一种长形赖氨酸芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种长形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.香草兰（vanilla planifolia andrews）是兰科热带藤本香料植物，享有“天然食品香料之王”誉称。其鲜豆荚经过生香加工后含有250多种芳香成分，香气独特，被广泛用于调制各种高级香烟、名酒、茶叶，是各类高档食品和饮料的配香原料，在国际市场上供不应求。香草兰还是中药材，具健胃、补肾、改善脑功能等功效，已被纳入欧美国家药典。
3.香草兰鲜豆荚成熟采摘后无香气，需经杀青、发酵（酶促或发汗）、干燥、陈化等6个月的发酵生香才能产生香气。香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是香草兰豆荚中主要呈香物质，是反映豆荚品质的重要指标。天然香兰素香味柔和、安全性高，人工合成香料无法替代。随着人们生活水平的提高，对天然香兰素的需求越来越大。国际上原有研究认为，香兰素是由豆荚内源葡萄糖苷酶转化香兰素葡萄糖苷生成。但在杀青24h后内源酶失活，香兰素葡萄糖苷水解成为香兰素的反应依然存在，不能完全解释香兰素随着发酵的进行直至最后阶段还在不断增加的事实。香兰素产量除受豆荚内源糖苷酶影响以外，豆荚表面微生物是否释放相应的水解酶将糖苷态香兰素转化为游离态香兰素，增加发酵豆荚香兰素含量，提升豆荚品质？本团队前期研究表明：定殖在豆荚表面的芽孢杆菌可产生β-d-葡萄糖苷酶，水解香兰素葡萄糖苷，提出了“内源葡萄糖苷酶与关键功能微生物所产酶系共同影响豆荚品质”的分段联合作用机理。
4.香草兰成熟鲜豆荚香兰素葡萄糖苷含量高达10%以上，但经前期研发的微生物辅助单元式热空气发酵生香方法所得豆荚香兰素含量最高仅达3.58%，香兰素含量仍有较大的提升空间。如何进一步提升香草兰发酵豆荚中主要呈香物质香兰素含量，是当前包括我国在内的全球香草兰产业中亟待解决的重要瓶颈问题，也是当前国际研究的前沿热点问题。通过微生物辅助发酵生香，进一步提高天然香兰素的产量具有重要的经济意义，也为发展我国热区特色产业和富民产业提供技术支撑，同时，为提升中国香草兰在国际上的知名度奠定技术基础。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供一种长形赖氨酸芽孢杆菌，进一步将香草兰发酵豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为游离态香兰素，提升发酵豆荚品质。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种长形赖氨酸芽孢杆菌，所述长形赖氨酸芽孢杆菌（lysinibacillus macroides）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.27164，保藏日期为2023年4月20日。本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌（lysinibacillus macroides）是从香草兰发酵豆荚中分离得到的菌株，命名为m3，可稳定高产β-d-葡萄糖苷酶，在以麸皮、牛肉浸膏为碳氮源，ph为7.0，28℃培养48h条件下，β-d-葡
萄糖苷酶活力可达0.0016u/ml。
7.进一步的，所述长形赖氨酸芽孢杆菌经16s rdna序列测序得序列如seq id no.1所示。
8.一种上述长形赖氨酸芽孢杆菌的应用，所述长形赖氨酸芽孢杆菌用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。
9.一种微生物制品，由上述的长形赖氨酸芽孢杆菌发酵获得。
10.一种上述微生物制品的制备方法，包括以下步骤：将上述的长形赖氨酸芽孢杆菌接种于ph值为5-8的液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心所得。
11.进一步的，所述液体培养基的碳源为淀粉、麸皮、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、微晶纤维素中的一种或几种的混合物；所述液体培养基的氮源为硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、牛肉浸膏中的一种或几种的混合物。
12.进一步的，所述液体培养基的碳源为麸皮，所述液体培养基的氮源为牛肉浸膏。
13.进一步的，所述培养条件为温度25-40℃，培养基ph为5-8，培养时间为24h-72h。
