一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用

1.本发明涉及丝状真菌生物技术及合成生物学领域，具体涉及一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用。


背景技术：

2.粗壮脉纹孢菌 (neurospora crassa) 与粗糙脉孢菌同属，通常被作为真核微生物的模式菌株，在遗传、发育和细胞生物学等基础研究领域发挥着不可替代的作用。此外，粗壮脉纹孢菌营养要求低，菌丝生长快，在生产纤维素酶和类胡萝卜素上具有显著的生物活性，在发酵工业及天然产物方面具有广泛的应用前景(sylvia, e.b., chun, l., zhengjie, l., hao, w., qin, c., and zichao, m. metabolic engineering of neurospora crassa for increasing carotenoids synthesis. african journal of biotechnology (2022), 21, 156-166.)。类胡萝卜素具有超强的抗氧化能力，兼有抗肿瘤、抗炎症和预防心脑血管疾病作用(sandmann, g. carotenoids and their biosynthesis in fungi.molecules (2022), 27, 1431.)，被认为最具有发展潜力的天然产物之一。然而，丝状真菌具有多细胞的结构特点，与酵母等单细胞真菌相比，其生长发育相对复杂，对丝状真菌进行遗传操作相对困难，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。
3.crispr (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats) 是一种方便灵活的基因组编辑技术。近年，crispr基因编辑技术迅猛发展，目前已经在黑曲霉、嗜热毁丝霉、米曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌等多种丝状真菌中发展了该技术。2015年，matsu-ura等用来源于构巢曲霉(aspergillus nidulans) 的trpc基因 (an0648) 的启动子和终止子来表达cas9基因，同时利用源自酿酒酵母的snr52启动子转录sgrna，通过电击转化将cas9、sgrna重组表达盒和供体dna同时导入宿主细胞，在粗糙脉孢菌中成功编辑基因组，这是较早报道的丝状真菌crispr/cas9基因组编辑技术的研究之一(matsu-ura, t., baek, m., kwon, j., and hong, c. efficient gene editing in neurospora crassa with crispr technology. fungal biol biotechnol(2015), 2, 1-7.)。
4.伴随着大量不同种属丝状真菌基因组测序工作的完成(sharma, k.k. fungal genome sequencing: basic biology to biotechnology. crit. rev. biotechnol(2016), 36, 743-759.)，丝状真菌基因组编辑技术也得到快速发展，极大地促进了以基因组水平遗传改造为核心的真菌合成生物学研究(tong, z., zheng, x., tong, y., shi, y.-c., and sun, j. systems metabolic engineering for citric acid production by aspergillus niger in the post-genomic era.biotechnol biofuels(2019), 18, 1-15.)。虽然matsu-ura等已经在n. crassa中发展了crispr/cas9基因编辑技术，但是其cas9和grna表达元件均由异源启动子指导合成，实际效果仍有待验证。cas9蛋白和sgrna表达盒是crispr/cas9系统的两个必备元件，其中，sgrna的转录水平对cas9的定位与切割效率有着决定作用(jiang, l., li-zhao, g., and jian-ping, x. research progress on guide rna in crispr/cas9 system. biotechnology bulletin(2019), 35, 108-115.)。
