一种甘草次酸和环糊精-金属有机骨架复合物

1.本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种以环糊精-金属有机骨架为载体的甘草次酸复合物。


背景技术：

2.18-β-甘草次酸(glycyrrhetnic acid，ga)是甘草中最重要的有效成分，也是甘草酸在体内的代谢产物和起效物质，具有抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能的作用。甘草次酸的结构属于五环三萜，具有类固醇样的抗炎作用和肾上腺皮质激素样药理作用，在临床上广泛用于治疗各种慢性肝炎、荨麻疹等。
3.近年来，甘草次酸防治肺疾病的作用被频繁报道，包括肺纤维化、肺损伤、肺部肿瘤以及新冠肺炎病毒等。甘草次酸能够有效降低x射线照射引起的小鼠肺损伤，治疗组与正常组的炎症因子水平一致，也能治疗脂多糖造成的小鼠急性肺损伤，与脂多糖造模组相比，甘草次酸抑制nlrp3的形成和激活，下调巨噬细胞活性氧(ros)的产生以及pi3k和akt的磷酸化水平，从而抑制炎症的发生。肺纤维化是先由各种原因所致的炎症损伤了正常的肺泡结构，代之以胶原疤痕组织累积修复该损伤，即产生纤维化而使肺组织逐渐丧失正常呼吸功能，产生呼吸困难、缺氧等症状，最终导致呼吸衰竭。因此，甘草次酸在治疗炎症的基础上有效防止肺纤维化的形成。除此之外，甘草次酸还能减少细胞中蛋白的合成，以及阻断细胞在g1期的循环，从而治疗肺非小细胞癌。近两年来，新冠肺炎病毒在全球蔓延，给人民安全和经济发展造成巨大损失，甘草次酸具有杀灭多种病毒的能力，包括新冠肺炎病毒，主要机理为细胞膜水平上诱导胆固醇依赖的脂肪筏生成，从而阻止病毒进入细胞，并在细胞内部和增殖过程中，捕获高迁移率的盒蛋白b1，阻断hmgb1的报警功能，进一步阻断病毒的增殖。
4.然而，甘草次酸水溶性差且生物利用度低，全身用药后到达肺部的药量低，给其治疗肺部疾病带来挑战，如何开发一种能够提高甘草次酸水溶性，增加生物利用度，且能够靶向肺部的制剂方法成为研究的热点。如cn110787130a公开了“一种18β-甘草次酸固体分散体及其制备方法”，该技术是由18β-甘草次酸、亲水性载体和键合剂的两种或者三种混合后通过固体分散体技术处理获得，以提高药物的体外溶出速率，并改善甘草次酸ph依赖性的溶解度，但是该技术需要热熔挤出机，且在150℃以上温度挤出，得到的无定型粉体可能存在转晶现象，影响颗粒的稳定性。
5.cn1022552982公开了“一种甘草次酸温敏凝胶及其制备方法”，该凝胶可以克服口服给药带来的吸收度低、肝脏首过效应等问题，凝胶制剂往往只能用于皮肤和体腔，不适用于肺部药物递送。已有文献报道可以通过材料修饰增加ga的溶解度，合成壳聚糖衍生物后，ga在水和磷酸盐缓冲液中的溶解度大大提高；另外，将ga纳米化制备成纳米晶体，以及通过冻干单相溶液法制备脂质体，均能增加ga的溶解度，但是上述工艺制备工艺相对复杂，给商品化开发带来挑战。目前报道甘草次酸对肺纤维化、肺损伤、肺动脉高压和肺癌的治疗，都是通过直接给原料药或者甘草的提取物，因此，本领域需要开发一种提高甘草次酸生物利用度和肺靶向的制剂工艺。
6.因此，本领域亟需研究出一种溶解度高、生物利用度高、体内吸收效果优异的甘草次酸复合物。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种甘草次酸复合物，所述的甘草次酸复合物，其水溶性显著提高，具有双相释放特征，口服后能够显著提高ga的生物利用度；还能作为干粉吸入剂粉体，实现肺局部给药，提高药物在肺部的有效吸收量，从而增加ga对肺部疾病的治疗效果。
8.本发明的第一方面，提供了一种复合物，所述复合物包含组分(a)甘草次酸；(b)环糊精-金属有机骨架。
9.在另一优选例中，所述复合物为甘草次酸双相释放的复合物。
10.在另一优选例中，所述双相释放是指所述复合物在水中，甘草次酸在0.5h内快速释放超过40％(优选超过50％)，稳定持续至10-16小时；然后10-16小时后甘草次酸缓慢释放，约96小时以上达到100％左右。
11.在另一优选例中，所述复合物具有选自下组的一个或多个特征：
12.(1)所述复合物为晶体，优选方形晶体，更优选为立方形晶体；
13.(2)所述复合物的粒径为0.3-10μm，例如0.3、0.5、0.7、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9μm；
14.(3)所述复合物中(a)甘草次酸；(b)环糊精-金属有机骨架的复合方式为甘草次酸进入环糊精-金属有机骨架的空腔中，和/或甘草次酸被环糊精半包合；
15.(4)所述复合物中甘草次酸的载药量(wt％)为5％-30％，优选8％-20％，例如8％、10％、12％、15％、18％；
16.(5)所述复合物在水中(25℃)的溶解度为0.5-5mg/ml，优选为1-4mg/ml，更优选2-4mg/ml，更优选2-3mg/ml；
17.(6)所述复合物在水中(25℃)的溶解度相比原料药提高了3000-10000倍，优选提高了5000-10000倍，更优选提高了5500-8000倍；
18.(7)所述复合物中甘草次酸与环糊精-金属有机骨架的载药摩尔比为0.02-0.8:1，优选0.3-0.8:1，更优选0.5-0.8:1；
19.(8)所述复合物中环糊精-金属有机骨架的粒径为0.3-10μm，例如0.3、0.5、0.7、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9μm。
20.在另一优选例中，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精，或其组合，优选γ-环糊精。
21.在另一优选例中，使用孵育法在环糊精-金属有机骨架溶液中孵育药物甘草次酸得到所述的复合物。
22.在另一优选例中，所述复合物由本发明第二方面所述的方法制备得到。
