补体蛋白C1q及生长分化因子3在制备防治病毒性肺炎药物中的应用

补体蛋白c1q及生长分化因子3在制备防治病毒性肺炎药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及补体蛋白c1q及生长分化因子3(gdf3)制备在防治病毒性肺炎药物中的应用。


背景技术：

2.流感病毒是一种经飞沫传播的高传染性病原体，具有广泛传播和高致病率的特点。甲型流感病毒(iav)感染是肺炎相关死亡的最常见原因，由其引发的大流行是威胁全球的公共卫生紧急事件。iav感染导致肺泡上皮损伤并伴随炎性蛋白渗出物到气道和肺泡间隙，影响气体交换过程，临床上常表现为双侧肺部浸润和低血氧症，即发生急性呼吸窘迫综合征(ards)，这是流感所致高死亡率的主要病理基础(1-3)。
3.iav感染的第一个阶段是病毒在气道和肺泡上皮中的复制并触发先天免疫反应，构成宿主防御病毒的第一道防线。固有免疫系统的激活诱导早期细胞因子反应，促炎细胞因子和趋化因子的分泌大量将募集中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞至感染部位，进一步释放炎性介质、代谢产物，对于抑制病原体复制和病原体清除至关重要。其中巨噬细胞承担对病原体或凋亡细胞的识别和清除作用，桥接先天性和适应性免疫(6)。目前根据不同功能将巨噬细胞的极化表型分为两大类：炎症(m1)巨噬细胞和抗炎(m2)巨噬细胞。m1巨噬细胞在病毒清除方面发挥重要作用，活化的m1型巨噬细胞吞噬病原体并将抗原呈递给t细胞以唤起适应性免疫反应(7)。此外，m1巨噬细胞可释放高水平的促炎细胞因子，如tnf-α，白细胞介素-6(il-6)和il-1β等来响应感染(8)。但宿主炎症状态过于活跃将在一定程度上诱导组织损伤(9)。为了防止这种损伤，巨噬细胞将在il-4、il-10和il-13的刺激下活化为m2抗炎表型。这种表型具有抗炎细胞因子谱，il-10和转化生长因子(tgf)-β的表达较高，显示出炎症抑制并促进组织修复(8)。巨噬细胞m1/m2极化状态的精细调控可维持体内促炎/抗炎稳态，更好地抵御病原体入侵。
4.补体系统是先天免疫系统的重要组成部分，在病毒感染的早期被激活，在补体的参与下促进病毒感染细胞的降解和清除，同时启动炎症反应(10)，是机体抵御病毒的重要免疫机制。已有研究证实补体在各种生物过程中承担重要功能，参与免疫调节(11，13)、炎症(12)和新陈代谢相关的细胞内信号传导(14)等。作为经典补体途径的起始蛋白分子，c1q本身是一种模式识别受体(prr)，负责清除免疫复合物和入侵病原体。c1q能够直接识别微生物表面、凋亡细胞上的病原体相关分子模式(pamp)，继而与c1r和c1s结合从而启动经典补体途径。近几年对c1q的认识逐渐丰富，发现其在促进凋亡细胞吞噬、组织修复以及神经系统的调节中均起着重要作用(15)，但与流感病毒相关的研究甚少。目前仅有少数研究表明在无血清情况下攻击a549(肺上皮)细胞时，c1q可促进甲型流感病毒亚型(h1n1)的入侵和急性促炎细胞因子的分泌；但在h3n2亚型感染时，发现c1q可促进病毒入侵并促进抗炎细胞因子分泌(16)，但作用机制尚未明确。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供补体蛋白c1q及生长分化因子3(gdf3)在制备防治病毒性肺炎药物中的应用。
6.本发明研究了补体蛋白c1q功能缺陷对iav感染小鼠病理进程以及宿主免疫系统的影响，实验结果表明：与野生型(wt)小鼠相比，c1q缺陷小鼠(ko)肺组织病理损伤加重、促炎细胞因子分泌显著上调，且出现巨噬细胞极化平衡失调(巨噬细胞m1极化水平显著升高)，导致宿主呈现过度炎症，显著加重iav感染引起的急性肺损伤。此外进一步发现重组gdf3(rgdf3)蛋白可以有效减轻c1q缺陷小鼠感染h1n1所致的肺损伤，并有效调节巨噬细胞m1/m2极化平衡，维持宿主促炎/抗炎稳态。
7.据此，本发明提供补体蛋白c1q在病毒性肺炎防治中的应用，其机制与调控巨噬细胞m1/m2极化平衡相关。
8.本发明还提供gdf3作为c1q调控巨噬细胞的下游分子在病毒性肺炎防治中应用；
9.并且gdf3在流感患者中c1q功能缺陷者的防治具有应用价值。
10.具体地，本发明提供补体蛋白c1q及生长分化因子3(gdf3)在制备防治病毒性肺炎药物中的应用，尤其是在制备防治h1n1感染诱导的急性肺损伤药物中的应用。
11.gdf3在制备c1q功能缺陷患者流感防治中的药物制备中的应用。