获得高效表达的grna启动子是丝状真菌crispr高效编辑的关键，sgrna编码dna的转录由rna聚合酶iii型启动子调控，而可以用来启动sgrna的编码dna转录的这类启动子非常缺乏。因此，挖掘和鉴定高效表达的grna启动子是实现丝状真菌crispr/cas9系统高效编辑基因组的关键因素。本发明针对这一问题，鉴定、克隆、验证了有效的粗壮脉纹孢菌grna编码dna的启动子ncp，并阐述了其在β-胡萝卜素生产提升方面的应用。


技术实现要素：

5.本发明以黑曲霉snrna保守序列为参照，通过序列比对，从粗壮脉纹孢菌基因组中鉴定rna聚合酶iii启动子。采用gibson assembly装配方法，构建rna聚合酶iii启动子表达框。在cirspr/cas9系统中验证启动子的功能。
6.因此，本发明的目的是提供一种粗壮脉纹孢菌中具有调控sgrna编码dna转录的rna聚合酶iii启动子的dna片段、及含有该dna片段的sgrna表达载体，其组成的基于crispr/cas9的基因组编辑系统及其应用。经验证，本发明编辑系统能够显著提高粗壮脉纹孢菌基因组的编辑效率，进而获得遗传性状稳定的基因编辑突变株，显著提高菌株β-胡萝卜素的产量。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明人经过广泛而深入的研究，在粗壮脉纹孢菌中发现一种启动粗壮脉纹孢菌grna表达的启动子，启动子为粗糙脉孢菌属rna聚合酶iii启动子 (命名为ncp)；在后续研究发现该启动子具有转录sgrna的功能，因而本发明提供一种具有调控sgrna编码dna转录的启动子功能的dna片段，其特征在于，含有如seq id no:1所示序列。该dna片段可以作为普通启动子使用，但尤其可用于调控sgrna编码dna转录的表达载体，以进一步促进crispr/cas9系统在粗壮脉纹孢菌基因组编辑中应用。
8.进一步地，所述的启动子功能的dna片段还包括对seq id no:1所示的核苷酸序列进行一个或多个，优选为1至10个中的任何个数的核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与seq id no:1所示的核苷酸序列相同的具有sgrna编码dna的启动子功能的核苷酸序列或其互补序列或者所述的启动子功能的dna片段还包括核苷酸序列与seq id no:1所示序列的同源性≥70%(较佳地≥95%)的具有作为sgrna编码dna的启动子功能的多核苷酸，或5’端截短或添加1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个)的具有作为sgrna编码dna的启动子功能的核苷酸。
9.第二方面，本发明提供一种调控sgrna编码dna转录的重组表达载体，其包括上述的启动子功能的dna片段。进一步地，所述重组载体为游离载体或整合载体；其中，游离载体或整合载体含所述粗壮脉纹孢菌rna聚合酶iii启动子。
10.在一个实施方式中，采用融合pcr的方法将seq id no:1所示序列ncp启动子、靶标位点 (protospacer) 及sgrna骨架连接在一起，采用基因重叠延伸 (soe) 方法构建sgrna表达框。
11.第三方面，本发明还提供上述的具有启动子功能的dna片段，或者上述的调控sgrna编码dna转录的表达载体在crispr/cas系统中的应用，更优选在crispr/cas9系统中的应用。
12.更进一步地，本发明提供一种真核基因组编辑系统，其特征在于，所述系统包括
cas9蛋白的表达载体和上述的调控sgrna编码dna转录的表达载体，优选地，还包括同源供体dna序列。所述的蛋白的表达载体包括cas9蛋白的表达框，其包括ncpgpd1启动子，以及启动子调控的cas9的编码序列。其中，ncpgpd1启动子为n. crassa内源启动子，序列为seq id no:2；cas9编码序列按照n. crassa密码子偏好性进行优化，优化后序列为seq id no:3。
13.第四方面，本发明还提供一种产β-胡萝卜素能力增强的粗壮脉纹孢菌重组菌株，其是通过本发明的基因编辑方法对粗壮脉纹孢菌基因dcc-1进行基因编辑获得基因dcc-1突变的粗壮脉纹孢菌重组菌δdcc-1，突变体工程菌株的β-胡萝卜素合成能力得到了显著提高，从而提高粗壮脉纹孢菌β-胡萝卜素合成能力。