23.本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的复合物的制备方法，所述的复合物通过以下方法制备：
24.(s1)提供环糊精-金属有机骨架；
25.(s2)将甘草次酸与环糊精-金属有机骨架混合，在温度t1条件下孵育时间t1得到
所述复合物。
26.在另一优选例中，所述环糊精-金属有机骨架为微米级环糊精-金属有机骨架或纳米级环糊精-金属有机骨架，优选纳米级环糊精-金属有机骨架。
27.在另一优选例中，所述微米级环糊精-金属有机骨架的尺寸为1-10μm，例如1-5μm或2-7μm。
28.在另一优选例中，所述纳米级环糊精-金属有机骨架的尺寸为0.1-1μm，优选0.3-1μm。
29.在另一优选例中，所述步骤(s2)的反应条件具有选自下组的一个或多个特征：
30.(1)所述甘草次酸与环糊精-金属有机骨架的投料摩尔比为1-15:1，优选5-15:1，优选5-10:1；
31.(2)所述孵育温度t1为40-70℃，优选50-60℃；
32.(3)所述孵育在水浴条件下进行；
33.(4)所述孵育时间t1为1-12h，优选1-6h；
34.(5)所述孵育在溶剂存在下进行，所述溶剂选自：甲醇、乙醇，或其组合；
35.(6)所述甘草次酸与溶剂的质量体积比为0.2-0.5mg/ml，优选0.25mg/ml。
36.在另一优选例中，所述反应在搅拌下进行，所述搅拌的转速为200-500rpm，优选400rpm。
37.在另一优选例中，所述环糊精-金属有机骨架为中性环糊精-金属有机骨架。
38.在另一优选例中，所述环糊精-金属有机骨架通过以下方法制备：
39.(a)在第一溶剂中，将环糊精与碱混合，得到第一混合溶液；
40.(b)向所述的第一混合溶液中加入第二溶剂，混合反应，得到第二混合物；
41.任选地(c)向所述第二混合物中加入尺寸调节剂，析晶形成含所述环糊精-金属有机骨架材料的第三混合物；和
42.(d)所述的第三混合物经分离得到所述的环糊精-金属有机骨架材料。
43.在另一优选例中，在步骤(a)中，所述环糊精与碱在第一溶剂中加热溶解或超声溶解，得到第一混合溶液。
44.在另一优选例中，所述步骤(a)具有如下的一个或多个特征：
45.(1)所述第一溶剂为水，优选为纯水；
46.(2)所述环糊精与碱的投料摩尔比为1:1-10，优选1:2-8，更优选1:5-8；
47.(3)所述环糊精在第一溶剂中的浓度为20-1000mm，优选20-100mm，更优选20-50mm，更优选25mm；
48.(4)所述碱含有(a)金属离子和(b)酸根，其中所述金属离子选自k
+
、li
+
、na
+
、mg
2+
、ca
2+
，或其组合；所述酸根选自oh-、ch3coo-、卤素离子，或其组合，优选碱为koh或ch3cook。
49.在另一优选例中，所述步骤(a)任选地还包括将环糊精与碱在第一溶剂中混合的产物过滤的后处理步骤，从而得到第一混合溶液。
50.在另一优选例中，所述步骤(b)具有如下的一个或多个特征：
51.(1)所述第二溶剂选自乙醇、甲醇，或其组合；
52.(2)所述第一混合溶液与第二溶剂的体积比为1:2-0.5，优选1:1-0.6；
53.(3)所述反应在50-70℃下进行；
54.(4)所述反应的反应时间为0.25-1h，优选0.3h。
55.在另一优选例中，所述步骤(b)任选地还包括将第一混合溶液和第二溶剂混合加热至澄清，反应得到第二混合物。
56.在另一优选例中，所述步骤(c)具有如下的一个或多个特征：
57.(1)所述尺寸调节剂为聚乙二醇；
58.(2)所述聚乙二醇的分子量为15000-25000，优选20000；
59.(3)所述尺寸调节剂与环糊精的质量比为0.1-0.5，优选0.1-0.3；
60.(4)所述尺寸调节剂以溶解在第三溶剂的溶液形式加入；其中，所述第三溶剂选自甲醇、乙醇。
61.在另一优选例中，所述步骤(c)包括向所述第二混合物与尺寸调节剂混合，冷水浴静置析晶，析晶得到第三混合物。
62.在另一优选例中，所述析晶在2-10℃下进行。
63.在另一优选例中，所述析晶的时间为10-18h。
64.在另一优选例中，所述步骤(c)包括向所述第二混合物与尺寸调节剂混合，加热反应，然后静置析晶得到第三混合物。
65.在另一优选例中，所述加热在50-70℃下进行。
66.在另一优选例中，所述加热的时间为0.2-0.5h。
67.在另一优选例中，所述析晶在10-40℃下进行。
68.在另一优选例中，所述析晶的时间为1-3h。
69.在另一优选例中，所述步骤(d)包括离心、洗涤和/或干燥的后处理步骤。
70.在另一优选例中，所述洗涤包括使用甲醇洗涤至ph为6.5-7.5。
71.在另一优选例中，所述洗涤包括用无水乙醇(含4％乙酸)进行一次洗涤，用无水乙醇进行二次洗涤，最后用甲醇洗涤至ph 6.5-7.5
72.在另一优选例中，所述步骤(b)任选地还包括将第一混合溶液和第二溶剂混合的产物离心，弃上清得到第二混合物。
73.在另一优选例中，所述步骤(b)可重复0-2(例如1、2)次。
74.本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂包含本发明第一方面所述的复合物。
75.在另一优选例中，所述制剂通过吸入给药或口服给药，优选为吸入给药。
76.在另一优选例中，所述制剂为吸入制剂或口服制剂。
77.在另一优选例中，所述吸入制剂包括干粉吸入剂、喷雾剂、粉雾剂或气雾剂。
78.在另一优选例中，所述制剂还包括制剂学上可接受的载体。
79.在另一优选例中，所述制剂学上可接受的载体选自下组：乳糖、胆固醇、硬脂酸镁，或其组合。
80.在另一优选例中，所述乳糖包括粗乳糖和细乳糖。
81.在另一优选例中，所述细乳糖选自下组：d50粒径为0-5μm的乳糖、d50粒径为4-11μm的乳糖，或其组合。
82.在另一优选例中，所述粗乳糖选自下组：d50粒径为40-70μm的乳糖、d50粒径为70-130μm的乳糖、d50粒径为53-66μm的乳糖、d50粒径为95-125μm的乳糖，或其组合。
