结合活性，图3a-3b中的isotype为自制的其他靶点的无关igg1抗体，作为空白对照。isotype未表现出结合活性，以抗体浓度为10μg/ml为例，isotype的mfi为10120，抗体组mfi为26276-78408，抗体组mfi为isotype的2.6-7.7倍，ec
50
值见表6。各抗体均可以和ct26-hdll3细胞特异结合，且结合活性较高，结合ec
50
为《0.1～7.216μg/ml。
[0098]
表6各抗体与ct26-hdll3细胞结合的ec
50
[0099]
样品编号ec
50
(μg/ml)样品编号ec
50
(μg/ml)dl3-ba3040.358dl3-ba4127.216dl3-ba332《0.1dl3-ba830.987dl3-ba1363.381dl3-ba3030.151dl3-ba2440.215dl3-ba2291.110dl3-ba3060.100dl3-ba5640.407
dl3-ba108《0.1dl3-ba6540.298dl3-ba1311.705isotype(对照组)》40
[0100]
3.3检测抗体与hdll3-his蛋白的亲和力
[0101]
将人dll3-his蛋白用1x hbs-ep
+
buffer 2倍梯度稀释5个浓度，分别为50nm、25nm、12.5nm、6.25nm和3.125nm。用1x hbs-ep
+
稀释抗体样品至2μg/ml，用proa芯片捕获抗体样品，设置仪器捕获时间为70s，流速10μl/min；分析物：结合60s，流速30μl/min，解离600s；再生：用ph 1.5的10mm glycine-hcl buffer再生30s，流速30μl/min，startup 3次。使用1:1binding模型(biacore insight evaluation software version 2.0.15.12933)计算平衡解离常数(kd)。isotype(对照组)没有结合活性，显示出无亲和力；各抗体的亲和力结果如表所示，dl3-ba83、dl3-ba108、dl3-ba131、dl3-ba136亲和力较弱kd大于1.0e-09，其他抗体亲和力均较高，kd小于1.0e-09。
[0102]
表7各抗体与人dll3-his蛋白的亲和力
[0103]
样品编号kd(m)样品编号kd(m)dl3-ba3329.63e-11dl3-ba831.81e-08dl3-ba3066.87e-11dl3-ba1082.53e-08dl3-ba2447.05e-11dl3-ba1314.59e-08dl3-ba3037.70e-09dl3-ba1363.73e-08dl3-ba3044.69e-10dl3-ba4126.15e-09dl3-ba5642.06e-11dl3-ba2293.21e-09dl3-ba6541.26e-11isotype(对照组)无亲和力
[0104]
3.4检测抗体对不同种属dll3蛋白的交叉反应
[0105]
用ph 9.6cbs稀释人dll3-his蛋白或小鼠dll3蛋白(恺佧，dll-mm103)或大鼠dll3蛋白(acro，dl3-r52h3)或食蟹猴dll3蛋白(acro，dl3-c52h3)或恒河猴dll3蛋白(acro，dl3-r52h4)至0.2μg/ml包被酶标板,100μl/孔，4℃孵育过夜；洗板后用脱脂奶粉封闭。洗板后每孔加入pbst梯度稀释好的抗体100μl，37℃孵育1h；洗板后加入pbst稀释的hrp标记的羊抗人igg(h+l)抗体，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μl tmb显色，10min后每孔加入50μl 2m h2so4终止显色，用酶标仪读取od450，图4a-d显示抗体对不同种属dll3蛋白的交叉反应。
[0106]
如图4c-4d结果所示，各抗体与恒河猴和食蟹猴dll3蛋白的结合活性基本一致，dl3-ba332、dl3-ba 244、dl3-ba304、dl3-ba564、dl3-ba654、dl3-ba306均有较高结合活性。
[0107]
如图4a展示与小鼠dll3的结合活性显示，dl3-ba332、dl3-ba 244、dl3-ba304、dl3-ba229、dl3-ba564、dl3-ba654、dl3-ba306与小鼠dll3蛋白都有较高结合活性。
[0108]
如图4b展示与大鼠dll3蛋白结合活性显示，dl3-ba332、dl3-ba304、dl3-ba229、dl3-ba564、dl3-ba654、dl3-ba306与大鼠dll3蛋白均有较高的结合活性。

