稳定表达TGF-βII型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用的制作方法

稳定表达tgf-β
ii型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种稳定表达tgf-βii型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用。


背景技术：

2.肺纤维化是一种由多种病因引起的，以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肺泡的堆积，以及纤维结缔组织的发展为主要特点，并最终导致患者正常肺组织结构改变的一种慢性进行性肺间质疾病。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。
3.肺纤维化的发生需要多种细胞因子的参与，而转化生长因子β(tgf-β)在致纤维化细胞因子网络中占主导地位，tgf-β介导肺纤维化发生主要是通过与tgf-βii型受体胞外区(ex-tβrii)识别结合，进一步募集i型受体发生磷酸化，并启动下游一系列信号转导。通过使用tgf-βii型受体(tβr2)或抗tgf-β1抗体，阻断tgf-β1与ex-tβrii的结合，成为改善肺纤维化的一种选择。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种稳定表达tgf-βii型受体(简称tβr2)的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用。
5.第一方面，本发明要求保护一种制备表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞的方法。
6.本发明所要求保护的制备表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：使巨噬细胞表达tβr
2-fc蛋白，得到表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。
7.在所述方法中，使巨噬细胞表达tβr
2-fc蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有编码tβr
2-fc蛋白的基因的重组载体实现的。
8.其中，所述tβr
2-fc蛋白为将tgf-βii型受体和抗体fc段融合而成的融合蛋白。
9.进一步地，所述tgf-βii型受体的氨基酸序列如seq id no.2的第32-194位所示。
10.进一步地，所述抗体fc段的氨基酸序列如seq id no.2的第195-419位所示。
11.更进一步地，所述tβr
2-fc蛋白可为如下任一：
12.(a1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.2的第32-419位所示的蛋白质；
13.(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
14.(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
15.(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
16.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的
蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
17.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
18.上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
19.在上述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。
20.相应地，所述方法可包括如下步骤：
21.(b1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；
22.(b2)将步骤(b1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。
23.在本发明的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体为将tβr
2-fc蛋白的编码基因插入到pcdh-mcherryp载体的多克隆位点(xbai和bamhi)之间后得到的重组质粒。所述pcdh-mcherryp载体为将pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体(sbi公司产品，cat.#cd713b-1)中的gpf编码基因替换为mcherryp编码基因后得到的重组质粒。其中，mcherryp编码基因如seq id no.3所示。
24.在本发明的具体实施方式中，所述慢病毒包装质粒为pmd2g和pspax2。所述慢病毒包装细胞为293ft细胞。
25.在本发明的具体实施方式中，所述巨噬细胞为raw264.7细胞。
26.在上述方法中，所述tβr
2-fc蛋白的编码基因可为如下任一：
27.(c1)seq id no.1或seq id no.1的第64-1257位所示的dna分子；
28.(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述tβr
2-fc蛋白的dna分子；
29.(c3)与(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tβr
2-fc蛋白的dna分子。
30.上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65
℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
31.上述编码基因，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
32.上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
