应用数字PCR检测多价疫苗各组分RNA比例的方法与流程

应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法
技术领域
1.本发明涉及多价疫苗中各组分rna比例检测技术领域，尤其涉及一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法。


背景技术：

2.微滴式数字 pcr (droplet digital pcr，ddpcr)是近几年发展起来的第三代pcr技术，是一种核酸分子绝对定量技术。其中应用最广泛的是微滴式数字pcr( ddpcr )，其方法是通过油包水（反应液）将反应液分为数万个独立的纳米级微滴，在每个微滴完成pcr反应，完成后通过微滴读取仪对逐个微滴进行检测记录，软件自动读取统计带荧光（阳性，蓝色）与未带荧光（阴性，黑色）微滴个数与比例，并自动计算出拷贝数，从而实现对核酸的绝对定量，检测灵敏度提高到单分子水平。目前，微滴式数字pcr平台中的逆转录微滴式聚合酶链式反应（reverse transcriptase droplet digitalpolymerase chain reaction，rt-ddpcr）无需单独进行逆转录反应，可直接对rna进行定量。
3.近年来随着分子生物学、免疫学等相关学科的飞速发展，新的疫苗不断被开发研制成功并推广上市，疫苗的种类大大增加。2001年美国推荐的免疫程序中，6个月至6岁的儿童，至少需要注射19种疫苗，这给接种者及疫苗的管理带来诸多不便。为了减少接种次数和预防更多疾病，迫切需要研究开发联合疫苗。联合免疫是指将两种或两种以上抗原采用联合免疫、结合疫苗、混合使用或同次使用等方式进行免疫接种，是通过一次接种预防多种或不同血清型的同种或不同生活周期传染病的一种免疫手段。联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗。多价疫苗是预防不同亚型或血清型的同一种疾病，即多价（multivalent）联合疫苗，其中包含的血清型在疫苗研发时就联合在一起，在疫苗制备过程中不予以分离。
4.《中国药典》为我国生物制品和疫苗质量检验的法定标准。标准中关于多联疫苗和多价疫苗的检验的技术主要包括动物实验法和酶联免疫法（elisa）检测效价。
5.新冠病毒后，随着分子生物技术的迅速发展，mrna技术逐渐应用到疫苗中，传统的检验方法逐渐不能满足当前的检定需要，且传统的检验方法对检验者的技术水平、实践能力、从业技术都有很高要求，需要具备丰富的经验和敏锐的判别能力，由于检验者的水平参差不一，检验的重复性和结论的一致性不高，误判情况时有发生。国家标准收录的鉴定方法并不能满足疫苗检定的需要，因此必须借鉴现代科学技术及检测设备，根据市场中的疫苗品种，有目的、有针对性的构建专属性量化检测检验方法。


技术实现要素：

6.本发明提供一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，以克服上述问题。
7.为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，包括以下步骤：s1：提取新冠多价mrna疫苗样品中的总rna；
s2：以步骤s1的总rna为模板，分别加入新冠病毒的三种基因的上游引物、下游引物及探针来建立数字pcr体系；所述新冠病毒的三种基因分别为：delta、ba.2.12.1以及ba.4/5；步骤s2中所述的三种基因的上游引物、下游引物及探针：所述delta的上游引物序列如seq no:1所示，下游引物序列如seq no:2所示，探针序列如seqno:3所示；所述ba.2.12.1的上游引物序列如seq no:4所示，下游引物序列如seq no:5所示，探针序列如seqno:6所示；所述ba.4/5的上游引物序列如seq no:7所示，下游引物序列如seq no:8所示，探针序列如seqno:9所示；s3：制备微滴：将建立好的数字pcr反应体系加入至微滴生成板中与微滴生成油生成微滴，并封膜；s4：进行数字pcr扩增；s5：通过经数字pcr扩增得出的新冠多价mrna疫苗样品中上述三种基因的rna拷贝数浓度，并计算得出新冠多价mrna疫苗中delta、ba.2.12.1以及ba.4/5的rna比例。
8.优选地，所述数字pcr体系的总体积为22μl，在所述数字pcr体系中，所述上游引物的终浓度为10μm，所述下游引物的终浓度为10μm，所述探针的终浓度为10μm，所述rna模板的终浓度为5*10-6
ng/μl。
9.优选地，所述数字pcr扩增的程序包括：逆转录42
°
c 60min，95
°
c10min灭活逆转录酶；95
°
c 0.5min，58
°
c 1min，共50个循环；98
°
c10min，每步升降温速度为2
°
c/s。
10.本发明根据新冠病毒delta基因、ba.2.12.1基因及ba.4/5基因的核壳蛋白（nucleoprotein）n基因区域，设计出相应的引物和探针，同时验证本方法的特异性以及重复性。通过试验发现本数字pcr法的最适退火温度为：58℃，最优的引物浓度及探针浓度分别为10μm和10μm；同时采用数字pcr同时检测浓度为浓度10-3