14.本发明所具有的优点：本发明启动子以黑曲霉snrna序列为参照，通过序列比对和克隆分析，从粗壮脉纹孢菌基因组中鉴定到rna聚合酶iii启动子，能够有效启动粗壮脉纹孢菌的grna表达；同时以粗壮脉纹孢菌内源启动子ncpgpd1调控按照粗壮脉纹孢菌氨基酸密码子优化的cas9的表达。元件grna和cas9的表达均由粗壮脉纹孢菌内源启动子调控。上述本发明所得启动子可以应用于粗壮脉纹孢菌crispr/cas9基因编辑系统，指导该系统中grna的表达，将crispr/cas9系统应用于粗壮脉纹孢菌基因编辑，与自身同源重组相比，基因编辑效率显著提高，单基因突变效率达到61.5%。说明本发明所提供的rna启动子启动能力强、grna表达水平高，足以指导cas9蛋白定点切割基因组靶序列。利用本发明中的基因编辑系统对粗壮脉纹孢菌合成β-胡萝卜素过程中有负调控作用的基因dcc-1进行编辑，获得了单基因缺失的突变体工程菌株，突变体工程菌株的β-胡萝卜素合成能力得到了显著提高，从而不仅验证了本发明的rna聚合酶iii型启动子的上述功能，同时更是提供了一种能有效提高粗壮脉纹孢菌β-胡萝卜素合成能力的菌种改造方法。
附图说明
15.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1为本发明提供的粗壮脉纹孢菌中rna聚合酶iii启动子保守序列；+ 1表示转录起始，tata框 (tata-like box)、八聚体基序(octamer element)、staf转录激活因子结合位点(staf binding site)以及近端和远端序列元件 (proximal and distal sequence elements) 用虚线框表示。an，黑曲霉 (aspergillus niger); sc，酿酒酵母 (saccharomyces cerevisiae); nc，粗壮脉纹孢菌 (n. crassa)。
16.图2为本发明提供的经dna folding form预测的粗壮脉纹孢菌ncp启动子序列二级结构。
17.图3为cas9表达载体 (a) 和sgrna表达载体 (b) 示意图。
18.图4为本发明提供的粗壮脉纹孢菌基因编辑菌株 (a) 和egfp为示踪分子的粗壮脉纹孢菌荧光检验图 (b)；表明本发明编辑系统能够成功对粗壮脉纹孢菌基因组进行编辑。
19.图5为本发明提供的添加同源供体dna条件下同源重组修复示意图和靶基因dcc-1突变菌株的pcr鉴定核酸电泳图；其中，a为添加同源供体dna条件下的同源重组修复示意图；b为dcc-1缺失突变株pcr鉴定核酸电泳图。
20.图6为β-胡萝卜素标准曲线。
21.图7为野生型菌株wt和突变株δdcc-1的β-胡萝卜素产量图。
具体实施方式
22.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例对本发明的技术方案来进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
23.其中实施例中用到的菌株及培养条件如下：以粗壮脉纹孢菌菌株w3 (保藏编号：cgmcc no.40045) 为材料。常规培养使用mm固体培养基(葡萄糖20 g/l、1
ꢀ×
vogel’s盐，fungal genetics stock centre)，培养条件为30℃。
24.实施例1、rna聚合酶iii启动子的预测在自然进化中，不同的物种之间u6 snrna的启动子序列差异性较大，但u6 snrna本身的核酸序列存在一定的保守性，因此以黑曲霉u6 snrna序列为参照，应用ncbi blastn程序包中的optimize for somewhat similar sequences程序，在n. crassa基因组中进行核酸序列分析比对，其中identities大于90%，e-value小于1e-10，经过比对发现了1个rna polymerase iii型snrna候选基因 (al389901)。u6 snrna启动子的特点为起始转录位点为“g”，该核苷酸与上游第二“g”之间间隔一定数量的核苷酸 (》30 bp)。经本发明分析和研究，发现了其中一条rna polymerase iii型核snrna的上游启动子序列满足其特点，作为进一步研究的候选启动子。
25.为了研究该候选启动子是否能调控sgrna编码dna的转录，进而应用于基因组编辑。通过对其上游保守结构域进行分析和研究 (图2)，以snrna上游481 bp核苷酸序列作为进一步研究的候选启动子，其序列如seq id no:1所示。通过金唯智 (genewiz，苏州) 基因合成该rna polymerase iii型snrna候选基因上游481bp的dna片段，作为sgrna表达框的候选启动子 (命名为ncp)。
