一种多级孔水凝胶骨支架及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物支架技术领域，具体涉及一种多级孔水凝胶骨支架及其制备方法与应用，尤其涉及一种血管化多级孔仿生定向骨支架及其制备方法与应用。


背景技术：

2.严重创伤、肿瘤等疾病所导致的骨缺损一直是骨科治疗的重点。虽然人体骨骼具有一定的自修复再生能力，但对于较大的缺损修复(直径》5mm)则难以依靠单纯的骨骼自愈合。目前临床主要采用自体、同种异体或异种移植方法进行缺损部位填补修复，但自体骨来源不足且术后并发症较多，而异体骨与宿主的结合能力较弱且有排异问题。因此，大面积骨损伤依然是临床治疗仍未完全解决的难题。随着骨组织工程技术的发展，人工植入支架可填充损伤部位并诱导骨组织再生，有望替代传统的人或动物源骨骼，避免来源困难以及免疫排斥问题。
3.专利cn109498846b与cn108478877a均基于定向冷冻策略，采用壳聚糖和胶原等作为生物源材料，分别将锌、锶和钙等离子或氧化石墨烯等功能材料掺杂支架主体，从而具备植入后功能离子缓释，促进骨细胞分化。但上述方法仅通过定向冷冻技术实现水凝胶支架的单向(一维)孔道成型，形成的骨组织结构多为单向(轴向)结构，孔道形成的骨组织之间结构稀疏，导致径向力学性能不佳。
4.专利cn109010926b以海藻酸钠为主要材料，通过冷冻干燥，氯化钙交联工艺构建三维多孔支架，可促进组织再生，多孔结构可高效促进干细胞附着扩增。专利cn115920133a提出多孔组合支架，将大孔(200～250μm)支架与介孔(2～50nm)支架复合，通过介孔吸附无细胞脂肪提取物(ceffe)并缓释进入大孔，诱导细胞依附大孔生长分化，实现骨组织再生。然而，上述策略仅让细胞无序生长，形成均质无序的骨组织，不具备天然骨组织的各向异性结构与性能，要加速骨组织再生，植入支架作为细胞提高驻留、代谢以及物质交换的场所，不仅要具备骨细胞募集诱导其附着的能力，还要为附着骨细胞提供充足营养，是骨细胞分化成骨，构建骨骼形态结构与生理功能的基础。参照天然骨仿生构建定向骨结构，实现组织血管化是保证细胞代谢营养与废物交换的关键前提。
5.专利cn110227178a提出将陶瓷浆料与三维打印的高分子多孔模板复合形成前驱体，以高分子模板构建三维多孔结构，再将前驱体进行定向冷冻，再依次进行冷冻干燥，并通过高温烧结去除高分子模板，从而得到三维结构生物陶瓷支架，其定向孔道与三维孔道连通形成的多孔结构利于细胞多向生长，可形成与骨组织相似的仿生结构，但制作过程需先三维打印高分子多孔模板，再复合构建多孔支架前驱体，工艺流程长、高分子多孔牺牲模板通过高温烧结方式难以完全去除，有机残留物带有生物毒性，生物活性难以保证。专利cn112137768a则提出一种分层仿生孔道复合支架，将无机生物陶瓷与有机生物高分子直接混合形成浆料，通过3d打印技术构建三维多孔结构并烧结熔融，与生物陶瓷融合形成结构稳定的多维复合材料，由于实际骨组织血管多为类似树杈的分叉网状结构，且孔道尺寸在100～300μm之间，而传统三维打印构建的多孔结构，其实际孔道难以精准控制，孔隙多为
500～1000μm范围。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术在制备骨缺损血管化修复支架时，很难满足使骨支架具有天然骨组织的各向异性结构与性能的同时，又可以使骨支架的多孔结构尺寸精准控制在骨组织血管尺寸之间的问题，从而提出了一种多级孔水凝胶骨支架及其制备方法与应用。本发明首先将特定种类的动物中的天然有机高分子化合物作为水凝胶主体，并加入交联剂与烷基胺类化合物进行处理，最后通过定向冷冻技术使处理后的溶液形成具有一定尺寸的定向微米孔道以及沿着该定向微米孔道侧壁形成的纳米孔道的多级孔水凝胶骨支架。本发明制备得到的多级孔水凝胶骨支架具备与天然纤维软骨组织相似的结构特征，且具备仿生结构力学，其中，形成的定向微米孔道的尺寸为10～250μm。
7.本发明第一方面提出了一种多级孔水凝胶骨支架，所述骨支架具有定向微米孔道以及沿着所述微米孔道的侧壁形成的纳米孔道，其中，所述微米孔道的直径为10～250μm。
8.优选地，所述纳米孔道的直径为30～400nm。
9.本发明第二方面提出了一种多级孔水凝胶骨支架的制备方法，该方法包括以下步骤：
10.(1)水凝胶预成型体制备：将水凝胶主体材料、水、交联剂、烷基胺类化合物与可选的配合高分子材料进行混合；
11.(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物进行定向冷冻处理，
12.其中，所述水凝胶主体材料选自丝素蛋白、胶原蛋白和明胶中的一种或两种以上，所述配合高分子材料为天然有机高分子化合物和/或合成有机高分子化合物。
13.优选地，所述烷基胺类化合物选自四甲基乙二胺、二亚乙基三胺和三亚乙基四胺中的一种或两种以上。
14.优选地，所述天然有机高分子化合物选自海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖和纤维素中的一种或两种以上。
