一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒的制作方法

一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒
1.相关专利
2.本技术是申请号为2020114758176，申请日为2020年12月14日，发明名称为“一种犬埃里希体map2-p30-gp19重组蛋白及其制备方法和应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
3.本发明属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒。


背景技术：

4.犬埃里希体病(canine ehrlichiosis)是由牛蜱传染犬埃里希体(ehrlichiosis canis)引起的一种犬败血性传染病。家犬、野犬和啮齿类动物是本病的宿主。多种不同性别、年龄和品种的犬均可感染本病。此种疾病潜伏期8～12天。病犬周期性发热，食欲不振，流黏液脓液性鼻液和眼眵，贫血，体重减轻。
5.目前临床中较为直接的诊断方法为血涂片染色法，间接荧光抗体试验(indirect fluorescence antibody，ifa)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)等免疫学方法，此外pcr(聚合酶链式反应)法也是一种常用于埃里希的诊断，是用于诊断埃里希病最为敏感和特异性较高的检测方法。但是上述的免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(elisa)、聚合酶链反应(pcr)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。
6.埃里希体抗体检测方面，目前国内外研究的主要方向均是使用一种或几种部分序列进行检测抗体，这种情况势必有漏检的风险。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明第一方面提供一种犬埃里希体map2-p30-gp19重组蛋白，包括seq id no.1所示氨基酸序列。
9.在本发明中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过dna重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
10.map2(major antigenic protein 2)、外膜蛋白(major outer membrane protein)如p30、p30a、p30-1和糖蛋白(glycoprotein)如gp19等蛋白是犬埃里希主要的免疫原蛋白，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答。本发明将map2、p30和gp19蛋白的全长序列融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。
11.在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由seq id no.1所示氨基酸序列组成。
12.本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括
imidazole，ph8.0。
34.本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒中的应用。
35.本发明的第七方面提供一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒，包括本发明第一方面所述的重组蛋白。
36.进一步地，所述试剂盒还包括鼠igg和羊抗鼠igg。
37.在本发明的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体。
38.在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：
39.s1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠igg胶体金复合物；
40.s2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠igg胶体金复合物混合，制备金标垫；
41.s3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠igg作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；
42.s4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(t线)，质控区有质控线(c线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。
43.在使用时，滴加犬生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：
44.①
两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
45.②
仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
46.③
质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
47.在本发明的一些实施方案中，犬埃里希体抗体检测结果呈阳性，代表犬生物样本中含有犬埃里希体抗体，意味着犬具有犬埃里希体感染或曾被犬埃里希体感染。
48.在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。
49.本发明的有益效果
50.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
51.map2、p30和gp19蛋白是犬埃里希体主要的免疫原性抗原且高度保守，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，诱导宿主细胞产生中和抗体，因此将map2、p30和gp19蛋白全长序列融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。
52.本发明采用的胶体金标记免疫分析法是一种新型分析技术，具有快捷简便、成本低、无污染且无需培训的特点，与传统方法相比更为适合现场检测,具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。
附图说明
53.图1示出了犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：细胞破碎后上样；2：流穿；3：50mm imidazole洗脱；4：0.5m imidazole洗脱。
54.图2示出了本发明一个实施例的检测试纸条的试剂图。1：样本垫；2：金标垫；3：nc膜；31：检测线(t线)；32：质控线(c线)；4：滤纸；5：底板。
55.图3示出了本发明的一个实施例利用试纸条进行检测的结果示意图。t：检测线，c：质控线。
56.图4示出了利用本发明的试纸条对临床犬血清样本进行检测的总体结果。
具体实施方式
57.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
58.实施例
59.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
60.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
61.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
62.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
63.实施例1犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白基因表达载体的构建
64.犬埃里希map2基因是根据ncbi gene bank:af117731的蛋白序列设计，p30基因根据ncbi gene bank:wp_011305021.1的蛋白序列设计，gp19基因根据ncbi gene bank:abu44523的蛋白序列设计。。
65.map2-p30-gp19重组蛋融合白的氨基酸序列序列如下(seq id no.1)：