26.实施例2、cas9蛋白表达载体的设计构建将来自酿脓链球菌的cas9蛋白编码基因按照n. crassa的氨基酸密码子偏好性进行密码子优化并人工合成 (核酸序列为seq id no:3，氨基酸序列为seq id no:4)，在其3’端添加3个flag纯化标签，两端融合核定位信号序列nls (pprkraktede)。从粗壮脉纹孢菌基因组扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶gpd-1的启动子 (如seq id no:2所示) 作为cas9蛋白编码基因的转录启动子，以构巢曲霉ttrpc为终止子(如seq id no:5所示)。
27.将上述序列通过pcr扩增，然后用gibson assembly技术体系连接至已线性化的p0380-bar载体上，从而构建了cas9表达框质粒p0380-ncpgpd1-cas9 (如图3所示)。构建cas9蛋白表达载体所需的pcr引物序列如表1所示。
28.pcr反应体系为：2
×
vazyme缓冲液 25 μl，10 mm dntps 1μl，上游/下游引物 (10 mm) 2 μl，模板dna 1 μl，vazyme dna聚合酶 1 μl，ddh2o 19 μl。
29.pcr反应条件为：先95℃ 3 min；然后95℃ 15 s，57℃ 15s，72℃ 1min，34个循环；最后72℃ 5 min，4℃ 10 min。
30.gibson assembly反应体系为：2
×
gibson mix溶液 5 μl，pcr片段混合溶液5 μl。
31.gibson assembly反应条件为：50℃ 30-60 min。
32.实施例3、基因编辑靶序列 (sgrna表达框) 的设计利用sgrnacas9 tool设计目标基因的grna靶标序列。采用融合pcr方法将实施例1中获得的seq id no:1所示序列ncp启动子、靶标位点及sgrna骨架连接在一起，采用基因重叠延伸 (soe) 方法构建sgrna表达框载体。以调控孢子发育及类胡萝卜素合成的基因dcc-1 (development andcarotenogenesiscontrol,ncu00939) 作为靶标，sgrna表达框载体所需引物序列如表1中所示。
33.pcr扩增体系、扩增条件和装配条件与实施例2中记载一致。
34.通过soe-pcr的扩增形成sgrna融合片段，然后用gibson assembly技术体系连接至puc-gw-kan载体上，表达质粒ncp-dcc1-sgrna，其序列为seq id no:6所示。
35.实施例4、同源供体dna载体的设计构建同源供体dna片段分别由目标基因上/下游约1000 bp同源片段，遗传霉素 (g418) 抗性基因表达框ptrpc-neo片段，通过gibson assembly的方法连接到由限制性内切酶paci和noti线性化的质粒pan52中，最终构建供体dna片段donor-dcc1-egfp，其核酸序列如seq id no:7所示。构建供体dna片段其所需的pcr引物序列如表1所示。pcr扩增体系、扩增条件和装配条件与实施例3中一致。
36.表1 本发明所用的pcr扩增引物
。
37.实施例5、粗壮脉纹孢菌转化收集10天左右的受体菌分生孢子，用50 ml预冷的无菌1 m山梨醇 (过滤除菌) 制成孢子悬液。用灭菌的擦镜纸过滤孢子悬液，4℃下2500 rpm 离心5 min去除上清。用20 ml预冷的1 m山梨醇重悬分生孢子，4℃下2500 rpm 离心5 min去除上清。重复此步骤一次。用预冷的1 m山梨醇调整分生孢子浓度至2.5
×
109个/ml。取40 μl孢子悬液至预冷的1.5 ml离心管中，加入2-5 μl线性化质粒 (1-2 μg) ，轻轻混匀，冰上静置5 min。将含有cas9蛋白表达框ncpgpd1-cas9、ncp-dcc1-sgrna和同源供体dna donor-dcc1-egfp以等比例混合后的孢子混合物转移至0.2 cm电击杯 (bio-rad)，擦干杯壁，1.5 kv瞬时电击。立即加入1 ml预冷的1 m山梨醇，用枪头吹打混匀后转移至离心管。在15 ml离心管中将1 ml孢子悬液与10 ml 50℃左右未凝固的固体转化培养基 (含90 mg/l g418) 充分混匀，平铺在转化平板 (含90 mg/l g418) 之上，28℃暗培养4-7天可见转化子。挑取转化子到含有90 mg/l g418的mm斜面，置于28
º
c暗培养2-3天，然后转到光照下室温培养，使其产孢。可用孢子/菌丝提
取基因组进行pcr分子验证。
38.实施例6、粗壮脉纹孢菌基因组提取及转化子验证采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组dna，具体包括以下操作：挑取平板中生长的粗壮脉纹孢菌菌丝于2.0 ml的无菌的dna提取管中，加入锆珠及1 ml的裂解液 (配方：0.2 m tris
·