15.优选地，所述合成有机高分子化合物选自聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上。
16.优选地，在步骤(1)中，先将所述水凝胶主体材料、水与可选的配合高分子材料进行第一次混合，得到混合溶液，再向所述混合溶液中加入所述交联剂与烷基胺类化合物进行第二次混合。更优选地，所述第一次混合的条件包括：温度为40～80℃，搅拌速度为100～300rpm，时间为30～90min。进一步优选地，所述第二次混合的条件包括：温度为40～60℃，搅拌速度为150～400rpm，时间为60～120min。
17.优选地，在步骤(2)中，所述定向冷冻处理的条件包括：温度为-80～-60℃，时间为5～30min。
18.优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与水的用量的质量比为1：5～20。
19.优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.1～1：100。
20.优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与所述交联
剂的用量比为1g：1～20mmol。
21.优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述混合溶液的质量分数为5～20重量％。
22.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述配合高分子材料与所述水凝胶主体材料的用量的质量比为1～3：10。
23.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料和配合高分子材料的总含量与水的用量的质量比为1：10～20。
24.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.1～1：100。
25.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料和配合高分子材料的总含量与所述交联剂的用量比为1g：1～20mmol。
26.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述混合溶液的质量分数为5～10重量％。
27.优选地，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油基醚和/或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺；更优选地，所述n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：2～5。
28.优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述水凝胶主体材料的用量的质量比为1～5：100。
29.优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述水凝胶主体材料和配合高分子材料的总含量的用量的质量比为1～5：100。
30.本发明第三方面提出了一种上述所述方法制备得到的多级孔水凝胶骨支架。
31.本发明第四方面提出了一种上述所述多级孔水凝胶骨支架在骨缺损血管化修复中的应用。
32.本发明所述多级孔水凝胶骨支架及其制备方法，至少具有以下有益效果：
33.(1)在本发明中，水凝胶中的水分子在定向冷冻过程中形成导向结晶结构，促使水凝胶中的高分子围绕水分子冰晶形成单向且均匀分布的微米孔道，利于细胞向孔道聚集生长，为血管预成型提供条件，同时，水凝胶分子链间的烷基胺类化合物在完成催化高分子交联反应后，随着高分子与水分子的分相过程，该烷基胺类化合物分子从高分子侧壁中析出并形成纳米孔道，该纳米孔道可以进一步诱导细胞黏附并沿着纳米孔道形成毛细血管，将孔道之间形成仿生网状结构，形成具有与天然骨组织中血管相仿的三维取向孔道支架；
34.(2)在本发明中，选用特定种类的水凝胶主体高分子材料，使该高分子材料在定向冷冻作用下围绕水分子冰晶形成孔径尺寸为10～250μm的微米孔道，该孔道尺寸有利于细胞诱导附着并血管化，为骨细胞分化成骨提供充足的营养环境；
35.(3)在本发明中，在优选情况下，通过调控水凝胶中高分子浓度、交联剂含量以及烷基胺类化合物的含量等关键参数，可以实现侧壁形成的纳米孔道的尺寸在30～400nm之间可控可调；
36.(4)本发明所述方法基于水凝胶分子交联与定向冷冻技术原理，通过简单、高效的
操作方法可以制备出具有一定孔径尺寸的定向微米孔道以及沿着该定向微米孔道侧壁形成的纳米孔道的多孔仿生骨支架，同时该仿生骨支架的定向及侧向抗压强度均较优良。
附图说明
37.图1是本发明实施例1制备得到的多级孔水凝胶骨支架中多孔孔道的扫描电镜图；