33.第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述的方法制备得到的表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。
34.第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗肺纤维化的产品中的应用。
35.第四方面，本发明要求保护一种用于预防和/或治疗肺纤维化的产品。
36.本发明要求保护的用于预防和/或治疗肺纤维化的产品，含有前文第二方面中所述表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。
37.其中，所述产品可为药物。
38.在本发明中的具体实施方式中，所述肺纤维化为博莱霉素(blm)诱导的小鼠肺纤维化。
39.本发明利用基因工程的方法构建表达tgf-βii型受体(tβr2)的重组质粒，包装慢病毒，感染raw264.7巨噬细胞，使其能持续稳定表达tgf-βii型受体(tβr2)，进而制备了表达tgf-βii型受体蛋白的巨噬细胞，即实施例中的慢病毒pcdh-rp-tβr
2-fc感染的raw264.7细胞。实验证明，tgf-βii型受体蛋白可以有效拮抗纤维化诱导因子tgf-β的下游信号传导，防止纤维化发生。通过向博莱霉素染毒的肺纤维化小鼠肺内滴注工程化巨噬细胞raw-tβr
2-fc，可以有效减轻小鼠肺纤维化程度。本发明将有助于肺纤维化治疗技术的发展，并推进以巨噬细胞为基础的细胞治疗方法在肺部疾病治疗中的应用。
附图说明
40.图1为重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc的琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定结果。
41.图2为重组慢病毒感染raw264.7细胞荧光表达情况(标尺＝100μm)。
42.图3为利用western blot对构建的工程化巨噬细胞raw-tβr
2-fc的鉴定。
43.图4为tβr
2-fc抑制smad2/3蛋白的磷酸化的功能鉴定。
44.图5为blm诱导的小鼠肺纤维化(以21天为实验终点，通过对纤维化肺组织大体形态观察及肺组织he染色评估肺纤维化程度)。
45.图6为通过检测肺组织羟脯氨酸水平比较raw-tβr
2-fc细胞治疗组与对照组纤维化水平。其中blank为正常对照组(nt组)。
46.图7为利用elisa方法通过检测纤维化小鼠肺组织中tgf-β的表达水平评估纤维化
治疗效果。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体：sbi公司产品，cat.#cd713b-1。
50.pcdh-mcherryp载体：为通过无缝克隆技术将pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体中的gpf编码基因替换为mcherry编码基因后得到的重组质粒。其中，mcherry编码基因如seq id no.3所示。
51.实施例1、稳定表达转化生长因子-βii型受体(tβr
2-fc)蛋白的巨噬细胞株(即慢病毒pcdh-rp-tβr
2-fc感染的raw264.7细胞)的获得和其分泌的tβr
2-fc蛋白的检测
52.一、重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc的构建
53.从网站上获得tβr
2-fc的基因序列，在其基因序列上连接myc标签，使目标载体携带myc标签蛋白，便于利用western blot进行检测。将tβr
2-fc构建在经xbai和bamhi双酶切后的载体pcdh-mcherryp的多克隆位点中，得到重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc，该重组质粒交由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
54.重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc的结构描述：将pcdh-mcherryp载体的酶切位点xbai和bamhi之间的小片段替换为seq id no.1所示dna片段的重组质粒。
55.seq id no.1的第1-93位为myc标签蛋白的编码基因，第94-582位为tβr2的编码基因，第583-1257位为抗体fc片段的编码序列。
56.seq id no.1编码seq id no.2所示氨基酸序列。seq id no.2的第1-31位为myc标签蛋白，第32-194位为tβr2，第195-419位为抗体fc片段。
57.图1为重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc的琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定结果。1：pcdh-rp-tβr
2-fc重组质粒。2：重组质粒pcdh-rp-tβr
2-fc经xbai和bamhi双酶切后的产物：目标载体tβr
2-fc片段和空载体pcdh-mcherryp片段。质粒大小符合预期。
58.二、包装重组慢病毒
59.取对数期状态良好的293ft细胞，接种于60mm
×
15mm培养皿中，37℃，5％co2培养箱内培养，当细胞汇合度达到60％至70％时用慢病毒三质粒共转染体系进行转染。将包装质粒1μg pmd2.g、2μg pspax2(该2种质粒为通用生物有限公司产品)，与4μg目标质粒(步骤一构建的pcdh-rp-tβr
2-fc或pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro(阴性对照))用100μl opti-mem混合均匀。然后用100μl opti-mem稀释16μl lipofectaminetm2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和质粒dna稀释液，混匀，室温下静置20min。最后将转染复合物加入到细胞培养皿中，前后轻摇培养皿混合均匀。转染4-6h后可换新鲜培养基。转染后48h或72h收集富含慢病毒包装颗粒的细胞上清液，将收集的上清液3000g离心5min，去除细胞残余，上清用0.22μm的滤器过滤，随后4000g离心20min得到约200μl的病毒浓缩
液，立即感染细胞或放-20℃保存备用。
60.三、重组慢病毒感染raw264.7细胞