μg/ml、浓度10-4
μg/ml以及浓度10-5
μg/ml的3份样本，每个浓度重复3次，每隔1周进行一次实验，重复三次，得出批内重复性试验及批间重复性试验变异系数均小于5%，可见本方法具有良好的重复性，可用于新冠mrna疫苗的快速检测和定量分析。
11.优选地，步骤s3中，封膜温度为180℃-220℃，时间为5s-15s。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，根据新冠病毒的核壳蛋白n基因区域设计引物和探针，并对反应条件和反应程序的优化，同时通过特异性和重复性试验对本发明所建立数字pcr方法进行评估，从而建立了应用数字pcr检测多价新冠mrna疫苗各组分rna比例的方法，本发明所建立的多价疫苗数字pcr方法特异性好且重复性好，本方法易于操作，且无需标准品即可快速、准确实现多价疫苗各组分rna比例的检测，同时也为多价疫苗各组分的定量检测提供了新的手段。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发
明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的反应孔和ntc孔生成微滴总数量显示图；图2为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的delta基因的实验结果与板布局图；图3为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的delta基因的油滴分布图；图4为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的ba.2.12.1基因的实验结果与板布局图；图5为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的ba.2.12.1基因的油滴分布图；图6为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的ba.4/5基因的实验结果与板布局图；图7为本发明实施例中公开的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的ba.4/5基因的油滴分布图。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.本实施例提供的一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法的建立及应用效果验证：1、材料方法1.1、疫苗：为市售新冠mrna疫苗，其规格为0.5ml:15μg（30μg/ml）；1.2、主要仪器、试剂及耗材：本发明所选用的仪器包括：伯乐微滴自动生成仪（qx200)，伯乐微滴自动读取仪（qx200)，伯乐pcr仪（t100)，伯乐pcr热封仪（px1)；所选用的实验试剂及耗材包括：聚乙二醇辛基苯基（西格玛282103），一步法微滴数字pcr试剂盒（伯乐1864021），热封膜（伯乐1814040），ddpcr 96孔板（伯乐12001925），dg32 自动化微滴生成卡（伯乐 1864108），系统废弃枪头盒（伯乐1864125），ddpcr枪头盒（伯乐1864120），探针法自动化微滴发生油（伯乐1864110），ddpcr微滴读取油（伯乐1863004）；1.3、引物探针设计及合成：从ncbi网站获得新型冠状病毒covid-19的delta基因、ba.2.12.1基因及ba.4/5基因的核壳蛋白（nucleoprotein）n基因区域，应用primer express软件分别对covid-19的delta基因、ba.2.12.1基因及ba.4/5基因的核心序列进行探针引物设计，所述引物及探针
如下所示：上游引物（delta）:5'-acctggattctcttcttggtggcgatct-3'（seq id no：1），下游引物（delta）:5'-tctagcgccgaaagggcacagattgt-3'（seq id no：2），探针（delta）:5'
‑ꢀ
fam-cacgcgagtccactccagagtgc-3' dbq1（seqid no：3，5'为荧光报告基团，3'端为淬灭基团）；上游引物（ba.2.12.1）:5'-agcttcaccaacgtgtacgcggatct-3'（seq id no：4）；下游引物（ba.2.12.1）:5'-tctagcggtgaagtcatcgggcaga-3'（seq id no：5）；探针（ba.2.12.1）:5'
ꢀ‑