38.图2是本发明对比例1制备得到的骨支架中孔道的扫描电镜图。
具体实施方式
39.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
40.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
41.本发明第一方面提出了一种多级孔水凝胶骨支架，所述骨支架具有定向微米孔道以及沿着所述微米孔道的侧壁形成的纳米孔道，其中，所述微米孔道的直径为10～250μm，具体地，例如可以为10μm、20μm、40μm、50μm、80μm、110μm、120μm、150μm、180μm、200μm、230μm或250μm。
42.在本发明所述骨支架中，所述纳米孔道的直径可以为30～400nm，具体地，例如可以为30nm、40nm、80nm、100nm、120nm、150nm、200nm、260nm、300nm、340nm、380nm或400nm。
43.本发明第二方面提出了一种多级孔水凝胶骨支架的制备方法，该方法包括以下步骤：
44.(1)水凝胶预成型体制备：将水凝胶主体材料、水、交联剂、烷基胺类化合物与可选的配合高分子材料进行混合；
45.(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物进行定向冷冻处理，
46.其中，所述水凝胶主体材料选自丝素蛋白、胶原蛋白和明胶中的一种或两种以上，所述配合高分子材料为天然有机高分子化合物和/或合成有机高分子化合物。
47.步骤(1)中制得的水凝胶预成型体在定向冷冻作用下，其中的高分子(水凝胶主体材料与可选的配合高分子材料)与水分子发生相分离，水分子在定向冷冻过程中形成导向结晶结构，促使高分子围绕水分子冰晶形成冷冻方向的微孔通道，孔径在10-250μm之间，同时，水凝胶预成型体中的烷基胺类化合物发挥催化功能，促进水凝胶中的高分子分子链发生交联反应，随着高分子与水分子的分相过程，烷基胺类化合物从高分子侧壁中析出并形成纳米孔道，孔径在30-400nm之间，从而形成多级孔道支架结构。
48.在本发明所述方法中，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油基醚(bdde)和/或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基磺基琥珀酰亚胺(nhs)，在本文中，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺以下简称edc/nhs，具体地，所述edc/nhs可以通过本领域常规技术手段制备得到，即将edc与nhs依次加入缓冲溶液中，其中，nhs与edc的质量比为1：2～5。
49.在本发明所述方法中，在优选情况中，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油基醚
(bdde)。
50.在本发明所述方法中，所述烷基胺类化合物选自四甲基乙二胺、二亚乙基三胺和三亚乙基四胺中的一种或两种以上。在优选情况中，所述烷基胺类化合物为四甲基乙二胺。
51.在本发明所述方法中，天然有机高分子化合物选自海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖和纤维素中的一种或两种以上。。
52.在本发明所述方法中，所述合成有机高分子化合物选自聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上。
53.在本发明所述方法中，在步骤(1)中，先将所述水凝胶主体材料、水与可选的配合高分子材料进行第一次混合，得到均一的混合溶液，再向所述混合溶液中加入所述交联剂与烷基胺类化合物进行第二次混合。
54.在本发明所述方法中，所述第一次混合和第二次混合均在搅拌条件下进行。所述第一次混合的条件包括：温度为40～80℃，搅拌速度为100～300rpm，时间为30～90min。所述第二次混合的条件包括：温度为40～60℃，搅拌速度为150～400rpm，时间为60～120min。
55.在本发明所述方法中，所述水凝胶主体材料可以直接用于构建多维孔道支架，也可以与配合高分子材料形成多相复合水凝胶构建多维孔道支架。在具体操作过程中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，直接将所述水凝胶主体材料与水进行第一次混合，得到均一的混合溶液，然后在搅拌条件下，向所述混合溶液中缓慢滴入交联剂与烷基胺类化合物进行第二次混合。
56.在本发明所述方法中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与水的用量的质量比可以为1：5～20，具体地，例如可以为1：5、1：10、1：15或1：20。