hcl (ph 7.5)，0.5 m nacl，10 mm edta，1% sds (w/v))，将所有dna提取管置于助磨器上，振荡30 s，重复两次；75℃水浴20 min，在水浴过程中每隔几分钟漩涡振荡；水浴结束后取出，每管加入80 μltris
·
hcl (1 m，ph 7.5) 中和；加入400 μl的酚：氯仿 (1:1)，涡旋充分混匀，静置5 min后13000 rpm离心5分钟；取300 μl上清液于新的1.5 ml ep管中，加入600 μl 95%的乙醇 (dna级)，-20℃沉淀一小时，随后4℃、13000 rpm离心，可看到白色的dna沉淀于ep管底部；然后用75%的酒精 (dna级) 400 μl清洗沉淀，4℃ 13000 rpm离心，轻轻吸出上清液；将ep管置于真空浓缩仪中，除去残留的酒精；加入50 μl ddh2o溶解dna，用nanodrop测dna浓度，-20℃冰箱保存备用。
39.以上述提取的基因组dna为模版，用引物seq-dcc1up-5f (seq id no:32) 和neo-r1 (seq id no:34) 对转化子进行基因pcr验证，验证rna聚合酶iii启动子功能。
40.通过将crispr/cas9体系中ncpgpd1-cas9、ncp-dcc1-sgrna和同源供体dna donor-dcc1-egfp表达框以等比例转化进入粗壮脉纹孢菌中 (图3)，验证所预测的rna聚合酶iii启动子的功能。以基因dcc-1中的靶点序列dt1 (seq id no:8)和dt1 (seq id no:9) 为研究对象，结果发现添加供体dna的情况下，在含有g418的转化筛选平板上出现转化子菌落(图4)。对转化子dcc-1位点进行pcr分子验证，对pcr扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳 (130v电压，30 min)，在凝胶成像系统下可观察到明显基因扩增条带，dcc-1敲除成功突变株pcr扩增条带的大小约为9.8 kb，野生型菌株无条带，结果如图5所示，表明cas9在sgrna介导下对目标靶点进行了切割，供体dna片段与靶标位点两侧序列发生同源重组 (hr) 对位点特异性dsb精确修复，得到基因组编辑突变株。结果显示dcc-1位点由供体dna donor-dcc1-egfp替代，大小约为9.8 kb (图5)，另有egfp示踪的荧光蛋白表达(图4)，这表明所预测的rna聚合酶iii启动子ncp可以成功用于grna的表达。
41.通过上述实验可以确定粗壮脉纹孢菌crispr/cas9系统可以成功编辑基因dcc-1的dt1和dt2靶dna序列，表明本发明编辑系统能够有效应用于粗壮脉纹孢菌基因组编辑，进而获得遗传性状稳定的基因编辑突变株。
42.实施例7、转化子表型分析和生物量的测定将上述验证的转化子接种至常规培养mm固体培养基，30℃暗培养2-3天，然后转到室温培养，白光照明使其产孢。7-10天后收集孢子提取类胡萝卜素。
43.收集的孢子悬液液，4000 rpm离心5 min，弃上清液后，孢子沉淀用水重悬再离心，水洗2次，离心后得湿孢子，-80℃冷冻半小时后置于冷冻干燥机中冻干约16 h，称细胞干重，结果以孢子干重计。
44.实施例8、粗壮脉纹孢菌类胡萝卜素提取和测定冻干后得到的孢子粉中加2ml丙酮和适量锆石珠 (直径0.5mm)，用高速组织研磨仪(servicebio) 研磨2min，室温静置5~10 min，4000 rpm离心5 min，将丙酮萃取的类胡萝卜素上清转移至新的离心管，剩余残渣继续用2 ml丙酮萃取，室温静置5~10 min，4000 rpm
离心5 min收集上清，直至萃取上清的颜色至无色，将收集的萃取上清合并一起，得到类胡萝卜素提取液。将丙酮浸提的类胡萝卜素样品过0.22 μm有机相滤膜后进行hplc检测。
45.hplc检测条件：采用dad检测器，symmetry c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，柱温箱控制在30℃，混合梯度流动性(流动相a和流动相b)，流速为0.8ml/min。流动相a为混合有机溶剂(由乙腈、甲醇和二氯甲烷按照21：21：8的体积比混合而成的液体)，流动相b为体积百分含量10%的甲醇水溶液。将由流动相a和流动相b混合得到的液体作为流动相进行梯度洗脱，条件为：流动相a：体积百分含量80%到100%(0~18 min)，体积百分含量100%(18~40 min)，体积百分含量100%到80%(40~45 min)，体积百分含量80%(45~50 min)；流动相b：体积百分含量20%到0%(0~18 min)，体积百分含量0%(18~40 min),，体积百分含量0%到20%(40~45 min)，体积百分含量20%(45~50 min)。
