用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘

1.本实用新型属于化学分析检测技术领域，特别涉及一种用于流式细胞仪和液相色谱仪在线检测多细胞到单细胞代谢物的进样盘。
技术背景
2.细胞是构成生物体的基本单位，细胞代谢在生命活动中处于重要地位，并对其结构和功能产生重要影响。单个细胞的生物学研究是了解生命过程的重要手段。由于不同细胞个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，必须从单细胞水平上对细胞中物质组成和含量进行分析研究。单细胞分析可以鉴定细胞内生化组分及性质，同时可研究代谢与细胞功能和细胞发育分化的联系，具有十分重大的生物学意义，因此近年来单细胞分析方法受到越来越多的关注。
3.首先，单细胞的尺寸体积非常小，通常动物细胞的直径为10～20μm，植物细胞的直径为10～100μm，它们的内液体积一般在fl-pl量级，取样和预处理在这样的尺寸上极为不便；其次，单细胞中的物质含量较低，对检测方法的灵敏度提出了较高的要求。针对这些实际问题，现有一些单细胞筛分捕获技术，如利用毛细或纳米喷头等辅助工具捕获细胞；激光捕获显微切割法等，但是这些方法对仪器设备性能要求较高，操作复杂，通量低，无法进行大量单细胞或多个细胞样本的快速检测。
4.流式细胞仪可以对悬浮的微粒或者动植物细胞进行自动分析，以细胞免疫光化学技术为基础，结合光电技术，计算机技术，可以快速测量分析悬浮在液体中的分散细胞，能精确分选单个细胞及多个细胞，具有通量高，准确率高的特点。所以流式细胞仪在单细胞分析研究中发挥巨大的作用。
5.目前流式细胞仪主要应用于免疫学，肿瘤学，细胞抗原物质分析等方面，而由于其检测受限于样本体积等因素，无法进行实时非侵入性的动态监测，同时因为细胞体积小，代谢物含量低，现有的适配流式细胞仪的细胞容器无法进行代谢物检测的前处理工作，所以在细胞代谢物检测方面的应用还存在阻碍。
6.现有应用于流式细胞仪的收集器是由试管和烧瓶组成，分别接收向不同方向分离的细胞液滴，当细胞液滴数量足够多时，才能继续进行样本的处理，比如细胞破碎，提取，培养等。受限于收集器的体积与外形，必须进行样品转移，例如在进行质谱分析细胞代谢物时，需要使用移液枪转移细胞悬液至离心管或者玻璃容器中进行代谢物的提取等样品处理，在这个过程中存在样品损失等问题。对于大量细胞悬液，少量损失对实验结果影响不大，但是对于少量细胞甚至是单细胞，样品损失会造成实验结果的巨大偏差。


技术实现要素：

7.本实用新型所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种可以用于流式细胞仪和液相色谱仪在线检测多细胞到单细胞代谢物的进样盘。使用本发明所述进样盘在整个细胞分选、前处理以及后续代谢物的分析过程中不用进行细胞样本的转移，有效
防止微量样本的损失。
8.本实用新型为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
9.一种用于流式细胞仪和液相色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，包括底板和分布于底板上表面的多个进样孔；每个进样孔包括开设于底板内部的倒锥形凹槽，倒锥形凹槽的顶端向外延伸有环形的凸沿，凸沿内侧形成的圆柱形槽或倒圆台形槽与倒锥形凹槽连通。
10.按上述方案，所述圆柱形槽或倒圆台形槽的底端与倒锥形凹槽顶端连接。
11.按上述方案，所述进样盘上多个进样孔均匀分布有多行和多列，可根据实际需求可以设计为54孔，96孔，184孔等。
12.按上述方案，所述凸沿与底板为一体成型。
13.按上述方案，所述圆柱形槽或倒圆台形槽的上下横截面均不小于倒锥形凹槽的顶端截面。
14.按上述方案，所述倒锥形凹槽的内壁与中心垂直线的角度在40～60
°
，凸沿的内壁与内侧水平面的角度在90～120
°
之间。
15.按上述方案，所述凸沿的高度在0.5～1.5mm范围内，厚度在0.25～0.6mm范围内，横截面直径在7～10mm范围内。
16.按上述方案，所述倒锥形凹槽的深度在3～5mm之间，体积在20～50μl范围内，顶端横截面直径在6～9mm范围内。
17.按上述方案，所述进样盘的底板的尺寸和外形同时适配于流式细胞仪和液相色谱仪的进样器。一般情况下，底板的横截面为长方形，长宽根据实际情况设计，高度(即厚度)可以根据液相色谱仪进样针的高度进行调整，其范围一般在10～30mm之间。