vic-ctggctcacctcgttgccgcgg-3' dbq1（seqid no：6）；上游引物（ba.4/5）:5'-tcgtgtacgccgacagctt cgatca-3'（seq id no：7）；下游引物（ba.4/5）:5'-actaggtgaagtcatcgggcagcttgt-3'（seq id no：8）；探针（ba.4/5）:5'
ꢀ‑
fam-cccagattgcccccggccag-3' dbq1（seqid no：9）；引物及探针均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1.4、新冠mrna疫苗样品rna的提取并稀释：称量2.0g聚乙二醇辛基苯基醚（triton x-100），加入50ml超纯去离子水，搅拌2小时，2~8℃储存，有效期7天；将新冠mrna疫苗样品从预充针中打出至一个pcr管中，新冠mrna疫苗的规格为0.5ml:15μg（30μg/ml），然后取出29.2μl的疫苗样品至另一pcr管中，向其中加入4.4μl的4%聚乙二醇辛基苯基醚以及10.2μl的超纯去离子水，震荡并离心，使样品裂解，获得初始浓度为20μg/ml的rna模板；实际配制步骤可以根据实际用量对上述进行等比例放大或缩小；取6支干净的0.2 ml薄壁pcr管，分别标记为
①
，
②
，
③
，
④
，按下表依次进行梯度稀释，获得浓度为5
×
10-4
ng/μl的rna模板；名称稀释rna稀释浓度(μg/ml)rna初始浓度na20
①
10μl初始浓度+190μl超纯去离子水1
②
10μl
①
+90μl超纯去离子水10-1
③
10μl
②
+90μl超纯去离子水10-2
④
10μl
③
+90μl超纯去离子水10-3
1.5、对引物和探针分别进行稀释：根据不同基因样品管上的标识，使用超纯去离子水分别进行引物及探针的稀释，使引物终浓度为10μm，探针终浓度为10μm，分装并置于-20℃储存；1.6、方法的建立1.6.1、制备pcr反应体系：将一步法微滴数字pcr试剂盒的各组分：dna聚合酶，反转录酶，300mm二硫苏糖醇（dtt）以及引物、探针放置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，短时间快速离心5s；取3支1.5ml ep管，分别标记为delta mix、ba.2.12.1mix、ba.4/5 mix，置于冰盒上。根据ddpcr反应要求，配置n（样品复孔数+ntc孔数）
×
1.3个孔的反应液；delta反应体系配置如下表：组分单孔加入量（μl）dna聚合酶5
反转录酶2300mm二硫苏糖醇（dtt）110μm上游引物（delta）0.610μm下游引物（delta）0.610μm探针（delta）0.5超纯去离子水8.3ba.2.12.1反应体系配置如下表：组分单孔加入量（μl）dna聚合酶5反转录酶2300mm二硫苏糖醇（dtt）110μm上游引物（ba.2.12.1）0.610μm下游引物（ba.2.12.1）0.610μm探针（ba.2.12.1）0.5超纯去离子水8.3ba.4/5反应体系配置如下表：组分单孔加入量（μl）dna聚合酶5反转录酶2300mm二硫苏糖醇（dtt）110μm上游引物（ba.4/5）0.610μm下游引物（ba.4/5）0.610μm探针（ba.4/5）0.5超纯去离子水8.3配制完成后，震荡混匀15s，离心去除气泡；将ddpcr 96孔板置于冰盒上，根据仪器出厂说明书要求反应体积至少22
µ
l，因此原20ul反应体系增加10%的加入量，即每个反应孔分别倒吸加入19.8
µ
l上述配置的反应体系，再加入2.2
µ
l浓度已稀释至5
×
10-4
ng/μl的rna模板，ntc孔中只加入2.2
µ
l超纯去离子水；1.6.2、制备微滴：1.6.2.1、准备阶段：热封仪使用前需提前10min打开，预热至180℃；将加好反应体系的96孔板置于热封仪上的96孔板固定器上，将热封膜有红线标记的一面朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的热封仪对其进行封膜，运行程序为：热封温度180℃，热封时间5s；通过是否能够轻易揭开封板膜来确认各样品孔是否密封好，将封好的96孔板充分震荡混匀15s，高速离心机200g条件下离心30s~1min，观察反应液无气泡，准备进行反应微滴的制备；1.6.2.2、微滴制备阶段：提前插上微滴生成仪电源，仪器自检后，界面显示oil type，触屏选择probe微滴生成油；轻轻上拉打开仪器的门，将微滴生成卡，吸头废物箱，去除盖子的吸头盒，密封好的
ddpcr 96孔板以及放在冰盒上接收微滴的96孔板依次放入微滴生成仪指定位置，放置完成后底部会亮起绿灯，并且触屏界面会显示绿色的ready；注意微滴生成仪所在房间温度不宜过低，最好在25
°
c左右；点击configure，选中加样的列数，点击ok，点击start，再点击start run；微滴生成仪自动吸取20
µ
l样品反应体系，加入70
µ
l微滴生成油，混合后吸取40
µ