57.在本发明所述方法中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，为了使微孔侧壁形成的纳米孔道尺寸在30～400nm之间可控可调，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比可以为0.1～1：100，具体地，例如可以为0.1：100、0.2：100、0.5：100、0.8：100或1：100。在优选情况下，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.2～0.5：100。
58.在本发明所述方法中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，为了使水凝胶支架定向冷冻构建微米孔道尺寸在10～250μm之间可控可调，所述混合溶液的质量分数应控制为5～20重量％，具体地，例如可以为5重量％、10重量％、15重量％或20重量％。
59.在本发明所述方法中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与所述交联剂的用量比可以为1g：1～20mmol，具体地，例如可以为1g：1mmol、1g：5mmol、1g：10mmol、1g：15mmol或1g：20mmol。
60.在本发明所述方法中，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，且当所述交联剂使用edc/nhs时，所述edc/nhs与所述水凝胶主体材料的用量的质量比可以为1～5：100，具体地，例如可以为1：100、2：100、3：100、4：100或5：100。
61.在本发明所述方法中，在具体操作过程中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，先将所述水凝胶主体材料与配合高分子材料混合形成复合高分子材料，然后将所述复合高分子材料与水进行第一次混合，得到均一的混合溶液，然后在搅拌条件下，向所述混合溶液中缓慢滴入交联剂与烷基胺类化合物进行第二次混合。
62.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述配合高分子材料
与所述水凝胶主体材料的用量的质量比可以为1～3：10，具体地，例如可以为1：10、2：10或3：10。
63.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)的总含量与水的用量的质量比可以为1：10～20，具体地，例如可以为1：10、1：15或1：20。
64.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，为了使微孔侧壁形成的纳米孔道尺寸在30～400nm之间可控可调，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比可以为0.1～1：100，具体地，例如可以为0.1：100、0.2：100、0.5：100、0.8：100或1：100。在优选情况下，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.8～1：100。
65.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，为了使水凝胶支架定向冷冻构建微米孔道尺寸在10～250μm之间可控可调，所述混合溶液的质量分数应控制为5～10重量％，例如可以为5重量％或10重量％。
66.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)与所述交联剂的用量比可以为1g：1～20mmol，具体地，例如可以为1g：1mmol、1g：5mmol、1g：10mmol、1g：15mmol或1g：20mmol。
67.在本发明所述方法中，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，且当所述交联剂使用edc/nhs时，所述edc/nhs与所述复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)的用量的质量比可以为1～5：100，具体地，例如可以为1：100、2：100、3：100、4：100或5：100。
68.在本发明所述方法中，在步骤(2)中，通过单向的冷源，实现水凝胶溶液由底部向上的定向逐步冷冻，直到整个水凝胶完全冻结，由于铜的导热系数是塑料的1600倍，水凝胶(sf)溶液的冻结发生在自下而上的方向。在具体实施方式中，将步骤(1)得到的混合产物注入底部为铜的模具中，然后使模具的下半部分浸入液氮浴中，使铜的温度降低至-70℃以下，进行定向冷冻处理，直至模具中水凝胶完全冷冻，定向冷冻处理结束。所述定向冷冻处理的条件包括：温度为-80～-60℃，时间为5～30min。在优选情况中，所述定向冷冻处理的条件包括：温度为-80～-70℃，时间为10～25min。