66.mkvikfilnicllfaaiflgysyvtkqgifqvrdhntpntnisnkasittsfslvnqdgntvnsqdflgkymlvlfgfsscksicpaelgiasevlsqlgndtdklqvifitidptndtvqklktfhehfdpriqmltgsaediekiiknykiyvgqadkdnqidhsaimyiidkkgeyishfspdlkstenqvdkllsiikqylmnckrffiasalislmsflpsvsfsesihedningnfyisakympsashfgvfsvkeekntttgvfglkqdwdgatikdassshtidpstifsisnysfkyennpflgfagaigysmggprvefevsyeifdvknqgnsykndahkycalsrhtggmpqaghqnkfvflkneglldislminacyditidsmpfspyicagigsdlvsmfettnpkisyqgklgvsysispeasvfvgghfhrvignefkdipaitpagateikgtqfttvtlnichfglelggrftfmlqvqnhvdqhtnhiehddyhftgptsfevnlseeekmelqevssidsvgcedcdpncryplelvecqrieerpvcnaglesltvdayqlglllggflsamnyisyscpcyyydccdrnyydcyhknacyynccdca
67.由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mrna有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。
68.本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，
tris，0.2m nacl，0.5m imidazole，ph8.0)洗脱目的蛋白。利用page凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。
75.由图1可知，纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mm tris，0.2m nacl，ph8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用bca法测定浓度后，于-20℃保存备用。
76.实施例4双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体
77.1双抗原夹心金标法检测条的制备
78.1.1胶体金的烧制
79.在三角烧瓶中加入1000ml超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4ml，再加入10％柠檬酸三钠溶液6ml，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。
80.1.2重组犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白的标记
81.取胶体金溶液100ml放入烧杯中，搅拌加入0.2m k2co3调节金水ph至6.5，搅拌后加入1.2mg纯化后的重组犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白，室温搅拌15min，加入1ml 10％bsa溶液，室温搅拌15min后12000rpm离心10min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(20mm tris，1％bsa，0.03％ proclin300，ph8.0)定容至1ml，此为标记好的重组犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白胶体金复合物。
82.1.3鼠igg标记
83.取胶体金溶液100ml放入烧杯中，搅拌加入0.2m k2co3调节金水ph至7.0，搅拌后加入1mg鼠igg(杭州隆基生物技术有限公司，货号：as00901)，室温搅拌15min，加入1ml 10％bsa溶液，室温搅拌15min后12000rpm离心10min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(20mm tris，1％bsa，0.03％proclin300，ph8.0)定容至1ml，此为标记好的鼠igg胶体金复合物。
84.将上述金标复合物用金标稀释液稀释100倍后与1.2步骤中稀释后的犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白胶体金复合物混合后浸泡玻璃纤维，37℃烘干4h后即制成金标垫。
85.1.4重组犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白的点膜
86.用点膜稀释液(50mm tris，2％蔗糖，ph8.5)稀释纯化后map2-p30-gp19融合蛋白至0.7mg/ml做为胶体金试纸条的检测线(test-line，t线)，用相同稀释液稀释羊抗鼠igg(杭州隆基生物技术有限公司，货号：ps00901)至0.3mg/ml做为胶体金试纸条的质控线(control-line，c线)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。
87.1.5双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体试纸条的组装
88.将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(nc膜)的聚酯板及滤纸、样本垫等安装底板上，组装成犬埃里希体抗体双抗原夹心法检测试纸条。具体安装方式如图2所示：分别将样本垫1、金标垫2、nc膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在nc膜3上，滤纸4叠加一部分压在nc膜3上。其中nc膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(t线)，质控区设置质控线32(c线)，检测线31靠近金标垫2，质控线32靠近滤纸4。
89.进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。
90.2双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体试纸条/卡的检测
91.加入90μl待检测样本(犬血清、血浆)至样本加样处(s)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图3所示)：
92.④
两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
93.⑤
仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
94.⑥
质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
95.3双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体试纸条/卡的检测结果
96.一共检测25份犬埃里希体感染阳性犬血清(样本编号1～25)，及49份正常未患病且未经免疫的犬血清(样本编号26～74)，其中t线和c线两条线的表示检测结果为阳性，只有c线一条线的表示检测结果为阴性。
97.检测结果如表1所示：25份阳性血清中检测出阳性20例，漏检0例，在49份阴性血清中出现假阳1例(68号样本)。
98.表1犬埃里希体抗体检测结果
99.100.[0101][0102]
由此可知，样本检测的灵敏度和特异性分别为100％和97.6％，整体符合率为98.6％，如图4所示。
[0103]
以上结果表明，利用本发明的重组犬埃里希体map2-p30-gp19融合蛋白检测犬埃里希体，具有非常高的的灵敏度和特异性，可以作为制作犬埃里希体抗体检测试纸条的原料，并可以在临床检测中广泛应用。
[0104]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
p30-gp19重组蛋白至0.7mg/ml做为胶体金试纸条的检测线，用相同稀释液稀释羊抗鼠igg至0.3mg/ml做为胶体金试纸条的质控线，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜，所述点膜稀释液包括50mm tris，2％蔗糖，ph8.5。

技术总结
本发明公开了一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒，属于动物病毒抗体检测领域。所述包括犬埃里希体MAP2-P30-gp19重组蛋白、鼠IgG和羊抗鼠IgG，所述MAP2-P30-gp19重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。利用本发明的试剂盒检测犬埃里希体抗体，方便快捷，灵敏度高，与其他病原体无交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。巨大的临床意义和和广泛的应用前景。巨大的临床意义和和广泛的应用前景。


技术研发人员：李晓光 何坚锋 王哲侃
受保护的技术使用者：杭州亿米诺生物科技有限公司
技术研发日：2020.12.14
技术公布日：2023/9/14