l混合物至dg32微滴生成卡中；微滴生成结束后，触摸屏上会显示droplets ready。轻轻上拉打开仪器的门，取出生成微滴的96孔板。微滴生成后，要轻拿轻放，不可摇晃或颠倒；将已生成微滴的96孔板再次置于热封仪上封膜。此次封膜后不可离心，轻轻放至pcr仪内进行扩增；1.6.3、进行数字pcr扩增：按照下表设置pcr程序，热盖温度选择105℃，pcr体积选择40
ꢀµ
l；每步升降温速度为2 ℃/s；读取拷贝数：提前打开微滴读取仪预热30min；将完成pcr扩增的96孔板放入plate holder压板固定器中，盖好顶部支架，之后轻轻平稳的放入微滴读取仪中，并通过quantasoft软件读取结果；为保证实验的结果可靠性，对系统适用性有一定的要求：反应孔微滴生成总数量＞10000；ntc孔中拷贝数浓度＜400 copies/20μl；样品复孔cv值≤20%；1.6.4、结果计算：通过经数字pcr扩增得出的新冠mrna疫苗三种基因的rna拷贝数浓度，计算得出新冠mrna疫苗三种基因的rna比例：结果：检测样品拷贝数浓度计算公式为：结果取均值；。
17.实施例1退火温度优化：使用步骤1.3中合成的delta、ba.2.12.1及ba.4/5的引物、探针，以步骤1.4提取的新冠多价mrna疫苗样品rna为模板，按照步骤1.6所建立的方法对新冠mrna疫苗样品进行检
测，退火温度分别设置为50℃、54℃、58℃、62℃、66℃、70℃，引物浓度为10μm，探针浓度为10μm，重复3次，取平均值汇总各温度下的微滴数据，结果显示58℃为最优退火温度，如下表1所示；表1退火温度优化结果。退火温度（℃）505458626670绝对定量值310318328325309305
18.实施例2扩增引物浓度优化：采用与实施例1相同的引物、探针序列以及rna模板，按照步骤1.6所建立的方法对新冠多价mrna疫苗样品进行检测，其中引物浓度分别设置为1μm，10μm，20μm，退火温度取实施例1中优化的最佳值58℃，探针浓度为20μm，实验重复三次，根据表2对比筛选出最佳浓度为10μm；表2引物浓度优化结果。引物浓度（μm）11020绝对定量值0312310
19.实施例3探针浓度优化：采用与实施例1相同的引物、探针序列以及rna模板，按照步骤1.6所建立的方法对新冠多价mrna疫苗样品进行检测，探针浓度分别为1μm，10μm，20μm，引物浓度取实施例2中优化的最佳值10μm，退火温度取实施例1中优化的最佳值58℃，实验重复三次，根据表3，对比筛选出探针的最佳浓度为10μm；表3探针浓度优化结果。探针浓度（μm）11020绝对定量值0312310
20.实施例4特异性验证：用建立的ddpcr方法分别对新冠多价mrna疫苗，狂犬疫苗、百白破疫苗进行检测，结果如表4所示，本方法新冠多价mrna疫苗三种基因有扩增，对其他均疫苗无扩增，表明本方法特异性较好；表4特异性验证结果。疫苗种类新冠mrna疫苗狂犬疫苗百白破疫苗绝对定量值31000
21.实施例5重复性验证：以不同浓度的rna作为模板，每个浓度重复三次，进行扩增，进行批内的重复试验；表5批内重复性验证结果浓度（μg/ml)浓度103浓度104浓度105绝对定量值320318531587绝对定量值318320431985
绝对定量值324319931885平均值320.6666667319631819标准偏差3.0550504639.848857802207.0458886变异系数0.95271844%0.308162009%0.650698918%以与上述浓度一致的rna作为模板，每个浓度重复三次，每隔1个星期进行一次实验，共重复三次，进行批间的重复试验，记录并统计结果，结果如表6所示；表6批间重复性验证结果时间（周）第一周第二周第三周绝对定量值320322322绝对定量值318313320绝对定量值324318320平均值320.6666667317.6666667320.6666667标准偏差3.0550504634.5092497531.154700538变异系数0.95271844%1.419491003%0.360093723%由表6结果可知：批内重复性试验变异系数（cv）在0.95%、1.42%、0.36%，批间重复性试验变异系数（cv）在0.95%、0.31%、0.65%，ct值的变异系数均小于5%，由此证明所建立的ddpcr方法具有良好的重复性。
22.实施例6：采用建立的ddpcr方法检测新冠mrna三种基因rna的比例，结果为：如图1所示为delta基因反应孔、ba.2.12.1基因反应孔、ba.4/5基因反应孔及ntc孔生成微滴总数量显示图，图1中c10、d10、d11为第一种变异株（delta基因）反应孔油滴总数结果，e10、f10、f11为第二种变异株（ba.2.12.1基因）反应孔油滴总数结果，g10、h10、h11为第三种变异株（ba.4/5基因）反应孔油滴总数结果；图2为delta基因的实验结果与板布局图，图3为delta基因的油滴分布图；图4为ba.2.12.1基因的实验结果与板布局图，图5为ba.2.12.1基因的油滴分布图；图6为ba.4/5基因的实验结果与板布局图，图7为ba.4/5基因的油滴分布图；从