83.在另一优选例中，所述制剂学上可接受的载体为粗乳糖和细乳糖的混合物，其中所述细乳糖和粗乳糖的质量比为0.1-1：10，优选0.2、0.5、0.8:10。
84.在另一优选例中，所述复合物与制剂学上可接受的载体的质量比为1:0.01-2，优选1:1。
85.在另一优选例中，所述制剂通过复合物与制剂学上可接受的载体以等量递加的方式预混得到。
86.在另一优选例中，所述制剂的制备方法包括：将复合物与制剂学上可接受的载体以等量递加的方式预混，再将预混粉体加入到v型混合器，40r/min混合15min，继续以相同的转速混合15min，得到所述制剂。
87.在另一优选例中，所述制剂(优选干粉吸入制剂)具有选自下组的一个或多个特征：
88.(1)所述制剂的微细粒子分数为10％-50％，优选20％-40％；
89.(2)所述制剂的排空率超过98％，优选超过99％，更优选超过99.5％；
90.(3)所述制剂中甘草次酸的大鼠体内吸收为双相吸收，即在5min内迅速吸收达到25％以上，之后缓慢吸收，8小时吸收超过40％；
91.(4)所述制剂中甘草次酸的大鼠体内吸收相比原料药的吸收提高至3倍以上；
92.(5)所述制剂中甘草次酸在大鼠肺部的组织分布超过其他组织的50倍，10分钟后在肺部的甘草次酸浓度超过70ng/mg；
93.(6)所述制剂相比直接给予原料药的肺系数减少30％以上，smad3浓度降低50％。
94.本发明的第四方面，提供了一种经口吸入给药装置，所述装置包括吸入装置和本发明第三方面所述的制剂。
95.在另一优选例中，所述吸入装置包括干粉吸入装置，喷雾装置、粉雾装置或气雾装置。
96.在另一优选例中，所述吸入装置为单剂量胶囊型吸入装置。
97.本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的复合物和/或本发明第三方面所述的制剂的用途，用于在溶液中双相释放甘草次酸。
98.在另一优选例中，所述如本发明第一方面所述的复合物和/或本发明第三方面所述的制剂用于治疗和/或预防肺疾病。
99.在另一优选例中，所述肺疾病选自下组：肺纤维化、肺损伤、肺部肿瘤以及新冠肺炎病毒。
100.本发明的第六方面，提供了一种在溶液中双相释放甘草次酸的方法，包括将如本发明第一方面所述的复合物和/或本发明第三方面所述的制剂施用于有此需要的患者。
101.在另一优选例中，所述方法在体外进行。
102.本发明的第七方面，提供了一种治疗和/或预防肺疾病的方法，包括将如本发明第一方面所述的复合物和/或本发明第三方面所述的制剂施用于有此需要的患者。
103.在另一优选例中，所述肺疾病选自下组：肺纤维化、肺损伤、肺部肿瘤以及新冠肺炎病毒。
104.在另一优选例中，所述方法在体外进行。
105.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具
体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
106.图1为实施例1中nano-cd-mof和ga@nano-cd-mof的sem图。
107.图2为实施例1中nano-cd-mof和ga@nano-cd-mof的pxrd图。
108.图3为实施例1中nano-cd-mof和ga@nano-cd-mof的dsc图。
109.图4为实施例1中nano-cd-mof和ga@nano-cd-mof的tga图。
110.图5为实施例1中ga@nano-cd-mof的ngi结果。
111.图6为实施例1中ga@nano-cd-mof中ga和γ-cd的体外释放。
112.图7为实施例1中ga@nano-cd-mof吸入和ga口服给药后体内的吸收曲线。
113.图8为实施例1中ga@nano-cd-mof的分子模拟图。
114.图9为实施例1中不同给药组的平均血药浓度-时间曲线。
115.图10为实施例1中口服和肺部吸入ga@nano-cd-mof后大鼠不同组织中药物分布浓度。
116.图11为实施例1中大鼠肺部he、masson染色图，hyp、tgf-β1、smad3含量。
具体实施方式
117.本发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现了一种甘草次酸与环糊精-金属有机骨架复合得到的复合物，其中甘草次酸进入环糊精金属骨架的空腔中；所述复合物可以显著提高甘草次酸原料药的水溶解性，并且该复合物具有缓释特征和双相释放特征，既可以使体内药量立刻达到治疗浓度，后又能缓慢释放维持体内药物浓度，减少给药次数，提高用药顺应性。
118.本发明还提供了一种包含所述复合物的制剂，尤其是干粉吸入剂，可以直接递送于肺部，增加药物在肺部的沉积量，减少给药剂量，降低副作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
119.术语
120.除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
121.如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
122.如本文所用，术语“环糊精”和“cd”可互换使用。
123.如本文所用，术语“环糊精-金属有机骨架材料”和“cd-mof”可互换使用。
124.甘草次酸
125.甘草次酸是甘草中最重要的有效成分，也是甘草酸在体内的代谢产物和起效物质，具有抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能的作用。甘草次酸的结构属于五环三萜，具有类固醇样的抗炎作用和肾上腺皮质激素样药理作用，在临床上广泛用于治疗各种慢性肝炎、荨麻疹等。
126.近年来，甘草次酸防治肺疾病的作用被频繁报道，包括肺纤维化、肺损伤、肺部肿