61.将raw264.7细胞接种于60mm直径的培养皿中，37℃，5％co2培养箱内培养，当细胞生长至对数期且状态良好时，取少量细胞接种于12孔培养板中，分别加入20μl浓缩后的pcdh-rp-tβr
2-fc/pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro病毒液(病毒滴度约为108pfu/ml)，感染约72h后，利用倒置荧光显微镜，在450至490nm的激发光照射下，观察raw264.7细胞的感染情况。加入10mg
·
l-1
的嘌呤霉素进行抗性筛选，24h后更换新鲜培养基，此时未感染成功的细胞被嘌呤霉素杀死，感染成功地细胞继续生长，分别命名为raw-tβr
2-fc和raw-con细胞，待细胞长满后将其接种至新的培养皿中扩大培养。
62.用浓缩的pcdh-rp-tβr
2-fc和pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro病毒液感染raw264.7细胞，约72h后，在倒置荧光显微镜下观察到成功感染pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro的raw264.7细胞在488nm激发光照射下表达绿色荧光蛋白(gfp)，成功感染pcdh-rp-tβr
2-fc的raw264.7细胞表达红色荧光蛋白mcherry。如图2所示。
63.四、western blot检测tβr
2-fc的表达
64.同时收集利用慢病毒包装体系过表达tβr
2-fc的raw264.7的上清液和细胞，制成上样液，用12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)分离蛋白，先恒压90v，(约25min)等marker跑开，恒压180v(约40min)，直至蛋白跑到底部。制作海绵-滤纸-膜三明治，恒流90ma-3h或40ma-8h，将蛋白转移至硝酸纤维素膜(pvdf膜)上。将蛋白条带放入5％脱脂奶粉室温封闭1h。与1:1000稀释的myc一抗(抗体为cst公司的产品)工作液孵育过夜。抗体吸出回收，蛋白条带用tbst洗次，每次10min。加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠igg二抗(jackson immunoresearch公司的产品)，摇床上室温孵育1h；tbst洗3次，每次10min。加入ecl显影液放入tanon5200化学发光成像分析系统进行显影。
65.结果显示：过表达tβr
2-fc的raw264.7细胞培养上清液和细胞裂解液中均可检测到带myc标签的特异性条带，条带大小与目标蛋白一致；而转载空载体pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro的raw264.7细胞培养上清及细胞裂解液中未能检测到特异性蛋白表达。如图3所示。
66.实施例2、western blot检测tβr
2-fc对tgf-β/smad信号转导通路的抑制作用
67.取适量mle-12细胞接种于24孔板中，在37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养，待细胞汇合度达80％左右时进行实验，实验分为：空白对照组、tgf-β组、tgf-β+raw-con组、tgf-β+raw-tβr
2-fc组、raw-con组、raw-tβr
2-fc组。
68.①
空白对照组细胞中不加入任何刺激。
②
在tgf-β+raw-con组、tgf-β+raw-tβr
2-fc组、raw-con组和raw-tβr
2-fc组4组中首先从培养有mle细胞的培养容器中吸取出700μl丢弃，然后各组分别加入与组别相对应的raw-con、raw-tβr
2-fc细胞(参见实施例1)培养上清液700μl，共培养0.5h；
③
tgf-β组、tgf-β+raw-con组、tgf-β+raw-tβr2-fc组中分别加入工作浓度为1μg
·
l-1
的tgf-β刺激因子刺激1.5h。然后去除细胞培养基，用预冷的pbs洗涤两次，收集细胞，制成上样液，按照实施例1步骤四中描述的方法进行western blot检测，检测p-smad2/3和smad2/3的表达。
69.结果显示：在mle-12细胞中加入tgf-β刺激后，可检测到p-smad2/3的特异性条带；
当mle-12细胞与raw-tβr
2-fc细胞培养上清液共培养后，再加入tgf-β刺激后，未能检测到p-smad2/3的表达；与raw-con的细胞培养上清液共培养时可检测到p-smad2/3的表达；单独加入raw-con或raw-tβr2-fc不能检测到p-smad2/3的表达，所有细胞中均能检测到smad2/3的表达。如图4所示。上述结果表明：本发明所构建的工程化巨噬细胞raw-tβr2-fc可成功分泌tβr2，并阻断tgf-β诱导的smad2/3的磷酸化，从而达到抗纤维化的作用。
70.实施例3、工程化巨噬细胞raw-tβr2fc对blm诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用
71.健康6-8周龄雄性balb/c小鼠，体重18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物合格证：scxk(京)2019-0008]。硫酸博莱霉素(blm)母液的配制：将10mg blm溶解于500μl dmso(使用前放入水浴锅中加热至50℃)中，配成20g
·
l-1
的blm母液，使用时稀释成所需浓度。
[0072]
1、健康雄性balb/c小鼠随机分成4组，每组6只，分别为正常对照组(nt组)、pbs组及raw-con组、raw-tβr
2-fc细胞治疗组。各组小鼠均饲养于spf级动物实验室内，实验前一周予以适应性饲养，喂养条件相同。nt组不做任何处理。其余组别采用重复给药法，于实验第1天和第3天重复给予5mg/kg的blm滴鼻，每只50μl，诱导小鼠肺纤维化(见图5)。pbs组于第1天(以blm第一次滴鼻作为第1天)、第7天给予pbs溶液滴鼻，每只50μl。raw-con组和raw-tβr
2-fc细胞治疗组，每组分别于第1天(以blm第一次滴鼻作为第1天)、第7天给予1
×
106个raw-con和raw-tβr
2-fc细胞。具体给药方案为：将各组准备滴鼻的细胞消化各传代至两个大皿中，用dmem完全培养基，放至37℃，5％co2培养箱中培养，待细胞状态良好，汇合度达到约90％-95％左右时收集细胞，pbs冲洗两遍，收集至15ml离心管中，4ml pbs重悬，利用细胞计数板进行计数，根据所需细胞数量，计算出需加pbs的体积进行实验，以21天(以blm第一次滴鼻作为第1天)为实验终点。