18.按上述方案，所述底板的侧壁向外凸伸有与液相色谱仪进样器适配的用于限位的定位板，其相对于底板向外凸伸的宽度一般为1.5～3mm，高度一般为2～3.5mm，用于保持进样盘在液相色谱仪进样过程中的稳定状态。
19.按上述方案，所述进样盘或进样孔的顶部可以覆盖密封薄膜或密封纸。具体地，细胞样本前处理好，进样盘或进样孔的顶部进行覆盖密封膜后，然后放置于液相色谱仪的样品盘处等待进样。其中，所述进样盘顶部覆盖一层粘性锡箔纸，保持密封；或者，每个进样孔均覆盖一层粘性锡箔纸，保持密封。
20.按上述方案，所述进样盘的材质为可以耐氯仿、甲醇、乙腈等有机溶剂腐蚀的材质，如聚醚醚酮等，避免杂质的干扰。
21.按上述方案，液相色谱仪还可以串联质谱使用，即可以使用质谱仪进行进样盘中细胞代谢物分析。其中，所述质谱可以采用三重四级杆质谱或者飞行时间质谱等。
22.本实用新型的使用方法：首先将本发明所述进样盘安设于流式细胞仪中进行分选细胞，将其喷口对准进样孔处，将细胞样本按一定入射角准确落入至进样盘多个进样孔中，按照需求可调整细胞个数；分选细胞完成后，在该样品盘中进行细胞样本前处理，包括细胞的破碎、溶解、衍生等；之后，将前处理好的细胞样本覆盖密封膜(如覆盖一层粘性锡箔纸密封)后放置于液相色谱仪的样品器中等待进样，检测系统进行色谱分离信号的分析，或者进行液质联用分析。如图5所示。
23.与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：
24.本发明所述样品盘的尺寸、外形、材质可同时应用于流式细胞仪和液相色谱仪，并且适用流式细胞仪分选细胞以及液相色谱微体积进样，而小体积进样孔则适用于细胞等小体积物质的代谢物分析，密封设计防止溶剂挥发。故使用本发明所述进样盘在整个细胞分选、前处理以及后续代谢物的分析过程中不用进行细胞样本的转移，有效防止微量样本的损失，并且，操作简单，通量高，可以做到快速在线检测。
附图说明
25.图1是本实用新型的纵向剖视图，其中1为底板，2为凸沿，3为倒锥形凹槽，4为底板侧壁向外凸伸有与液相色谱进样器卡槽适配的用于限位的定位板，h1为12mm，h2为2.5mm。
26.图2是本实用新型的俯视图，其长宽分别为127mm和85mm。
27.图3是本实用新型的倒锥形凹槽的纵向剖视图，即图1中的a部分的局部放大图，其中h1为4.7mm，h2为1mm，为8mm，为7mm，α为80
°
。
28.图4是本实用新型的倒锥形凹槽的俯视图，即图2中的b部分的局部放大图，其中d为1mm，为8mm，为7mm。
29.图5是利用此实用新型进行细胞样本流式细胞仪分选和微量体积衍生并且经过lc-ms检测分析的流程图；
30.图6是107种混合标准品(5nm)在本发明所述进样盘中衍生后经过lc-ms分析的mrm总离子流图。
具体实施方式
31.为了更好地理解本实用新型，下面结合实施例进一步阐明本实用新型的内容但本实用新型不仅仅局限于下面的实施例。
32.1.下述应用例中，衍生化标准品制备方法及仪器参数如下：
33.1)用甲醇配置100nmol/l的氧脂素标准品，用乙腈配置反应溶剂haut(20μmol/ml)，depa(20μmol/ml)，hobt(20μmol/ml)以及tea(20μmol/ml)；
34.2)将制备好的衍生化标准品进行液相色谱-质谱分析，仪器分析参数如下所示：
35.液相仪器是岛津高效液相色谱仪lc-30ad(shimadzu corporation,kyoto,japan)，液相条件是：色谱柱采用zorbax eclipse plus c18 column(4.6
×
100mm,1.8μm,安捷伦)。流动相a为水(0.2％甲酸)，流动相b为乙腈(0.2％甲酸)。梯度系统为：0-2min，维持25％流动相b；2-4min，将流动相b从25％提高到35％；4-20min，将流动相b从35％提高到60％；20-22min，将流动相b从60％提高到99％；22-26min，将流动相b稳定在99％；26-28min，将流动相b从99％降低到60％。28-30min，将流动相b从60％降低到25％。30-35min，将流动相b稳定在25％。柱温45℃，进样盘温度4℃，流速为0.5ml/min。进样体积为5μl。
36.表1液相色谱系统参数
[0037][0038]
质谱仪ab sciex 6500+lc/ms/ms system，采用mrm扫描模式在正离子下扫描，离子源温度均为550℃，离子源电压分别为：+5500v；去簇电压(declustering potential，dp)为：+75v；碰撞能(collision energy，ce)分别为：+35v，气帘气压力均为：35psi；离子源气体1(ion source gas 1，gs 1)：40psi；离子源气体2：45psi；质量范围：50-550m/z。