14.进一步的，所述培养条件为培养温度28℃，培养基ph为7，培养时间48h。
15.一种上述微生物制品的应用，所述微生物制品用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。
16.本发明的一种长形赖氨酸芽孢杆菌及其应用的有益效果为：本发明获得的长形赖氨酸菌可产β-d-葡萄糖苷酶，可将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素，提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素含量，可应用于提升香草兰发酵豆荚品质。
附图说明
17.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
18.图1是本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌菌株（m3）在七叶苷和柠檬酸高铁氨培养基上产生黑色水解圈示意图。
具体实施方式
19.下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
20.一种长形赖氨酸芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27164，保藏日期为2023年4月20日。所述长形赖氨酸芽孢杆菌经16s rdna序列测序得序列如seq id no.1所示。
21.上述长形赖氨酸芽孢杆菌的应用，所述长形赖氨酸芽孢杆菌用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。
22.一种微生物制品，由上述的长形赖氨酸芽孢杆菌发酵获得；微生物制品的制备方
法，包括以下步骤：将上述的长形赖氨酸芽孢杆菌接种于ph值为5-8的液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心所得。所述液体培养基的碳源为淀粉、麸皮、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、微晶纤维素中的一种或几种的混合物；所述液体培养基的氮源为硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、牛肉浸膏中的一种或几种的混合物。优选的，所述液体培养基的碳源为麸皮，所述液体培养基的氮源为牛肉浸膏。所述培养条件为温度25-40℃，培养基ph为5-8，培养时间为24h-72h。优选的，所述培养条件为培养温度28℃，培养基ph为7，培养时间48h。
23.上述微生物制品的应用，所述微生物制品用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。
24.实施例1：本发明所述菌株的分离筛选和鉴定称取发酵后的成品香草兰豆荚5g，用无菌刀片切成小段（0.2cm-0.5cm）。置于45ml无菌水中，180 r/min震荡1h，静置20min。上清液梯度稀释，取10-4
、10-5
、10-6
稀释液，分别吸取100μl，涂布至七叶苷和柠檬酸高铁氨培养基（10g nacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，1g七叶苷，2.5g柠檬酸高铁氨，1000ml蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min），28℃倒置培养3d。挑取平板上产生黑色水解圈的菌落，纯化培养。最终，筛选出可稳定产生黑色水解圈的菌株m3（附图1）。通过16s rdna方法鉴定菌种为长形赖氨酸芽孢杆菌，经16s rdna序列测序得序列如seq id no.1所示。本实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌（lysinibacillus macroides）是从香草兰发酵豆荚中分离得到的菌株，命名为m3，上述菌株获取时间为2022年12月、来源地为海南省万宁市兴隆镇。
25.实施例2：本发明所述菌株制品的制备将保藏编号为cgmcc no.27164的长形赖氨酸芽孢杆菌活化，挑取单菌落接种于ph4-8的液体培养基中（20g麸皮，10g牛肉浸膏，4g磷酸二氢钾，1000ml去离子水，ph 7），20-40℃条件下震荡培养24-120h后10000g、4℃离心10min，去除上清液，菌体用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得。