附图说明
12.图1.c1q缺陷显著增加h1n1感染小鼠肺指数。感染后第4天和第6天，与wt-h1n1组小鼠相比，ko-h1n1组小鼠肺指数均显著升高。(*p《0.05,***p《0.001)。
13.图2.c1q缺陷加重h1n1感染小鼠肺组织损伤。与wt-h1n1组相比，ko-h1n1组小鼠肺组织出血严重、水肿面积略扩大。
14.图3.正常对照组小鼠肺组织h&e染色。wt-n和ko-n组别小鼠肺泡结构完整，无间质性血管扩张及炎性细胞浸润。
15.图4.c1q缺陷加重h1n1感染小鼠肺组织病理损伤。与wt-h1n1小鼠相比，ko-h1n1小鼠肺组织呈现严重病理损伤：肺泡结构严重受损；大量炎性细胞浸润，并伴有更多炎性蛋白渗出物。
16.图5.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织病毒复制水平。无论是在感染后第4天还是第6天，ko-h1n1组的m基因拷贝均显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05,***p《0.001)。
17.图6.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织促炎细胞因子tnf-α的转录水平。感染后第4天和第6天，ko-h1n1小鼠肺组织tnf-α转录水平均显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05,***p《0.001)。
18.图7.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织促炎细胞因子il-1β的转录水平。感染后第4天和第6天，ko-h1n1小鼠肺组织il-1β转录水平均显著高于wt-h1n1组。(**p《0.05,***p《0.001)。
19.图8.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织促炎细胞因子ifn-γ的表达水平。感染后第4天，ko-h1n1小鼠肺匀浆ifn-γ表达水平显著高于wt-h1n1组。(**p《0.01)。
20.图9.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织促炎细胞因子il-1β的表达水平。感染后第6天，ko-h1n1组小鼠肺匀浆il-1β表达水平显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05)。
21.图10.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺泡灌洗液促炎细胞因子ifn-γ的表达水平。感染后第6天，ko-h1n1组小鼠肺泡灌洗液ifn-γ表达水平显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05)。
22.图11.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺泡灌洗液促炎细胞因子il-1β的表达水平。感染后第6天，ko-h1n1组小鼠肺泡灌洗液il-1β表达水平显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05)。
23.图12.c1q缺陷降低h1n1感染小鼠肺泡灌洗液抗炎细胞因子il-10的表达水平。感染后第6天，ko-h1n1组小鼠肺泡灌洗液il-1β表达水平显著高于wt-h1n1组。(*p《0.05)。
24.图13.c1q缺陷增加h1n1感染小鼠肺组织巨噬细胞m1极化标志物inos转录水平。感染后第6天，与wt-h1n1组相比，ko-h1n1组肺组织inos转录水平显著升高。(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
25.图14.c1q缺陷降低h1n1感染小鼠肺组织巨噬细胞m2极化标志物arg-1转录水平。感染后第4天和第6天ko-h1n1组肺组织arg-1转录水平比wt-h1n1组显著下调。(*p《0.05,***p《0.001)。
26.图15.rgdf3治疗显著减轻ko-h1n1小鼠肺组织损伤。与ko-h1n1组相比，rgdf3给药组小鼠肺组织损伤得到有效缓解，出血情况显著减轻。
27.图16.rgdf3给药显著降低ko-h1n1小鼠肺指数。与ko-h1n1组相比，给药组在感染后第4天肺指数有一定降低趋势，在感染后第6天，肺指数显著降低。(*p《0.05)。