瘤以及新冠肺炎病毒等。然而，甘草次酸水溶性差，且常规给药方式，例如口服、皮下注射等，甘草次酸基本不被吸收，生物利用度低，使得甘草次酸的临床应用价值大大降低。并且，长期服用该药可引起类醛固酮增多症等不良反应，表现为患者长期用药后出现水肿、湿疹、低血钾、与电解质紊乱相关的高血压和钠潴留等现象，这些副作用的存在可能是因为甘草次酸的肝肠循环，导致长时间在体内积聚，不能排除体外。所以探究甘草次酸新的剂型，提高生物利用度、降低给药剂量以消除不良反应具有临床实际应用价值。
127.环糊精-金属有机骨架
128.本发明提供了一种环糊精-金属有机骨架，其内部具有适合的孔径用于将甘草次酸进入内部孔道中或包合甘草次酸。
129.本发明的环糊精-金属有机骨架包括孔径在2-7μm范围内的环糊精-金属有机骨架(cd-mof)、孔径在1-5μm范围内的微米级环糊精-金属有机骨架(micro-cd-mof)和孔径在0.3-1μm范围内的纳米级环糊精-金属有机骨架(nano-cd-mof)。
130.优选地，本发明的环糊精-金属有机骨架为径在1-5μm范围内的微米级环糊精-金属有机骨架(micro-cd-mof)和孔径在0.3-1μm范围内的纳米级环糊精-金属有机骨架(nano-cd-mof)，二者均可用于肺部给药。
131.本发明的复合物
132.本发明提供了一种复合物，包含了甘草次酸与环糊精-金属有机骨架。
133.如本文所用，术语“本发明的复合物”、“ga@cd-mof”是指本发明得到的以环糊精金属骨架为载体，甘草次酸进入环糊精金属骨架的空腔中，形成的甘草次酸-环糊精金属有机骨架复合物。所述复合物具有缓释特征和双相释放特征。
134.优选地，所述双相释放是指所述复合物中的甘草次酸在0.5h内快速释放超过40％(优选超过50％)，稳定持续至10-16小时；然后10-16小时后甘草次酸缓慢释放，约120小时达到100％左右。
135.本发明的复合物可以显著提高甘草次酸的水溶解性，该复合物的溶解性相比原料药提高了3000-10000倍。
136.本发明以环糊精金属有机骨架为载体，制备甘草次酸复合物，提高生物利用度和达到肺部递送的目的，尤其指甘草次酸载到环糊精有机骨架中，成千倍的增加了水溶解度，且产生双相释放机制，口服和吸入给药后达到治疗肺部疾病的目的。
137.本发明所涉及的环糊精金属有机骨架粒径可控，载甘草次酸后可制备成干粉吸入剂粉体，有效递送到肺泡部位，大大增加了甘草次酸在肺部的沉积量。此外，双相释放的特质能够让甘草次酸在体内快速释放，达到治疗浓度，剩余药量缓慢释放维持体内药物浓度，从而可以减少给药量和给药次数，提高病人的用药顺应性，减少副作用。
138.双相释放
139.双相释放是一种独特的缓释技术，是指首先在给药后体内药量立刻达到治疗浓度(优选30min内)，之后缓慢释放维持体内药物浓度。
140.本发明的复合物具有双相释放特征，本发明复合物在水中，甘草次酸在0.5h内快速释放超过40％(优选超过50％)，稳定持续至10-16小时；然后10-16小时后甘草次酸缓慢释放，约96小时以上达到100％左右。
141.双相释放可以显著减少给药次数，提高用药顺应性。
142.制剂
143.本发明提供一种制剂，所述的制剂包括本发明的复合物。
144.在另一优选例中，本发明所述的制剂为口服制剂或吸入制剂，优选为吸入制剂。
145.在另一优选例中，本发明所述的制剂为还包括制剂学上可接受的载体。
146.在本发明中，术语“制剂学可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
147.应理解，在本发明中，所述的制剂学可接受的载体没有特别的限制，为本领域常用材料，其种类、使用方法、来源为本领域技术人员所熟知。
148.制剂学可接受的载体例子包括(但不限于)糖类、氨基酸类、抛射剂、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、ph调节剂、透皮促进剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、纯水、无热原水等。
149.本发明所述的吸入制剂可以为干粉吸入剂、喷雾剂、粉雾剂或气雾剂。
150.一种典型地的吸入制剂为干粉吸入剂。
151.在另一优选例中，所述的复合物与制剂学可接受的载体的重量比为0.2-2:0.2-2，较佳地0.5-1.5:0.5-1.5，更佳地0.8-1.2:0.8-1.2。
152.在另一优选例中，所述的制剂学可接受的载体选自下组：糖类、氨基酸、卵磷脂和磷脂酰胆碱，或其组合。
153.在另一优选例中，干粉吸入剂可接受的辅料为乳糖，优选为粗乳糖和细乳糖的组合。
154.在另一优选例中，所述的制剂学可接受的载体选自下组：d50粒径为0-5μm的乳糖、d50粒径为4-11μm的乳糖、d50粒径为40-70μm的乳糖、d50粒径为70-130μm的乳糖、d50粒径为53-66μm的乳糖、d50粒径为95-125μm的乳糖，或其组合。
155.本发明的主要优点包括：
156.(1)本发明的环糊精-金属有机骨架可显著改善ga的溶解性；
157.(2)本发明的复合物具有双相释放特征，第一相在0.5h内快速释放超过40％(优选超过50％)，稳定持续至10-16小时；第二相为10-16小时后甘草次酸缓慢释放，约96小时以上达到100％左右，吸入后具有缓释效果；
158.(3)基于cd-mof颗粒的粒径和形态优势，将ga制备成可吸入干粉，直接递送于肺部，增加药物在肺部的沉积量，减少给药剂量，降低副作用；
159.(4)ga@cd-mof与乳糖混合、胆固醇或者硬脂酸镁修饰后，可以提高粉体的流动性，以及空气动力学效果。
160.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
161.实施例1
162.(1)ga@nano-cd-mof的制备
163.nano-cd-mof的制备：γ-cd和koh按照n
γ-cd
：n
koh
＝1:8的投料摩尔比进行制备，分别称取12.96gγ-cd和4.48g氢氧化钾溶于400ml纯水，超声溶解，过0.8μm滤膜过滤得到反