[0073]
2、完成上述步骤后，于实验第21天检测小鼠肺组织羟脯氨酸含量，评估细胞治疗效果。
[0074]
羟脯氨酸在胶原蛋白中占1.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。羟脯氨酸为胶原纤维所特有，通过对羟脯氨酸含量的检测，不但可以评估纤维化严重程度，同时为纤维化治疗研究提供参考。羟脯氨酸(hyp)检测试剂盒(碱水解法)为南京建成生物工程研究所的产品，货号a030-2-1。具体检测方法参见试剂盒说明书进行。
[0075]
结果显示：与pbs组相比，raw-tβr
2-fc细胞治疗组羟脯氨酸含量均明显下降，差异有统计学意义(p《0.05)。如图6所示。
[0076]
实施例4、工程化巨噬细胞raw-tβr
2-fc的体内功能验证
[0077]
组织样品的制备：取少量剪碎的实施例3中不同组小鼠右肺组织用滤纸吸干表面水分进行称重，按照小鼠肺组织重量的10倍加入pbs溶液，置于5ml离心管中，使用电动匀浆器制成肺组织匀浆，12000rpm/min，离心15min，取上清用于检测。
[0078]
用rd mouse tgf-βelisa试剂盒检测上清液中tgf-β的分泌水平，步骤如下(参照试剂盒说明书进行，下述试剂均为试剂盒中产品)：
[0079]
板子准备：
[0080]
⑴
抗体包被：用pbs稀释抗体包被液至工作浓度，加入96孔板中，每孔100μl，用pe手套盖住防止液体挥发，室温孵育过夜。
[0081]
⑵
洗板：每孔加入400μl的wash buffer洗掉抗体包被液，放入洗板机中洗3次，每次一次尽量拍干孔中残余的液体，动作要快，避免板子干掉。
[0082]
⑶
封闭：每孔加入300μl reagent diluent，室温孵育1h。
[0083]
⑷
弃掉封闭液，重复步骤(2)。
[0084]
样品准备：
[0085]
⑸
每孔加入100μl稀释后的标准品或样品工作液，室温孵育2h。
[0086]
⑹
吸出液体，重复步骤(2)。
[0087]
⑺
每孔加入100μl检测抗体(detection antibody),室温孵育2h。
[0088]
⑻
吸出检测液体，重复步骤(2)。
[0089]
⑼
每孔加入100μl的streptavidin-hrp,室温避光20min。
[0090]
⑽
吸出检测液，重复步骤(2)。
[0091]
⑾
每孔加入100μl的substrate solution，室温避光20min。
[0092]
⑿
每孔加入50μl的stop solution,立即在tecan f50酶标仪中检测450nm波长处od值。然后根据利用标准品绘制的标准曲线计算得到待测样本中tgf-β含量。
[0093]
结果：与对照组相比，移植raw-tβr
2-fc的小鼠肺组织中tgf-β的含量与对照组相比明显下降(p《0.05)，表明工程化巨噬细胞raw-tβr
2-fc可成功拮抗tgf-β，发挥抗纤维化的作用。如图7所示。
[0094]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种制备表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞的方法，包括如下步骤：使巨噬细胞表达tβr
2-fc蛋白，得到表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，使巨噬细胞表达tβr
2-fc蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有tβr
2-fc蛋白的编码基因的重组载体实现的。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述tβr
2-fc蛋白为将tgf-βii型受体和抗体fc段融合而成的融合蛋白；进一步地，所述tgf-βii型受体的氨基酸序列如seq id no.2的第32-194位所示；和/或进一步地，所述抗体fc段的氨基酸序列如seq id no.2的第195-419位所示；更进一步地，所述tβr
2-fc蛋白为如下任一：(a1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.2的第32-419位所示的蛋白质；(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(b1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；(b2)将步骤(b1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。6.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述巨噬细胞为raw264.7细胞。7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述tβr
2-fc蛋白的编码基因为如下任一：(c1)seq id no.1或seq id no.1的第64-1257位所示的dna分子；(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述tβr
2-fc蛋白的dna分子；(c3)与(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tβr
2-fc蛋白的dna分子。8.权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。9.权利要求8所述表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗肺纤维化的产品中的应用。10.一种用于预防和/或治疗肺纤维化的产品，含有权利要求8所述表达tβr
2-fc蛋白的巨噬细胞。

技术总结
本发明公开了稳定表达TGF-βII型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用。本发明公开了一种制备表达TβR


技术研发人员：刘慧莹 杨翠平 张硌 柏长青
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第八医学中心
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/6