28.图17.rgdf3治疗显著减轻ko-h1n1小鼠肺组织病理损伤。rgdf3给药显著缓解ko-h1n1小鼠肺组织严重病理损伤。
29.图18.rgdf3治疗显著抑制ko-h1n1小鼠肺组织病毒复制。感染后第4天和第6天，rgdf3给药组的m基因拷贝均显著低于ko-h1n1组。(*p《0.05,**p《0.01)。
30.图19.rgdf3治疗降低ko-h1n1小鼠肺组织促炎细胞因子il-1β的转录水平。感染后第4天和第6天，rgdf3小鼠肺组织il-1β转录水平均显著低于ko-h1n1组。(**p《0.01，***p《0.001)。
31.图20.rgdf3治疗降低ko-h1n1小鼠肺组织促炎细胞因子ifn-γ的转录水平。感染后第4天和第6天，rgdf3小鼠肺组织ifn-γ转录水平均显著低于ko-h1n1组。(*p《0.05,**p《0.01)。
32.图21.rgdf3治疗一定程度上增加ko-h1n1小鼠肺组织抗炎细胞因子il-10的转录水平。感染后第4天和第6天，rgdf3组小鼠肺组织il-10表达水平在一定程度上高于ko-h1n1组。
33.图22.rgdf3治疗降低ko-h1n1小鼠肺组织巨噬细胞m1极化标志物inos转录水平。感染后第4天和第6天，rgdf3组小鼠肺组织inos表达水平显著低于ko-h1n1组。
34.(**p《0.01)。
35.图23.rgdf3治疗降低ko-h1n1小鼠肺组织巨噬细胞m1极化标志物cd86转录水平。感染后第6天，rgdf3给药组肺组织cd86转录水平显著低于ko-h1n1组。(*p《0.05)
36.图24.rgdf3治疗增加ko-h1n1小鼠肺组织巨噬细胞m2极化标志物cd206转录水平。感染后第4天和第6天，rgdf3给药组肺组织cd206转录水平均显著高于ko-h1n1组。
37.(**p《0.01)。
38.图25.c1q调控巨噬细胞极化的实验研究——实验流程。
39.图26.重组gdf3对h1n1感染c1qa-/-小鼠治疗作用。
具体实施方式
40.下面通过实施例结合附图进一步介绍本发明。
41.实施例1：h1n1感染引起c1q缺陷小鼠严重肺损伤
42.1.1实验材料
43.1.1.1实验动物
44.实验用鼠为4-6周龄，体重14-16g，c57 bl/6雌鼠，野生型(wt)小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号：20190002002672)，c1qa-/-(ko)小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司。小鼠饲养在复旦大学药学院bsl-2级抗病毒药物实验室感染专用动物房。小鼠经一天预饲养后随机分组，自由摄取无菌水和辐射灭菌饲料，垫料每隔两天更换一次。饲养温度保持在25
±
2℃，湿度维持在40-70％，按照复旦大学药学院实验动物伦理委员会要求(2020-09-sy-ljy-01)进行饲养。
45.1.1.2病毒
46.甲型流感病毒h1n1 a/fm/1/47(以下简称为h1n1)由上海市疾病预防控制中心提供，保存于复旦大学药学院抗病毒药物研究室-80℃冰箱。h1n1使用时用1640培养基稀释至2ld
50
(病毒初始浓度为10-1
，ld
50
＝10-4.3
)。
47.1.1.3实验试剂和仪器
48.化学试剂：pbs缓冲液(上海拜力生物科技有限公司)，异氟烷，多聚甲醛、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，trizol(takara)。
49.实验仪器：fa2204电子天平(上海力辰邦西仪器科技有限公司)，h5-21-kr落地式冷冻高速离心机(安信实验仪器有限公司)，tissuelyser-24多样品组织研磨机(上海净信设备有限公司)，af-100制冰机(scotsman)，ia7小动物麻醉机(铭网科技有限公司)，mj mini梯度pcr仪(bio-rad)，steponeplus实时荧光定量pcr仪(applied biosystems)，移液枪(eppendorf)。
50.实验器械：眼科镊，手术剪，烧杯，量筒，ep管，离心管。
51.1.2实验方法
52.1.2.1动物分组
53.wt和c1qa-/-(ko)c57 bl/6雌鼠(14-16g)各24只，经预饲养一天后按照体重随机分为6组，每组6只。具体分组方案(表1)及实验流程图(图25)。