[0039]
2.下述应用例中，细胞样本前处理过程如下：
[0040]
将带有培养基的细胞转移至离心管中，设置离心机转速1500～2000rpm，离心2分钟后，去除上清培养基；然后，加入pbs缓冲溶液，轻轻摇匀后以相同条件离心，去除上清pbs溶液；重复3次，得到不含培养基的细胞pbs悬浮液。使用细胞滤膜过滤pbs悬浮液中大颗粒杂质，再进行衍生化。按上述1中步骤2)进行液相色谱-质谱分析。
[0041]
3.下述实施例中，所述进样盘的材质为聚醚醚酮。
[0042]
实施例
[0043]
一种用于流式细胞仪和液相色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，包括底板和均匀分布于底板上的96个进样孔，每行12个，共8行，每个进样孔之间间隔d为1mm，如图2和图4所示；每个进样孔包括开设于底板内部的倒锥形凹槽，倒锥形凹槽的顶端向外延伸有环形的凸沿，凸沿内侧形成的圆柱形槽与倒锥形凹槽连通；所述圆台形槽的底端与倒锥形凹槽顶端连接；所述凸沿与底板为一体成型。
[0044]
具体地，底板尺寸和外形同时适配于流式细胞仪和液相色谱仪的进样系统，如图2所示，所述进样盘的底板尺寸为，其长为127mm，宽为85mm，底板厚度h1为12mm，如图1所示；并且，底板的侧壁向外凸伸有与液相色谱进样器卡槽适配的用于限位的定位板，其高度h2为2.5mm，宽为2mm，即其相对于底板向外凸伸的宽度。
[0045]
具体地，如图3所示，倒锥形凹槽的内壁与中心垂直线的角度为40
°
，故α为80
°
，凸沿的内壁与水平面的角度为90
°
；倒锥形凹槽的深度为3.7mm(即h1与h2之差)，容积为30μl；凸沿高度为1mm，顶端横截面外径为8mm，内径为7mm，即凸沿厚度为0.5mm。
[0046]
应用例1
[0047]
本实施例选择氧化脂质107种标准品作为研究对象。以实施例中的进样盘为容器，采用衍生的方法对其进行前处理，之后使用液质联用进行检测分析。
[0048]
首先，用甲醇溶液将氧化脂质配置为100nm的标准品溶液，同时配置好活化剂等反应溶剂。
[0049]
用10μl移液枪转移1μl浓度为100nmol/l的氧化脂质标准品溶液于进样盘的进样孔底部。氮吹干溶剂之后加入活化剂haut(20μmol/ml)，再依次加入衍生试剂depa(20μmol/ml)，缩合剂hobt(20μmol/ml)和催化剂tea(20μmol/ml)，体积分别为2μl，2μl，2μl，4μl，混匀后覆盖粘性密封膜，室温超声反应20～40s即可完成衍生化反应。
[0050]
之后将进样盘放置于液相色谱仪的样品器中进样，进行高效液相色谱-质谱联用进行检测分析。建立液相色谱-质谱联用方法，输入子母离子对，采用质谱mrm扫描模式。设置液相色谱于质谱参数，质谱数据采集使用analyst 1.6.3软件。
[0051]
氧化脂质标准品衍生后的化合物保留时间如表2所示。液质联用mrm模式总流图如图6所示。
[0052]
表2 107种氧脂素衍生化产物的液相色谱-质谱联用保留时间
[0053][0054]
应用例2
[0055]
本实施例采用人乳腺癌细胞(mcf-7)为样本，对其不同个数细胞样本进行氧脂素定性分析。以实施例中的进样盘为容器。
[0056]
首先对带有培养基的mcf-7细胞进行前处理，去除培养基的干扰，得到不含培养基的细胞pbs悬浮液，使用细胞滤膜过滤悬浮液中大颗粒杂质。
[0057]
使用流式细胞仪进行细胞分选，首先调节仪器参数，将经过前处理的细胞样本放置于流式细胞仪细胞进样口，使细胞能准确分选至进样盘的多个进样孔底部。之后放置进样盘至分选平台，设置分选细胞个数为1000个，开始分选多个细胞和单细胞。使细胞被分选至进样盘的多个进样孔中。
[0058]
之后在多个进样孔的细胞样本中分别加入活化剂haut(20μmol/ml)，再依次加入衍生试剂depa(20μmol/ml)，缩合剂hobt(20μmol/ml)和催化剂tea(20μmol/ml)，体积分别为2μl，2μl，2μl，4μl，混匀后覆盖粘性密封膜，室温超声反应20～40s即可完成衍生化反应。
[0059]
然后进行高效液相色谱-质谱联用进行检测分析，根据标准品的保留时间以及mrm离子对进行定性。1000个细胞的氧脂素定性结果如表3所示。
[0060]