69.在本发明所述方法中，在步骤(2)中，该方法还包括将定向冷冻处理后的产物依次进行解冻浸泡和冷冻干燥。
70.在本发明所述方法中，所述解冻浸泡可以为本领域的常规操作，其具体实施过程为：将定向冷冻处理后的产物放入-20℃的冰箱中进行冷冻反应24～72h，然后再室温下解冻12h，再浸入去离子水中浸泡一周，浸泡期间每24～48h换水一次，以去除可溶性杂质。
71.在本发明所述方法中，所述冷冻干燥可以为本领域的常规操作，其具体实施过程为：将解冻浸泡后的水凝胶支架样品取出并重新放入-20℃的冰箱中进行冷冻24h，然后进行冷冻干燥至恒重。
72.本发明第三方面提出了一种上述所述方法制备得到的多级孔水凝胶骨支架。
73.本发明第四方面提出了一种上述所述多级孔水凝胶骨支架在骨缺损血管化修复中的应用。
74.下面通过实施例来进一步说明本发明所述的多级孔水凝胶骨支架及其制备方法。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
75.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可商购得到。
76.实施例1
77.(1)水凝胶预成型体制备：首先将丝素蛋白粉末与去离子水以1：20的质量比进行第一次混合，并且在50℃，100rpm下混合30min以形成质量分数为5重量％的均一混合溶液，然后在50℃，150rpm下向该均一混合溶液中缓慢滴入丁二醇二缩水甘油基醚(bdde)与四甲基乙二胺(temed)进行第二次混合，其中，bdde与丝素蛋白的用量比为10mmol：1g，temed与均一混合溶液的体积比为0.5：100；
78.(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物浇注到内边长为10mm的方形模具中，模具底部为铜底板，其下半部分浸入液氮浴中，使铜板温度降至-70℃，待完全冻结后，将反应物放入-20℃的冰箱中进行冷冻反应24h，然后再室温下解冻12h，再浸入去离子水中浸泡一周，浸泡期间每24h换水一次，以去除可溶性杂质，将浸泡的水凝胶支架样品，取出并重新放入-20℃的冰箱中进行冷冻24h，然后进行冷冻干燥至恒重，得到多孔仿生骨支架。
79.实施例2
80.按照实施例1的方式实施，所不同的是，丝素蛋白粉末与去离子水以1：10的质量比进行混合，得到多孔仿生骨支架。
81.实施例3
82.(1)水凝胶预成型体制备：首先将丝素蛋白粉末与明胶颗粒按照质量比为10：1进行混合，然后将混合得到的产物与去离子水以1：20的质量比进行混合，并且在70℃，100rpm下混合60min以形成质量分数为5重量％的均一混合溶液，最后在60℃，200rpm下向该均一混合溶液中缓慢滴入丁二醇二缩水甘油基醚(bdde)与四甲基乙二胺(temed)进行混合，其中，bdde与复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)的用量比为10mmol：1g，temed与均一混合溶液的体积比为1：100；
83.(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物浇注到内边长为10mm的方形模具中，模具底部为铜底板，其下半部分浸入液氮浴中，使铜板温度降至-70℃，待完全冻结后，将反应物放入-20℃的冰箱中进行冷冻反应24h，然后再室温下解冻12h，再浸入去离子水中浸泡一周，浸泡期间每48h换水一次，以去除可溶性杂质，将浸泡的水凝胶支架样品，取出并重新放入-20℃的冰箱中进行冷冻24h，然后进行冷冻干燥至恒重，得到多孔仿生骨支架。
84.实施例4
85.(1)水凝胶预成型体制备：首先将丝素蛋白粉末与胶原蛋白粉末按照质量比为10：2进行混合，然后将混合得到的产物与去离子水以1：20的质量比进行混合，并且在60℃，100rpm下混合60min以形成质量分数为5重量％的均一混合溶液，最后在50℃，250rpm下向该均一混合溶液中缓慢滴入edc/nhs(nhs与edc的质量比为1：2)与四甲基乙二胺(temed)进行混合，其中，edc/nhs与复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)的用量比为20mmol：1g，temed与均一混合溶液的体积比为1：100；
86.(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物浇注到内边长为10mm的方形模具中，模具底部为铜底板，其下半部分浸入液氮浴中，使铜板温度降至-70℃，待完全冻结
后，将反应物放入-20℃的冰箱中进行冷冻反应24h，然后再室温下解冻12h，再浸入去离子水中浸泡一周，浸泡期间每24h换水一次，以去除可溶性杂质，将浸泡的水凝胶支架样品，取出并重新放入-20℃的冰箱中进行冷冻24h，然后进行冷冻干燥至恒重，得到多孔仿生骨支架。
87.实施例5