54.表1，c1q调控巨噬细胞极化的实验研究——实验分组
55.[0056][0057]
1.2.2实验过程
[0058]
1.2.2.1h1n1感染
[0059]
小鼠经小动物麻醉机麻醉，双侧鼻孔各缓慢滴入15μl病毒液，共30μl/只，感染剂量分别2ld
50
。正常组小鼠用1640培养基进行滴鼻作为阴性对照。感染当天记为day 0，感染后每天同一时间观察小鼠状态及体重变化。
[0060]
1.2.2.2解剖流程
[0061]
每天观察记录小鼠进食、精神状态及体重变化。小鼠脱颈后用75％乙醇对小鼠胸腔及腹部消毒，取出肺组织并称重、拍照。小心夹取右肺上叶放入4％多聚甲醛固定，其余部分放入液氮存放，后续转移至-80℃冰箱保存。
[0062]
1.2.2.3肺组织rna提取及rt-qpcr实验
[0063]
(1)rna提取：每个肺组织样本称取25mg，加入500μl trizol和3颗研磨钢珠放入组织研磨机研磨；室温静置5min后离心并吸取上清至新的1.5ml ep管中；每管加入100μl三氯甲烷，涡旋震荡静置5min后离心；吸取上清液至新ep管并向每管加入500μl异丙醇，颠倒混匀静置10min后离心，弃去上清，加入500μl 75％乙醇并涡旋；离心后弃上清，室温静置，观察管内无液体残留后每管加入20-50μl depc水，溶解rna并保存于-80℃冰箱。
[0064]
(2)将rna逆转录为cdna：在0.1ml ep管中配制以下反应体系，将提取的rna逆转录为cdna:
[0065][0066]
设置反应程序为：
①
37℃,15min；
②
85℃,5sec；
③
4℃,10sec。
[0067]
(3)rt-qpcr：以β-actin为内参基因，检测influenza virus m gene、tnf-α、il-1β、inos、arg-1的转录水平(引物序列如下):
[0068]
[0069][0070]
pcr反应体系(20μl/孔)见下；pcr扩增程序设置：
①
95℃预变性5min；
②
95℃变性15s；
③
60℃退火延伸1min；共计40个循环。
[0071][0072]
1.2.2.4肺组织匀浆制备、肺泡灌洗液收集与酶联免疫吸附实验(elisa)
[0073]
(1)肺匀浆制备：取出保存于-80℃冰箱的肺组织，每个肺组织样本称取50mg并加入1ml预冷的无菌pbs和3颗研磨钢珠用组织研磨机研磨4次得到肺组织匀浆。研磨后的肺组织经离心后将上清收集至新的ep管并进行分装，保存于-80℃冰箱；
[0074]
(2)肺泡灌洗液收集：小鼠经眼球取血并脱颈处死后固定于泡沫板上，用眼科剪剪开和弯头镊将气管分离出；用手术剪将气管小心剪开小口，插入灌洗针后用缝合线打结固定；注射器吸取约1ml无菌pbs溶液，连接灌洗针后将pbs溶液缓缓推入肺中，重复灌洗3-4次；将收集到的肺泡灌洗液经离心后吸取上清并分装至新的离心管中，保存于-80℃冰箱；
[0075]
(3)elisa：按照试剂盒说明书要求对肺组织匀浆中il-1β、ifn-γ表达水平，肺泡灌洗液中il-1β、ifn-γ和il-10的分泌水平进行检测。以il-1β为例：
[0076]
①
预先取出板条，平衡至室温；同时根据各试剂盒说明书配制所需工作液；
[0077]
②
按照不同试剂盒的预实验结果将样品稀释至合适浓度；标准品按试剂盒说明书梯度稀释；空白孔加入样品稀释液100μl，分别将样品和不同浓度标准品加入相应孔中(100μl/孔)；
[0078]
③
系列稀释生物素化抗体工作液，每孔加入100μl，封膜覆盖后37℃孵育2h；
[0079]
④
甩去工作液后用洗液洗涤，30s/次
×
4次；
[0080]
⑤
按照说明书要求比例稀释酶结合工作液，混匀后每孔加入100μl，用封板纸覆盖后37℃孵育1h；
h1n1组小鼠肺泡灌洗液中促炎因子ifn-γ(p《0.05)和il-1β(p《0.01)的表达均显著升高。结果见图8-11。
[0100]
1.3.6c1q缺陷降低h1n1感染小鼠肺组织抗炎细胞因子il-10的表达
[0101]
elisa法测定肺组织和肺泡灌洗液中抗炎细胞因子il-10的表达水平，结果显示：在感染后第6天，wt与c1qa-ko鼠balf中il-10表达未见显著性差异(p》0.05)，但在感染后第4天，与wt-h1n1感染组相比，ko-h1n1组小鼠balf中抗炎因子il-10的表达出现显著降低(p《0.001)，结果见图12。
[0102]
1.3.7c1q缺陷引起h1n1感染小鼠肺组织巨噬细胞极化差异
[0103]