26.实施例3：本发明所述菌株产β-d-葡萄糖苷酶能力挑取纯化培养后的菌株接种至液态yepd液体培养基（酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，ph 6.0，115℃高压蒸汽灭菌20min）中，置于28℃摇床180 r/min震荡培养48 h。菌悬液以8000 r/min离心5 min，取上清液25μl，加入至已在50℃水浴中预热10 min的5 mmol/l 100μl对硝基苯酚-β-d-葡萄糖苷溶液中，50℃水浴反应30 min，加入125μl 1mol/l na2co3溶液终止反应，反应液呈黄色为产β-d-葡萄糖苷酶的菌株。呈黄色的反应液用酶标仪在405 nm下测定吸光度值，以空白培养液为对照，计算酶活力。
27.对硝基苯酚标准曲线的制定：精确称量对硝基苯酚0.139 g，用蒸馏水定容至1000ml，配制成1000μmol/l的溶液。分别吸取0、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml、12 ml至100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，配制浓度梯度依次为 0、20、40、60、80、100、120μmol/l的溶液，分别吸取 125μl，然后加入125μl 1mol/l na2co3溶液混匀，在405 nm波长下测定吸光值，以pnp的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制pnp标准曲线，计算菌株产β-d-葡萄糖苷酶活性力。
28.结果表明：菌株m3接种至yepd液体培养基，28℃条件下180 r/min摇床震荡培养48 h，产β-d-葡萄糖苷酶酶活性为0.0008u/ml。
29.实施例4：本发明所述菌株产β-d-葡萄糖苷酶能力优化
碳源优化：在发酵基础培养基[酵母浸膏 1.0%（氮源），葡萄糖2.0%（碳源），蛋白胨2.0%（氮源和碳源），nh4no3（氮源） 0.3%、kh2po
4 0.4%，自然 ph]中去掉碳源，分别添加2%淀粉、玉米芯、蔗糖、微晶纤维素、麸皮、葡萄糖、香草兰冻干粉末为唯一碳源，其它成分保持不变，接种菌株m3，28℃，180 r /min摇床震荡培养72 h，根据实施例3的方法测定β-d-葡萄糖苷酶活性。
[0030]
氮源优化：发酵基础培养基中去掉氮源，分别添加1%牛肉浸膏、尿素、硫酸铵、硝酸铵、酵母膏、香草兰冻干粉末为唯一氮源，其他成分保持不变，28 ℃，180 r /min培养72 h后测定β-d-葡萄糖苷酶活性。
[0031]
发酵培养基初始ph优化：发酵基础培养基中碳、氮源替换为优化后的碳、氮源，培养基初始ph分别调节至4、5、6、7、8, 28 ℃，180 r /min培养72 h后测定β-d-葡萄糖苷酶活性。根据酶活力大小得出优化的ph。
[0032]
震荡培养时间优化：发酵基础培养基中碳、氮源替换为优化后的碳、氮源，培养基初始ph分别调节至优化后的ph，180 r /min分别培养24、48、72、96和120 h后测定β-d-葡萄糖苷酶活性。
[0033]
震荡培养温度优化：发酵基础培养基中碳、氮源替换为优化后的碳、氮源，培养基初始ph调节至优化后的ph，分别置于20、25、28、30、32、35、40℃条件下180 r /min分别培养至优化后的培养时间，测定β-d-葡萄糖苷酶活性。
[0034]
结果表明：菌株m3在以麸皮、牛肉浸膏为碳氮源，ph7.0，28℃培养48h条件下，β-d-葡萄糖苷酶活力最高，可达0.0016u/ml。
[0035]
实施例5：本发明所述菌株提升香草兰发酵豆荚香兰素含量能力及香气感官分析选取成熟未开裂的完整新鲜香草兰豆荚，用流动水清洗豆荚表面灰尘等杂质。将清洗后的新鲜豆荚置于竹篓中，浸入65℃恒温热水中杀青3min后取出沥水。擦干豆荚表面水分，趁热放置在垫有毛巾的发酵盘中，摊开，再加盖毛巾。发酵盘置于55℃下每天保温发酵5h，第二天打开毛巾，擦去豆荚表面水分，再盖上毛巾。发酵5天，豆荚变为黑褐色，柔软。除去包裹豆荚的毛巾，将豆荚移至晾干架上，晾至豆荚含水量在30%时喷洒依据实施例2和实施例4制得的m3菌悬液。以喷洒保藏号为cgmcc no.8629的芽孢杆菌为对照。喷洒菌液后的豆荚继续置于晾干架上晾至含水量25%，分别捆成100克/捆，装入无菌塑料袋中密封，置于有盖的木箱中继续陈化生香6个月。
[0036]
香兰素的提取与测定：准确称取陈化生香后的香草兰豆荚样品0.5g于微波提取瓶中，再与50ml、70％ (v/v) 乙醇水溶液充分混合，设置微波装置的微波功率为100w，20min。提取后的混合物经冷却、过滤处理后，再定容至50ml，每个样品平行测量三次。提取液经0.45μm膜过滤后，用hplc分析。hplc条件：反相c18柱 (zorbax eclipse plusc18，4.6 mm