图2所示中，可得出delta的rna拷贝数浓度的平均值为：（380+373）/2=376.5（copies/μl）；从图4所示中，可得出ba2.12.1的rna拷贝数浓度的平均值为：（316+304）/2=310（copies/μl）；从图6所示中，可得出ba.4/5的rna拷贝数浓度的平均值为：（814+799）/2=806.5（copies/μl）；因此总rna拷贝数浓度为：376.5+310+806.5=1493（copies/μl）；delta占比（%）=（376.5/1493）*100%=25%；ba2.12.1占比（%）=（310/1493）*100%=21%；ba.4/5占比（%）=（806.5/1493）*100%=54%。
23.因此，本方法的最优退火温度为58℃，引物最佳浓度为10μm，探针的最佳浓度为10μm，经特异性验证及重复性验证可知本发明所建立的ddpcr方法的特异性较好，且具有良好
的重复性。
24.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：提取新冠多价mrna疫苗样品中的总rna；s2：以步骤s1的总rna为模板，分别加入新冠病毒的三种基因的上游引物、下游引物及探针来建立数字pcr体系；所述新冠病毒的三种基因分别为：delta、ba.2.12.1以及ba.4/5；步骤s2中所述的三种基因的上游引物、下游引物及探针：所述delta的上游引物序列如seq no:1所示，下游引物序列如seq no:2所示，探针序列如seq no:3所示；所述ba.2.12.1的上游引物序列如seq no:4所示，下游引物序列如seq no:5所示，探针序列如seq no:6所示；所述ba.4/5的上游引物序列如seq no:7所示，下游引物序列如seq no:8所示，探针序列如seq no:9所示；s3：制备微滴：将建立好的数字pcr反应体系加入至微滴生成板中与微滴生成油生成微滴，并封膜；s4：进行数字pcr扩增；s5：通过经数字pcr扩增得出的新冠多价mrna疫苗样品中上述三种基因的rna拷贝数浓度，并计算得出新冠多价mrna疫苗样品中delta、ba.2.12.1以及ba.4/5的rna比例。2.根据权利要求1所述的应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，其特征在于，所述数字pcr体系的总体积为20-25μl，在所述数字pcr体系中，所述上游引物的终浓度为10μm-20μm，所述下游引物的终浓度为10μm-20μm，所述探针的终浓度为10μm-20μm，所述rna模板的终浓度为1*10-6 ng/μl-10*10-6 ng/μl。3.根据权利要求1所述的应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，其特征在于，所述数字pcr体系的总体积为22μl，在所述数字pcr体系中，所述上游引物的终浓度为10μm，所述下游引物的终浓度为10μm，所述探针的终浓度为10μm，所述rna模板的终浓度为5*10-6 ng/μl。4.根据权利要求1所述的应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，其特征在于，所述数字pcr扩增的程序包括：42
°
c 60min，95
°
c10min；95
°
c 0.5min，58
°
c 1min，共50个循环；98
°
c10min，每步升降温速度为2
°
c/s。5.根据权利要求1所述的应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法，其特征在于，步骤s3中，封膜温度为180℃-220℃，时间为5s-15s。

技术总结
本发明涉及多价疫苗中各组分RNA比例检测技术领域，本发明公开了一种应用数字PCR检测多价疫苗各组分RNA比例的方法，包括步骤：提取新冠多价mRNA疫苗样品中的总RNA；以总RNA为模板，以新冠病毒上下游引物及探针建立数字PCR体系；制备微滴；进行数字PCR扩增；计算得出新冠多价mRNA疫苗中各组分RNA比例。根据新冠病毒的核壳蛋白N基因区域设计引物和探针，对反应条件和反应程序优化，通过特异性和重复性试验对所建立数字PCR方法进行评估，建立了应用数字PCR检测多价新冠mRNA疫苗各组分RNA比例的方法，本发明所建立的检测方法特异性好且重复性好，易于操作，且无需标准品即可快速、准确实现多价疫苗各组分RNA比例的检测，为多价疫苗各组分的定量检测提供了新手段。苗各组分的定量检测提供了新手段。苗各组分的定量检测提供了新手段。


技术研发人员：徐鹤 李搏远 吕欣 孙佳玲 苏喆 赵海峰 申玉华 房绍鹏 王雪 周迪 康馨元 韩晓红 邹墅 李心欣 胡雪凇 王雪寒 迟惠 程琪越 王璐 高雅松 罗晓梅 宋雪
受保护的技术使用者：吉林省药品监督管理局 天津市药品检验研究院
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/19