rt-qpcr法测定肺组织中巨噬细胞m1极化标志物inos和m2极化标志物arg-1的转录水平，结果显示：感染后第4天和第6天，wt-h1n1和ko-h1n1组别m1极化标志物inos的转录水平(图2-13)均比对应正常组显著增加(p《0.05)。在感染后第6天，与wt-h1n1组相比，ko-h1n1组肺组织inos转录水平显著升高(p《0.001)。各感染组的arg-1转录水平均比相应正常组显著升高(p《0.01)。同时，感染后第4天和第6天ko-h1n1组肺组织arg-1转录水平比wt-h1n1组显著下调(p《0.05)，结果见图13-14。
[0104]
实施例2：重组蛋白rgdf3对h1n1感染c1q缺陷小鼠急性肺损伤的治疗作用
[0105]
2.1实验材料
[0106]
重组小鼠gdf3蛋白(9009-gd-010)购自r&d systems，其余所用材料同实施例1中“1.1实验材料”部分。
[0107]
2.2实验方法
[0108]
2.2.1动物分组
[0109]
c1qa-/-(ko)c57 bl/6雌鼠(14-16g)共36只，经预饲养一天后按照体重随机分为normal(n)、day 4、day6，共3组，每组6只。重组gdf3对h1n1感染c1qa-/-小鼠治疗作用，实施流程见图26。
[0110]
2.2.2实验过程
[0111]
2.2.2.1h1n1感染
[0112]
同实施例1“1.2.2.1h1n1感染”内容。
[0113]
2.2.2.2解剖流程
[0114]
同实施例1“1.2.2.2解剖流程”内容。
[0115]
2.2.2.3rgdf3重组蛋白给药
[0116]
如图2所示，分别在感染前2h和感染后第3天对小鼠尾静脉注射(i.v.)rgdf3(20μg/kg)给药。
[0117]
2.2.2.4肺组织rna提取及rt-qpcr实验
[0118]
同实施例1“1.2.2.3肺组织rna提取及rt-qpcr实验”内容。
[0119]
2.2.2.5肺组织匀浆制备及酶联免疫吸附实验(elisa)
[0120]
同实施例1“1.2.2.4肺组织匀浆制备、肺泡灌洗液收集与酶联免疫吸附实验(elisa)”内容。
[0121]
2.2.2.6肺组织h&e染色
[0122]
同实施例1“1.2.5肺组织h&e染色与免疫荧光染色”内容。
[0123]
2.3.实验结果
gastrulation mouse embryo.development.2006；133(2):319-29.
[0156]
20.levine aj,brivanlou ah.gdf3,a bmp inhibitor,regulates cell fate in stem cells and early embryos.development.2006；133(2):209-16.
[0157]
21.wang l,li yt,wang xh,wang p,essandoh k,cui sn,et al.gdf3 protects mice against sepsis-induced cardiac dysfunction and mortality by suppression of macrophage pro-inflammatory phenotype.cells.2020；9(1):16。

技术特征：
1.补体蛋白c1q及生长分化因子3(gdf3)在制备防治病毒性肺炎药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，是在制备防治h1n1感染诱导的急性肺损伤药物中的应用。3.补体蛋白c1q的生长分化因子3(gdf3)在制备c1q功能缺陷患者流感防治中药物制备中的应用。

技术总结
本发明属生物医药技术领域，具体为补体蛋白C1q及生长分化因子3在制备防治病毒性肺炎药物中的应用。本发明发现C1q功能缺失加重呼吸道病毒感染所致的肺损伤，证实C1q通过调控巨噬细胞极化防御H1N1感染的新机制，并首次发现C1q通过GDF3介导对巨噬细胞极化表型的调控作用，回补GDF3可有效缓解H1N1感染引起的急性肺损伤；据此，提供补体蛋白C1q及生长分化因子3在制备防治病毒性肺炎药物中的应用，尤其是在制备防治H1N1感染诱导的急性肺损伤药物中的应用。本发明为病毒性肺炎防治提供了一种新途径。途径。途径。


技术研发人员：朱海燕 郝元真 李谦 史训龙 力弘
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/9/14