88.(1)水凝胶预成型体制备：首先将胶原蛋白粉末与透明质酸按照质量比为10：5进行混合得到复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)，然后将所述复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)与去离子水以1：10的质量比进行混合，并且在60℃，100rpm下混合60min以形成质量分数为10重量％的均一混合溶液，最后在60℃，300rpm下向该均一混合溶液中缓慢滴入edc/nhs(nhs与edc的质量比为1：3)与二亚乙基三胺进行混合，其中，edc/nhs与复合高分子材料(水凝胶主体材料和配合高分子材料)的用量比为20mmol：1g，二亚乙基三胺与均一混合溶液的体积比为1：100；
89.(2)根据实施例的方式实施，得到多孔仿生骨支架。
90.对比例1
91.按照实施例1的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，不加入四甲基乙二胺(temed)，得到骨支架。
92.对比例2
93.按照实施例3的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将四甲基乙二胺(temed)替换为戊二醛，得到骨支架。
94.对比例3
95.按照实施例1的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将四甲基乙二胺(temed)替换为乙醇胺，得到骨支架。
96.对比例4
97.按照实施例1的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将丝素蛋白粉末替换为透明质酸，得到骨支架。
98.对比例5
99.按照实施例1的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将丝素蛋白粉末替换为壳聚糖，得到骨支架。
100.对比例6
101.按照实施例5的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将胶原蛋白粉末替换为海藻酸钠，得到骨支架。
102.对比例7
103.按照实施例5的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将胶原蛋白粉末替换为聚乙烯醇，得到骨支架。
104.对比例8
105.按照实施例1的方式实施，所不同的是，在步骤(1)中，将丁二醇二缩水甘油基醚(bdde)替换为氯化钙，得到骨支架。
106.测试例
107.实施例1与对比例1制备得到的骨支架的扫描电镜图：用锋利刀片垂直定向冷冻方
向，对冻干支架切取整齐断面a，与此同时，用刀片平行定向冷冻方向，对冻干支架窃取整齐断面b，将断面a与b分别放置于粘有导电胶的载物台上，并进行喷金，在5kv的加速电压下观察支架的结构。通过分析断面a观察定向冷冻形成微米级孔道形貌尺寸，通过分析断面b观察定向冷冻孔道侧壁的纳米微孔形貌；
108.实施例1～5和对比例1～8制备得到的骨支架的定向抗压强度：将冻干支架材料裁剪为规则大小的立方体，使用万能试验机，平行支架的定向冷冻孔道方向进行压缩测试，压缩速度为3mm/min，压缩至样品破裂或应变范围至70％；
109.实施例1～5和对比例1～8制备得到的骨支架的侧向抗压强度：同上，使用万能试验机，垂直支架的定向冷冻孔道方向进行压缩测试。
110.实施例1～5和对比例1～8制备得到的骨支架的定向抗压强度与侧向抗压强度的结果如表1所示。
111.表1
[0112][0113][0114]
根据实施例1与对比例1制备得到的骨支架的扫描电镜图可以看出采用本发明所述方法制备得到的仿生骨支架具有定向微米孔道以及沿着所述微米孔道的侧壁形成的纳米孔道，同时从表1的数据可以看出，本发明所述方法制备得到的仿生骨支架的侧壁纳米孔道直径为10～250μm，且侧壁形成的纳米孔道孔径在30～400nm之间可控可调，该孔道尺寸有利于细胞诱导附着并血管化，为骨细胞分化成骨提供充足的营养环境，并且该仿生骨支架同时具有优异的定向和侧向抗压强度。
[0115]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技
术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种多级孔水凝胶骨支架，其特征在于，所述骨支架具有定向微米孔道以及沿着所述微米孔道的侧壁形成的纳米孔道，其中，所述微米孔道的直径为10～250μm。2.根据权利要求1所述的骨支架，其特征在于，所述纳米孔道的直径为30～400nm。3.