表3 1000个mcf-7细胞氧脂素衍生化产物的液相色谱-质谱联用定性结果
[0061][0062]
应用例3
[0063]
本实施例采用人乳腺癌细胞(mcf-7)为样本，对其不同个数细胞样本进行氧脂素定性分析。以实施例中的进样盘为容器。
[0064]
首先对带有培养基的mcf-7细胞进行前处理，去除培养基的干扰，得到不含培养基的细胞pbs悬浮液，使用细胞滤膜过滤悬浮液中大颗粒杂质。
[0065]
使用流式细胞仪进行细胞分选，首先调节仪器参数，将经过前处理的细胞样本放置于流式细胞仪细胞进样口，使细胞能准确分选至进样盘底部。之后放置进样盘至分选平台，设置分选细胞个数为1个，开始分选多个细胞和单细胞。使细胞被分选进样盘中。
[0066]
之后在进样盘样本中加入活化剂haut(20μmol/ml)，再依次加入衍生试剂depa(20μmol/ml)，缩合剂hobt(20μmol/ml)和催化剂tea(20μmol/ml)，体积分别为2μl，2μl，2μl，4μl，混匀后覆盖粘性密封膜，室温超声反应20～40s即可完成衍生化反应。
[0067]
然后进行高效液相色谱-质谱联用进行检测分析，根据标准品的保留时间以及mrm
离子对进行定性。1个细胞的氧脂素定性结果如表4所示。
[0068]
表4 1个mcf-7细胞氧脂素衍生化产物的液相色谱-质谱联用定性结果
[0069][0070]
以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本实用新型的保护范围。

技术特征：
1.用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述进样盘包括底板和分布于底板上的多个进样孔；每个进样孔包括开设于底板内部的倒锥形凹槽，倒锥形凹槽的顶端向外延伸有环形的凸沿，凸沿内侧形成的圆柱形槽或倒圆台形槽与倒锥形凹槽连通。2.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述圆台形槽或倒圆台形槽的底端与倒锥形凹槽顶端连接。3.根据权利要求2所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述倒锥形凹槽的内壁与中心垂直线的角度在40～60
°
之间，凸沿的内壁与凸沿底面之间的角度在90～120
°
之间。4.根据权利要求2所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述凸沿的高度在0.5～1.5mm范围内，厚度在0.25～0.6mm范围内，横截面直径在7～10mm范围内。5.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述倒锥形凹槽的深度在3～5mm之间，体积在20～50μl范围内，顶端横截面直径在6～9mm范围内。6.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述进样盘的底板尺寸和外形同时适配于流式细胞仪和液相色谱仪的进样器，底板的侧壁向外凸伸有与液相色谱仪进样器适配的用于限位的定位板。7.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述进样盘上多个进样孔均匀分布有多行和多列。8.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述进样盘的材质为聚醚醚酮。9.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪和色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述凸沿与底板为一体成型。

技术总结
一种用于流式细胞仪和液相色谱仪在线检测细胞代谢物的进样盘，其特征在于所述进样盘包括底板和分布于底板上的多个进样孔；每个进样孔包括凸沿和倒锥形凹槽，凸沿内侧形成的圆柱形槽或倒圆台形槽与倒锥形凹槽连通；所述进样盘的底板尺寸和外形同时适配于流式细胞仪和液相色谱仪的进样系统。使用本发明所述进样盘在整个细胞分选、前处理以及后续代谢物的分析过程中不用进行细胞样本的转移，有效防止微量样本的损失，可以做到快速在线检测。可以做到快速在线检测。可以做到快速在线检测。


技术研发人员：魏芳 饶缔 唐堂 陈宇 肖华明 吕昕 王丹 陈洪
受保护的技术使用者：中国农业科学院油料作物研究所
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/9/19