应母液。量取100ml母液倒入500ml试剂瓶(共4瓶)，向母液中加入60ml甲醇，溶液体系变浑浊，充分震荡，混合均匀，将反应液置于水浴锅加热(60℃)。待沉淀重新全部溶解，体系澄清后在60℃水浴锅中放置20min，再加入80ml 8mg/ml peg 20000甲醇溶液，溶液体系再次变浑浊。充分震荡，混合均匀，将反应液置于60℃水浴锅加热20min，取出，室温静置2h，使晶体充分析出沉淀。离心，去上清，沉淀用无水乙醇(含4％乙酸)洗涤，超声分散，离心弃去上清，下层沉淀用无水乙醇洗1次。最后用甲醇洗涤至ph 6.5-7.5，于60℃烘箱干燥5h，即得中性化纳米级koh-cd-mof。
164.ga@nano-cd-mof制备：通过孵育法载药物甘草次酸(ga)。包括步骤：将1.18g ga至10ml西林瓶中，加入10ml乙醇，超声，直至药物全部溶解。将ga与cd-mof以10:1的摩尔比加入0.36g实施例1制备的纳米级cd-mof，加入西林瓶中，使用磁力搅拌器在水浴60℃,400rpm下搅拌6h。混悬液用布氏漏斗进行抽滤，将滤饼在60℃真空干燥箱中过夜干燥，即得ga@nano-cd-mof。
165.溶解度测定分别精密称取50mg 18β-甘草次酸原料药、ga@nano-cd-mof于离心管中，加入1ml纯水溶解，放置在恒温孵育摇床中，200rpm，室温振摇1h，取上清液过0.22μm微孔滤膜后进高效液相测定。
166.高效液相测定条件色谱柱为spursil c
18
色谱柱(150
×
4.6mm，5μm)，流动相为0.1％磷酸溶液-乙腈(15:85，v/v)，流速为1ml/min，采用紫外检测器，检测波长为254nm，柱温为30℃，进样体积为10μl。
167.载药量按照该公式计算：w％＝m
ga
/m
ga@nano-cd-mof
*100，其中m
ga
为测得的ga质量，m
ga@nano-cd-mof
为称取的ga@nano-cd-mof质量。
168.测得ga@nano-cd-mof中甘草次酸与cd-mof的摩尔比为0.64:1，载药量为17.2％(w％＝m
ga
/m
ga@nano-cd-mof
)；而原料药的水溶解度为0.5μg/ml，ga@nano-cd-mof的水溶解度为3.92mg/ml(均按照ga的含量计算)，增加了7840倍。
169.(2)表征
170.采用(sem)扫描电子显微镜对cd-mof和ga@cd-mof的形态进行评价，从图1中可以看出：ga@cd-mof的粒径均一、形态为规则的立方状，几何粒径为0.3-1μm。
171.采用粉末x射线衍射仪(pxrd)对样品的结晶性进行了表征(图2)。ga在6
°
、7
°
、10
°
、14
°‑
16
°
和20
°
处有特征峰；nano-cd-mof在4
°
、6
°
、7
°
、14
°
、16
°
处有特征峰。载药后ga@nano-cd-mof的特征峰与nano-cd-mof一致，而且载药后ga的特征峰基本消失，一定程度上说明，ga被载进了nano-cd-mof的空腔中。
172.图3，ga在307℃有明显的放热峰，nano-cd-mof在251℃和368℃有放热峰，ga@nano-cd-mof的dsc曲线中，nano-cd-mof和ga的特征峰都消失了，一定程度上说明ga载进mof空腔中，改变了mof的性质。ga在307℃有明显的放热峰，而当ga载进mof和γ-cd后，在307℃以后才出现放热峰，说明载药后，ga的热稳定性得到了改善。
173.nano-cd-mof和ga@nano-cd-mof的tga结果(图4)显示，ga在300-400℃迅速失重约60％，368℃有明显的失重趋势，nano-cd-mof在236-300℃失重约33％，236℃开始出现明显的失重趋势，ga@nano-cd-mof的tga曲线同纳米cd-mof相似，说明ga载进了nano-cd-mof空腔中。
174.(3)空气动力学评价
175.将ga@nano-cd-mof过200目筛，填充于hpmc二代胶囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。利用装置在65l/min流速下进行ngi测定(图5)，分别收集装置、适配器、人工喉管、预分离器、撞击器主体的1-7级和微孔收集器(moc)中的样品，测定各级含量，采用软件citdas(copley，英国)计算微细粒子分数(fpf％)，规定5μm以下颗粒为微细粒子，得到ga@nano-cd-mof干粉吸入剂的fpf％为36.44％，表明超过35％的药物粉体能够沉积到肺深部发挥药效；ga@nano-cd-mof的排空率大于98％，表明制备的吸入粉体胶囊排空率较好。
176.(4)体外释放测定
177.精密称取实施例1制备的ga@nano-cd-mof约650mg于500ml经超声脱气后的纯水中，在37℃，70r/min条件下用桨法进行溶出测定。在0.08、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、24、30、48、72、97、120h时分别抽取5ml混悬液，经0.22μm滤膜过滤后分别测定其ga和γ-cd的释放情况。在ga体外释放测定中，如图6所示，ga@nano-cd-mof随时间的延长，药物呈双相释放，以ga计算ga@cd-mof的释放，第一相在0.5h内快速释放超过40％(优选超过50％)，稳定持续至10-16小时；第二相为10-16小时后甘草次酸缓慢释放，约96小时以上达到100％；以γ-cd计算ga@cd-mof的释放，第一相为cd-mof崩解，游离γ-cd的含量达到82％并稳定持续至12小时；第二相为12小时后cd-mof的崩解速度变慢，约120小时达到100％左右。
178.(5)药代动力学
179.健康雄性大鼠24只，体重250
±