46.每个样品进样量为20μl，检测时间为50min，检测波长为476nm，β-胡萝卜素出峰时间是39.8 min。
47.所有类胡萝卜素中，只有β-胡萝卜素进行了绝对定量，其他类胡萝卜素用峰面积表示。β-胡萝卜素标准品购自aladdin公司(c110501) ,准确称量一定量的β-胡萝卜素标准品，用流动相a溶解后，稀释不同倍数，用上述方法在高效液相色谱测定不同浓度标准品的峰面积，根据标准品浓度和峰面积绘制标准曲线如图6所示。
48.β-胡萝卜素含量将待测菌丙酮萃取样品经hplc测定的峰面积代入标准曲线中，得到待测菌β-胡萝卜素含量(mg/l，具体为萃取样品中β-胡萝卜素含量)。
49.β-胡萝卜素产率(mg/g)＝β-胡萝卜素含量(mg/l)/细胞干重(g/l )通过crispr/cas9系统对粗壮脉纹孢菌类胡萝卜素合成负调控基因dcc-1进行敲除编辑后，能显著促进类胡萝卜素的生产，收集第7天孢子的β-胡萝卜素产量为361.83μg/g dcw，与对照宿主菌株wt (225.88μg/g dcw) 相比提高至1.6倍 (图7)。说明本发明的crispr/cas9能显著提高粗壮脉纹孢菌遗传改造效率，促进宿主细胞目标产量的提高。

技术特征：
1.一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子，其特征在于：启动子为粗壮脉纹孢菌属rna聚合酶iii启动子；其核苷酸序列如seq id no:1所示。2.一种含有权利要求1所述启动子的重组表达载体。3.一种如权利要求1所述的启动子在启动rna表达中的应用，其特征在于，利用如权利要求1所述的启动子在启动cirspr基因编辑系统中grna的表达、启动snrna的表达或启动rna聚合酶iii转录产物的表达中的应用。4.一种真核基因组编辑系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求1所述的启动子调控的sgrna编码dna转录的表达载体和cas9蛋白的表达载体。5.如权利要求4所述的真核基因组编辑系统，其特征在于，所述的cas9蛋白的表达载体包括cas9蛋白的表达框，其包括ncpgpd1启动子，以及启动子调控的cas9的编码序列。6.如权利要求5所述的真核基因组编辑系统，其特征在于，所述ncpgpd1启动子的核苷酸序列为seq id no:2；cas9蛋白的编码核苷酸序列为seq id no:3。7.一种重组宿主细胞，包含有如权利要求1所述的启动子，或如权利要求2所述的重组表达载体，或如权利要求4至6任一项所述的真核基因组编辑系统。8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为丝状真菌细胞。9.如权利要求8所述的重组宿主细胞，其特征在于，其为粗壮脉纹孢菌细胞。10.一种基于crispr/cas系统对丝状真菌基因组的基因编辑方法，其特征在于，将如权利要求1所述的启动子调控的sgrna编码dna转录的表达载体、cas9蛋白的表达载体、以及同源供体dna序列共转化进入丝状真菌的感受态细胞。11.一种产β-胡萝卜素的粗壮脉纹孢菌重组菌，其特征在于，其是通过如权利要求4至6任一项所述的真核基因组编辑系统或如权利要求10所述的基因编辑方法敲除粗壮脉纹孢菌调控孢子发育及类胡萝卜素合成的负调控基因dcc-1。12.一种β-胡萝卜素的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（a）培养如权利要求11所述的粗壮脉纹孢菌重组菌；（b）收集类胡萝卜素。

技术总结
本发明涉及丝状真菌生物技术及合成生物学领域，具体涉及一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用。启动子为粗糙脉孢霉属RNA聚合酶III启动子；启动子为SEQ ID NO:1，或与上述各序列具有70%同源性、且具有启动子活性的DNA核苷酸序列。本发明公开的启动子应用于粗壮脉纹孢菌CIRSPR/Cas9系统，指导该系统中gRNA的表达，能够更有效地对粗壮脉纹孢菌进行编辑改造，如通过对孢子发育及类胡萝卜素负调控基因dcc-1进行敲除，显著提高粗壮脉纹孢菌β-胡萝卜素的生产水平，具有较大的推广应用价值。具有较大的推广应用价值。具有较大的推广应用价值。


技术研发人员：吴信 李晓林
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：2023.08.16
技术公布日：2023/9/19