技术特征：
1.一种抗dll3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含下述3个轻链互补决定区和3个重链互补决定区，所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：5所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：7所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：1所示hcdr1，如seq id no：2所示的hcdr2，如seq id no：3所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：5所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：12所示lcdr3；和/3个重链互补决定区包含如seq id no：1所示hcdr1，如seq id no：9所示的hcdr2，如seq id no：10所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：18所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：9所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：14所示hcdr1，如seq id：15所示的hcdr2，如seq id no：16所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：5所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：25所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：21所示hcdr1，如seq id：22所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：34所示lcdr1，如seq id no：35所示lcdr2，如seq id no：36所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：32所示hcdr1，如seq id：31所示的hcdr2，如seq id no：30所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：42所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：43所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：38所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2，如seq id no：40任一所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：34所示lcdr1，如seq id no：35所示lcdr2，如seq id no：47所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：44所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2，如seq id no：45所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：48所示lcdr1，如seq id no：6所示lcdr2，如seq id no：19所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：44所示hcdr1，如seq id：46所示的hcdr2，如seq id no：45所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：52所示lcdr1，如seq id no：53所示lcdr2，如seq id no：54所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：49所示hcdr1，如seq id：39所示的hcdr2，如seq id no：50所示的hcdr3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：58所示lcdr1，如seq id no：53所示lcdr2，如seq id no：64所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：60所示hcdrl，如seq id：61所示的hcdr2，如seq id no：62所示的hcdr3；或所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含如seq id no：70所示lcdr1，如seq id no：71所示lcdr2，如seq id no：72所示lcdr3；和3个重链互补决定区包含如seq id no：66所示hcdr1，如seqid：67所示的hcdr2，如seq id no：68所示的hcdr3。2.根据权利要求1所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：4所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；
所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：13所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：11所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：20所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：17所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：26所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：24所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：29所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：27所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：37所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：33所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：44所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：41所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：77所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：46所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：47所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：76所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：55所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：51所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：59所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：57所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：65所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：63所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；或所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：73所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区，和与seq id no：69所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区。3.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含与seq id no：200所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链恒定区，和包含与seq id no：201所示的氨基酸序列具有至少95％、
96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链恒定区。4.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段。5.一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段，优选的，所述car依次包括所述抗体或其抗原结合片段、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。6.一种细胞，其特征在于，表达权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的嵌合抗原受体。7.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段，或权利要求4所述的核酸，或权利要求5所述的细胞。8.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段，权利要求4所述的核酸，权利要求5所述的嵌合抗原受体，权利要求6所述的细胞或权利要求6所述的药物组合物。9.权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段，权利要求4所述的核酸，权利要求5所述的嵌合抗原受体，权利要求6所述的细胞，权利要求7所述的药物组合物，或权利要求8所述的试剂盒在制备用于预防、治疗、检测或诊断与dll3相关的疾病产品中的应用；优选地，所述dll3相关的疾病包括癌症；更优选地，所述癌症包括肺腺癌(nsclc-adeno)、大细胞神经内分泌癌(lcnec)、天然小细胞肺癌神经内分泌癌(lcnec)、天然小细胞肺癌复发/难治性小细胞肺癌(r/r sclc)的一种或多种。10.权利要求1至3中任一项的dll3抗体或其抗原结合片段在制备靶向dll3嵌合抗原受体中的应用。

技术总结
本发明涉及一种抗DLL3靶向DLL3的抗体、抗原结合片段及其用途。所述抗DLL3抗体或其抗原结合片段包含特定氨基酸序列的3个轻链互补决定区和/或3个重链互补决定区。具体还提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，含有所述核酸的细胞，含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述细胞的药物组合物，还提供DLL3抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗、检测或诊断与DLL3相关的疾病的应用。本发明提供的抗DLL3抗体或其抗原结合片段对DLL3，以及表达DLL3的细胞具有良好的亲和力,在医药领域有广阔的前景。阔的前景。阔的前景。


技术研发人员：董创创 窦昌林 宋德勇 仉慧敏 冯健霞 矫婕
受保护的技术使用者：山东博安生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/9/14