50g，分为a、b、c、d四组，每组6只大鼠，a组，静脉注射ga@nano-cd-mof(i.v.ga@nano-cd-mof)；b组，灌胃给18β-甘草次酸原料药混悬液(i.g.ga)；c组，灌胃给ga@nano-cd-mof混悬液组(i.g.ga@nano-cd-mof)，d组，肺部给药实施例1制备的ga@nano-cd-mof干粉吸入剂(inhal.ga@nano-cd-mof)，给药剂量为10mg/kg(以甘草次酸含量计算)，给药后分别于5、10、15、30min和1、2、4、6、8、24h时进行眼眦取血测定甘草次酸血药浓度。采用das 2.0软件对不同给药组实验数据进行药动学参数分析，结果表明cd-mof负载ga后进行体内给药可以显著提高ga在体内的生物利用度，明显改善ga在体内的吸收效果。由不同给药组血药浓度-时间曲线看出(图7)，ga@cd-mof口服及吸入给药均能提高ga在体内的生物利用度，而肺部给药在提高ga生物利用度方面效果更显著。静脉注射ga@cd-mof的auc为15.81
±
4.13μg/ml*h，吸入给药组将ga浓度从2.81
±
1.32μg/ml*h提升到10.47
±
2.06μg/ml*h。同时口服ga@cd-mof和肺部给ga@cd-mof的mrt
(0-t)
均大于静脉注射给药，表明cd-mof负载ga后延长了ga在体内的吸收，减缓了ga在体内的代谢，具有明显的缓释效果。(四组血浆中ga浓度数据见表1)。
180.表1各组药代动结果(n＝6)
[0181][0182]
(6)ga@nano-cd-mof体内吸收曲线
[0183]
为了阐述ga@nano-cd-mof在体内的吸收过程，根据残差法计算出吸入给药以及原料药口服给药后在体内的吸收曲线(图8)，0-8小时两种给药方式均显示出显著的吸收过
程，但是吸入给药吸收量有显著提高。与静脉注射给药相比，ga@nano-cd-mof吸入有明显的缓释过程，同体外释放类似，存在双相吸收过程，首先在5min内能够快速吸收27.7％，然后缓慢吸收，到8小时吸收到42.0％。而原料药口服后，一直在低水平上慢慢吸收，最终仅达到13％。
[0184]
(7)分子模拟解释ga@nano-cd-mof的双相释放行为
[0185]
采用autodock vina 1.1.2对ga在nano-cd-mof的位置进行分子模拟，根据ga与nano-cd-mof的载药摩尔比(ga:cd＝0.7:1)，可以产生20种组合模型，在用能量得分图评估后，获得最有可能的构效关系(图9)，蓝色ga代表在cd-mof的双环糊精对中，结合自由能为-9.3kcal/mol；而绿色ga代表在cd-mof的大空腔中，结合自由能为-7.8kcal/mol，低的结合自由能说明ga更倾向于在外部的双环糊精对中。表面吸附游离的结合自由能为-5.6kcal/mol，远高于-9.3kcal/mol，所以该种假设可以忽略，即表面吸附ga的可能性微乎其微。
[0186]
这也能解释ga的双相释放，ga载到cd-mof中的过程，即将ga微粉化到纳米级，甚至更小。分布在双环糊精对中的ga分子已经处于被环糊精半包合的状态，而进入cd-mof空腔的分子依然是游离状态。所以在水中，cd-mof会崩解成为环糊精，双环糊精对中的ga，在动态平衡反应过程中形成环糊精包合物，溶解在水中。而在大空腔中的这部分ga游离分子，如果没有被快速包裹，自身因为相似相容发生聚集，比表面积增大，加之此时cd已分散在水溶液中，达不到包合条件，所以包合速度减缓，只能凭借ga分子与cd间的偶然相遇、碰撞，才能慢慢包合，溶解在水中。但是，即便ga分子发生团聚，其粒径依然小于未经cd-mof包合处理的原料药，延长作用时间依然会被cd包合而溶解。
[0187]
(8)组织分布实验
[0188]
雄性sd大鼠24只，质量(250
±
50)g。将大鼠随机分为a、b共2组，每组12只。a组，灌胃给ga原料药混悬液组(i.g.ga)；b组，肺部递送ga@nano-cd-mof(inhal.ga@nano-cd-mof)；大鼠的给药剂量为10mg/kg(以ga计)。给药前12h及给药后4h内禁食，自由饮水，给药后10、30min和1、4h腹主动脉放血，取出心、肝、脾、肺和肾，测定ga在各组织中的浓度。如图10所示，灌胃给ga原料药混悬液后，10min后整体的ga沉积不超过0.5ng/mg，且肺部沉积量相较其他器官也不突出；肺部给ga@cd-mof干粉吸入剂后，在肺部有72ng/mg的ga沉积，而其他部位在1.0-1.7ng/mg范围内，92％的ga都沉积在肺部，表明经肺部递送ga能够有效沉积在肺部，且相比灌胃ga原料药混悬液的吸收度显著提升，与图7的结论相对应，实现肺部治疗作用。
[0189]
(9)药效评价
[0190]
健康雄性大鼠36只，体重250
±
50g，每组6只，分为a、b、c、d、e、f共6组。a组(灌胃给予5mg/kg生理盐水14天，空白(blank)组)、b组(使用5mg/kg博来霉素气管内滴注造模后7天后灌胃给予5mg/kg生理盐水14天，模型(model)组)、c组(使用5mg/kg博来霉素气管内滴注造模后7天后灌胃给予200mg/kg阳性对照药吡非尼酮14天，pfd组)、d组(使用5mg/kg博来霉素气管内滴注造模后7天后肺部给予10mg ga@cd-mof 14天，inhal ga@cd-mof组)、e组(使用5mg/kg博来霉素气管内滴注造模后7天后灌胃给予50mg/kg ga@cd-mof 14天，i.g.ga@cd-mof组)、f组(使用5mg/kg博来霉素气管内滴注造模后7天后肺部给予10mg/kg ga 14天，ga组)。麻醉大鼠，腹主动脉取血、取肺组织。计算肺系数(肺湿重/体重
×
100％)，对肺组织进行he、masson染色，羟脯氨酸(hyp)、转化生长因子β1(tgf-β1)、smad3含量测定。
[0191]
结果表明博来霉素可以促进肺细胞smad3和tgf-β1的释放，ga对这一过程有不同程度的抑制作用。ga通过减少胶原沉积、减轻炎症反应和抑制肺成纤维细胞增殖，有效地延缓了肺纤维化的进展。cd-mof载药后ga治疗效果提升，尤其是肺部给药进一步提高了药物治疗效果(图11，肺系数、hyp、tgf-β1、smad3含量结果见表2)。