一种多级孔水凝胶骨支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)水凝胶预成型体制备：将水凝胶主体材料、水、交联剂、烷基胺类化合物与可选的配合高分子材料进行混合；(2)多级孔道支架构建：将步骤(1)得到的混合产物进行定向冷冻处理，其中，所述水凝胶主体材料选自丝素蛋白、胶原蛋白和明胶中的一种或两种以上，所述配合高分子材料为天然有机高分子化合物和/或合成有机高分子化合物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述烷基胺类化合物选自四甲基乙二胺、二亚乙基三胺和三亚乙基四胺中的一种或两种以上；优选地，所述天然有机高分子化合物选自海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖和纤维素中的一种或两种以上；优选地，所述合成有机高分子化合物选自聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，先将所述水凝胶主体材料、水与可选的配合高分子材料进行第一次混合，得到混合溶液，再向所述混合溶液中加入所述交联剂与烷基胺类化合物进行第二次混合；优选地，所述第一次混合的条件包括：温度为40～80℃，搅拌速度为100～300rpm，时间为30～90min；优选地，所述第二次混合的条件包括：温度为40～60℃，搅拌速度为150～400rpm，时间为60～120min；优选地，在步骤(2)中，所述定向冷冻处理的条件包括：温度为-80～-60℃，时间为5～30min。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与水的用量的质量比为1：5～20；优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.1～1：100；优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料与所述交联剂的用量比为1g：1～20mmol；优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述混合溶液的质量分数为5～20重量％。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述配合高分子材料与所述水凝胶主体材料的用量的质量比为1～3：10；优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料和配合高分子材料的总含量与水的用量的质量比为1：10～20；优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述烷基胺类化合物与所述混合溶液的用量的体积比为0.1～1：100；优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述水凝胶主体材料和配合高分子材料
的总含量与所述交联剂的用量比为1g：1～20mmol；优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述混合溶液的质量分数为5～10重量％。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油基醚和/或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺；优选地，所述n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：2～5；优选地，当步骤(1)中不加入配合高分子材料时，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述水凝胶主体材料的用量的质量比为1～5：100；优选地，当步骤(1)中加入配合高分子材料时，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基磺基琥珀酰亚胺与所述水凝胶主体材料和配合高分子材料的总含量的用量的质量比为1～5：100。9.一种根据权利要求3～8中任意一项所述方法制备得到的多级孔水凝胶骨支架。10.一种权利要求1或权利要求9中任意一项所述多级孔水凝胶骨支架在骨缺损血管化修复中的应用。

技术总结
本发明属于生物支架技术领域，具体涉及一种多孔仿生骨支架的制备方法及其仿生骨支架。一种多孔仿生骨支架的制备方法包括以下步骤：将水凝胶主体材料、水、交联剂、烷基胺类化合物与可选的配合高分子材料进行混合；将得到的混合产物进行定向冷冻处理，其中，所述水凝胶主体材料选自丝素蛋白、胶原蛋白和明胶中的一种或两种以上，所述配合高分子材料选自透明质酸和壳聚糖等生物源天然高分子以及合成有机高分子化合物中的一种或两种以上。通过本发明所述方法可以制备出具有一定孔径尺寸的定向微米孔道以及沿着该定向微米孔道侧壁形成的纳米孔道的多孔仿生骨支架。米孔道的多孔仿生骨支架。米孔道的多孔仿生骨支架。


技术研发人员：朱晨凯 王勇 邵振宗 张武翔 黄长用 卢立斌 丁希仑
受保护的技术使用者：北京航空航天大学宁波创新研究院
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/19