×
100 mm,3.5μm，安捷伦 )；进样量5μl；检测器检测波长280nm；流速1.0ml/min ；柱温26℃；流动相20％甲醇和80％酸化水(0.5％醋酸)等梯度洗脱。测定结果表明，其中对照组（喷洒菌株cgmcc no.8629）香草兰发酵豆荚香兰素含量为3.58
±
0.05％，实验组（喷洒菌株m3）香草兰发酵豆荚香兰素含量为3.92
±
0.03％，显著高于对照。
[0037]
香气感官分析：准确称取陈化生香后的0.5 g香草兰豆荚，研磨成粉末，置于50 ml三角瓶中，15个感官评定员经过系统专业培训后，在温度22
±
2℃，湿度45
±
5％环境中，对实验组及对照组的香草兰豆荚进行风味评定，评定香气为香草兰香、甜香、果香、烟香、木
香、花香。
[0038]
测定结果表明：喷洒菌株m3辅助陈化生香的香草兰豆荚香草兰香、甜香突出，其它杂香所占比重无显著增加。
[0039]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

技术特征：
1.一种长形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述长形赖氨酸芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27164，保藏日期为2023年4月20日。2.根据权利要求1所述的一种长形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述长形赖氨酸芽孢杆菌经16s rdna序列测序得序列如seq id no.1所示。3.一种权利要求1或2所述长形赖氨酸芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述长形赖氨酸芽孢杆菌用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。4.一种微生物制品，其特征在于，由权利要求1或2所述的长形赖氨酸芽孢杆菌发酵获得。5.一种权利要求4所述微生物制品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2所述的长形赖氨酸芽孢杆菌接种于ph值为5-8的液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心所得。6.根据权利要求5所述的一种微生物制品的制备方法，其特征在于，所述液体培养基的碳源为淀粉、麸皮、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、微晶纤维素中的一种或几种的混合物；所述液体培养基的氮源为硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、牛肉浸膏中的一种或几种的混合物。7.根据权利要求6所述的一种微生物制品的制备方法，其特征在于，所述液体培养基的碳源为麸皮，所述液体培养基的氮源为牛肉浸膏。8.根据权利要求5-7任一项所述的一种微生物制品的制备方法，其特征在于，所述培养条件为温度25-40℃，培养基ph为5-8，培养时间为24h-72h。9.根据权利要求8所述的一种微生物制品的制备方法，其特征在于，所述培养条件为培养温度28℃，培养基ph为7，培养时间48h。10.一种权利要求4所述微生物制品的应用，其特征在于，所述微生物制品用于产β-d-葡萄糖苷酶、将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素、提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素的含量。

技术总结
本发明提供一种长形赖氨酸芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域，本发明所述长形赖氨酸芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27164，保藏日期为2023年4月20日。本发明所述长形赖氨酸菌可产β-D-葡萄糖苷酶，可将香草兰豆荚中香兰素葡萄糖苷水解为香兰素，提升香草兰发酵豆荚主要呈香物质香兰素含量，可应用于提升香草兰发酵豆荚品质。用于提升香草兰发酵豆荚品质。用于提升香草兰发酵豆荚品质。


技术研发人员：赵青云 周烨 谷风林 谢心湄 纪长绵 徐飞 吴桂苹 朱红英 王雨
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院香料饮料研究所
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/19