[0192]
表2各组药效学结果(n＝6)
[0193][0194]
实施例2
[0195]
(1)cd-mof的制备
[0196]
环糊精-金属有机骨架(cd-mof)的制备：分别称取100.0gγ-cd和15.1g醋酸钾溶于100ml纯水中(n
γ-cd
：n
ch3cook
＝1:2)，90℃水浴加热至溶解，加热反应20min，取出室温冷却至溶液约70℃时，加入200ml无水乙醇，搅拌均匀，4000rpm离心3min，弃上清液。再次加入100ml无水乙醇洗涤纯化，搅拌均匀，4000rpm离心3min，弃上清液，将沉淀平铺于铁盘中，60℃烘干至完全干燥，即得，粒径在2～7μm。
[0197]
中性化微米级环糊精-金属有机骨架(micro-cd-mof)的制备：按照n
γ-cd
：n
koh
＝1:8的投料摩尔比进行制备。分别称取64.8gγ-cd和22.4g氢氧化钾溶于2000ml纯水中，超声10min，得到反应母液。向母液中加入1200ml甲醇，溶液体系浑浊，置于60℃水浴加热至澄清，继续加热反应20min，加入12.8g peg 20000，混合均匀。冷水浴静置过夜，使晶体充分析出沉淀。4000rpm离心3min，弃上清液，沉淀用无水乙醇(含4％乙酸)洗涤，超声分散，离心弃去上清，下层沉淀用无水乙醇洗1次。最后用甲醇洗涤至ph 6.5-7.5，于60℃烘箱干燥5h，即得中性化微米koh-cd-mof，粒径在1～5μm。
[0198]
中性化纳米级环糊精-金属机骨架(nano-cd-mof)的制备：按照n
γ-cd
：n
koh
＝1:8的投料摩尔比进行制备，分别称取12.96gγ-cd和4.48g氢氧化钾溶于400ml纯水，超声溶解，使用0.8μm滤膜过滤得到反应母液。量取100ml母液倒入500ml试剂瓶(共4瓶)，向母液中加入60ml甲醇，溶液体系变浑浊，充分震荡，混合均匀，将反应液置于水浴锅加热(60℃)，待沉淀重新全部溶解，体系澄清后再在60℃水浴锅中放置20min，再加入80ml 8mg/ml peg 20000甲醇溶液，溶液体系再次变浑浊，充分震荡，混合均匀。将反应液置于60℃水浴锅加热20min，取出，室温静置2h，使晶体充分析出沉淀，离心，去上清，沉淀用无水乙醇(含4％乙酸)洗涤，超声分散。离心弃去上清，下层沉淀用无水乙醇洗1次，最后用甲醇洗涤至ph 6.5-7.5，于60℃烘箱干燥5h，即得中性化纳米级koh-cd-mof，粒径在0.3～1μm。
[0199]
(2)ga@cd-mof的制备
[0200]
将1.18g ga至10ml西林瓶中，加入10ml乙醇，超声至药物全部溶解。将ga与cd-mof以不同的投料摩尔比加入实施例2制备的cd-mof中。使用磁力搅拌器在水浴中，400rpm下搅
拌不同时间后的混悬液用布氏漏斗抽滤，将滤饼在60℃真空干燥箱中过夜干燥，即得ga@cd-mof。用高效液相色谱法测定ga@cd-mof中甘草次酸与cd-mof的摩尔比，载药量以及ga@cd-mof在水中溶解度。所得ga@cd-mof均为粒径均一、形态为规则的立方晶体，粒径、载药量、载药摩尔比和溶解度见表3。
[0201]
表3不同cd-mof载ga的工艺条件和载药结果
[0202][0203]
实施例3
[0204]
ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的制备：ga@micro-cd-mof填充于hpmc二代胶囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。结果：ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的微细粒子分数(fpf％)为27.79％，证明微米级药物粉体能够有效沉积到肺深部发挥药效，排空率为99.73％，说明吸入粉体胶囊排空率较好。
[0205]
实施例4
[0206]
ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的制备：按照ga@micro-cd-mof与乳糖质量比1：1，分别称取1g ga@micro-cd-mof和1g乳糖(细乳糖lh300(d
50
为0-5μm)：45％粗乳糖sv010(d
50
为95-125μm)为1:9)，以等量递加的方式预混，再将预混粉体加入到v型混合器，40r/min混合15min，继续以相同的转速混合15min，即得乳糖/ga@micro-cd-mof。将所得乳糖/ga@micro-cd-mof填充于hpmc二代胶囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。结果：乳糖/ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的微细粒子分数(fpf％)为29.52％，排空率为99.23％，以此证明增加乳糖量能够使更多的药物粉体能够沉积到肺深部发挥药效。
[0207]
实施例5
[0208]
ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的制备：按照ga@micro-cd-mof与乳糖质量比1：1，分别称取1g ga@micro-cd-mof和1g乳糖(细乳糖lh300(d
50
为0-5μm)：45％粗乳糖sv003(d
50
为53-66μm)为1:9)，以等量递加的方式预混。再将预混粉体加入到v型混合器，40r/min混合15min，继续以相同的转速混合15min，即得乳糖/ga@micro-cd-mof。将所得乳糖/ga@micro-cd-mof填充于hpmc二代胶囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。结果：乳糖/ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的微细粒子分数(fpf％)为30.78％，排空率为99.44％，以此证明增加乳糖量能够使更多的药物粉体能够沉积到肺深部发挥药效。
[0209]
实施例6
[0210]
ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的制备：分别称取1g ga@micro-cd-mof和30mg胆固醇，以等量递加的方式预混，再将预混粉体以40r/min混合15min，继续以相同的转速混合15min，即得胆固醇/ga@micro-cd-mof。将所得胆固醇/ga@micro-cd-mof填充于hpmc二代胶
囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。结果：胆固醇/ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的微细粒子分数(fpf％)为32.54％，排空率为98.79％，证明增加胆固醇量能够使更多的药物粉体能够沉积到肺深部发挥药效。
[0211]
实施例7
[0212]
ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的制备：分别称取1g ga@micro-cd-mof和50mg硬脂酸镁，以等量递加的方式预混。再将预混粉体以40r/min混合15min，继续以相同的转速混合15min，即得硬脂酸镁/ga@micro-cd-mof。将所得硬脂酸镁/ga@micro-cd-mof填充于hpmc二代胶囊中，与单剂量胶囊型吸入给药装置组成最终的干粉吸入剂。结果：硬脂酸镁/ga@micro-cd-mof干粉吸入剂的微细粒子分数(fpf％)为33.40％，排空率为99.30％，证明增加硬脂酸镁量能够使更多的药物粉体能够沉积到肺深部发挥药效。
[0213]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种复合物，其特征在于，所述复合物包含组分(a)甘草次酸；(b)环糊精-金属有机骨架。2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物为甘草次酸双相释放的复合物。3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物具有选自下组的一个或多个特征：(1)所述复合物为晶体，优选立方形晶体；(2)所述复合物的粒径为0.3-10μm，例如0.3、0.5、0.7、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9μm；(3)所述复合物中(a)甘草次酸；(b)环糊精-金属有机骨架的复合方式为甘草次酸进入环糊精-金属有机骨架的空腔中，和/或甘草次酸被环糊精半包合；(4)所述复合物中甘草次酸的载药量(wt％)为5％-30％，优选8％-20％，例如8％、10％、12％、15％、18％；(5)所述复合物在水中(25℃)的溶解度为0.5-5mg/ml，优选为1-4mg/ml，更优选2-4mg/ml；(6)所述复合物在水中(25℃)的溶解度相比原料药提高了3000-10000倍；(7)所述复合物中甘草次酸与环糊精-金属有机骨架的载药摩尔比为0.02-0.8:1，优选0.3-0.8:1，更优选0.5-0.8:1；(8)所述复合物中环糊精-金属有机骨架的粒径为0.3-10μm，例如0.3、0.5、0.7、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9μm。4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精，或其组合，优选γ-环糊精。5.一种如权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述的复合物通过以下方法制备：(s1)提供环糊精-金属有机骨架；(s2)将甘草次酸与环糊精-金属有机骨架混合，在温度t1条件下孵育时间t1得到所述复合物。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(s2)的反应条件具有选自下组的一个或多个特征：(1)所述甘草次酸与环糊精-金属有机骨架的投料摩尔比为1-15:1，优选5-15:1，优选5-10:1；(2)所述孵育温度t1为40-70℃，优选50-60℃；(3)所述孵育在水浴条件下进行；(4)所述孵育时间t1为1-12h，优选1-6h；(5)所述孵育在溶剂存在下进行，所述溶剂选自：甲醇、乙醇，或其组合；(6)所述甘草次酸与溶剂的质量体积比为0.2-0.5mg/ml，优选0.25mg/ml。7.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述的复合物。8.如权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂通过吸入或口服给药，优选为吸入给药。9.一种经口吸入给药装置，其特征在于，所述装置包括吸入装置和权利要求7所述的制剂。

技术总结
本发明提供了一种甘草次酸和环糊精-金属有机骨架形成的复合物，具体地，所述复合物以环糊精金属有机骨架为载体，甘草次酸进入环糊精金属有机骨架的空腔中，形成复合物。该复合物能大幅度提高甘草次酸的溶解性，且具有双相释放特征，能够提高甘草次酸的生物活性，减少给药次数，增加用药顺应性；另外，该复合物能够把甘草次酸有效递送到肺部，用于肺部疾病治疗，为甘草次酸的吸入制剂和口服提供了良好的中间体，制备工艺简单、安全。安全。


技术研发人员：张继稳 王彩芬 周盼盼 刘宇洁 伍丽 郭涛 曹泽颖 任小红 刘憧憬
受保护的技术使用者：中国科学院上海药物研究所
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2023/9/20