一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用的制作方法

1.本发明属于病原菌检测技术领域，涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌复合群是一组基因组高度同源，可引起结核病的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等。其中结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌为引起人类结核病的主要病原菌。
3.现有检测以涂片镜检和培养的方式为主，涂片镜检敏感性低，且涂阴肺结核患者占肺结核患者一半左右，并且超过10%的结核疾病传播与涂阴肺结核有关；结核分枝杆菌培养时间长，很容易导致误诊、漏诊、潜在传播的风险。所以急需一种快速准确的诊断方法（分子生物学检测）进行诊断。但目前注册分子产品所用样本类型均为痰液、肺泡灌洗液等，而对于急重症患者、婴儿、儿童病例、无呼吸道病变的肺外结核病例等，难以获取足够的呼吸道标本进行检测，因此结核病游离dna检测应运而生。游离dna（cfdna）作为新的生物标志物已经用于临床孕妇产前诊断、肿瘤检测、器官移植术后排斥和感染检测等领域，但血液中游离dna含量一般较低，片段较小。因此高灵敏度数字pcr检测平台显示出了其检测优势。
4.例如cn112725486a公开了一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法，此方法采用特异性基因位点is1081和数字pcr相结合的方法对标准基因和样品基因能够大量的扩增，但此方法检测靶点单一，仅能针对基因位点is1081进行检测，准确度较多基因靶点联合检测效果低。
5.cn109811036a公开了一种多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法将体外核酸恒温扩增技术和纳米生物传感检测技术相结合，实现了对结核分枝杆菌复合群的特异基因is1081和is6110的检测，但是此方法仅能针对基因位点is1081和is6110进行检测，未能实现多基因联合检测，检测成本较高，操作复杂。
6.综上所述，亟需开发一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，进行多靶点联合检测，实现高精度、可重复、周期短和高灵敏度的检测结核分枝杆菌复合群。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用，能够联合检测is6110、is1081、gyrb和rpob 4个基因检测位点，敏感性优于单基因is6110检测，灵敏度和准确率高，特别适用于急重症、儿童、婴儿等取样困难患者，也可以用于涂片阴性、阳性或未能明确诊断患者的辅助检测，易操作。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.8所示的序列，所述荧光探针的核酸序
列包括seq id no.9-seq id no.12所示的序列。
10.本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够联合检测is6110、is1081、gyrb和rpob 4个基因检测位点，敏感性提升到单靶点检测的1.5倍，灵敏度和准确率高，易操作。
11.seq id no.1：ggcgtactcgacctgaaaga。
12.seq id no.2：ctgaaccggatcgatgtgta。
13.seq id no.3：taccgcgaacgcagcgat。
14.seq id no.4：gccagtccgggaaatagctg。
15.seq id no.5：gacgtggtgatgacacaactacat。
16.seq id no.6：cttcgagccgggtggatag。
17.seq id no.7：cttctccgggtcgatgtcg。
18.seq id no.8：tccttgtctttgcactcgtcg。
19.seq id no.9：ccaccatacggataggggat。
20.seq id no.10：cacccgtgccgcaaccatc。
21.seq id no.11：cgactcggacgcgtatgcgatatct。
22.seq id no.12：tcgttctctgaccctcgtttc。
23.优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
24.优选地，所述荧光基团包括hex、vic、cy5或rox中任意一种或至少两种的组合。
25.优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或mgb中任意一种或至少两种的组合。
26.第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。
27.第三方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针。
28.第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在检测结核分枝杆菌复合群中的应用。
29.第五方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法包括：
30.从待测样本中提取cfdna作为模板，利用第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针进行多重液滴数字pcr扩增，根据pcr扩增结果进行判断。
31.游离dna（cfdna）可以替代组织或作为组织检测的补充，解决了传统的检测结核分枝杆菌复合群常用的标本为病理组织或细胞学标本，但是组织取材具有创伤性的缺陷，不受受到肿瘤大小和部位的影响，便于取样。
32.cfdna检测结核分枝杆菌复合群仍存在一些挑战：（1）血浆cfdna含量因人而异，并且大多数人含量较低；（2）cfdna片段较短，最大约为180 bp；（3）cfdna中来自于肿瘤细胞的cfdna含量大多处于1%以下，甚至只能占总cfdna的万分之一所以对检测技术的灵敏度、特异性要求比较高。本发明采用数字pcr检测方法，设计了特异性引物探针，控制最大上样量，实现了cfdna样本用量低至10 ng/孔，解决了临床cfdna样本量少的难题，同时能够精确定量。
33.优选地，所述多重液滴数字pcr扩增的方法包括：
34.（1）反应体系配置、分装至8联排中；
35.（2）模板投入；
36.（3）震荡混匀、上机检测；
37.（4）设置检测程序。
38.优选地，步骤（1）中所述反应体系包括pcr缓冲液、dntp和taq dna聚合酶。
39.优选地，步骤（1）中所述反应体系包括pcr反应mix，所述pcr反应mix包括dna反应mix，所述mix的浓度为3
×‑5×
。
40.上述3
×‑5×
中的具体点值可以选择3
×
、4
×
、5
×
。优选地，所述pcr缓冲液为3
×‑5×
pcr缓冲液，所述dntp的浓度为50 nm
ꢀ‑
200 nm，所述taq dna聚合酶的浓度为0.1 u
ꢀ‑
5 u。
41.上述3
×‑5×
中的具体点值可以选择3
×
、4
×
、5
×
。上述50 nm
ꢀ‑
200 nm中的具体点值可以选择50 nm、51 nm、52 nm、53 nm、60 nm、70 nm、80 nm、100 nm、150 nm、160 nm、170 nm、190 nm、195nm、196 nm、197 nm、198 nm、199 nm、200 nm。
42.上述0.1 u
ꢀ‑
5 u中的具体点值可以选择0.1 u、0.2 u、0.3 u、0.4 u、0.5 u、1 u、2 u、3 u、4 u、4.5 u、4.6 u、4.7 u、4.8 u、4.9u、5 u。
43.优选地，步骤（2）中所述模板的上样量为20 ng
ꢀ‑
300 ng。
44.上述20-300 ng中的具体点值可以选择20 ng、21 ng、22 ng、23 ng、30 ng、40 ng、50 ng、60 ng、80 ng、90 ng、100 ng、120 ng、180 ng、200 ng、240 ng、260 ng、280 ng、290 ng、295 ng、296 ng、298 ng、299 ng、300 ng。
45.优选地，所述判断的标准为：
46.（1）当3≤靶基因拷贝数≤1.5
×
105时，检测结果为阳性，为定量结果；
47.（2）当靶基因拷贝数为0时，检测结果为阴性；
48.所述靶基因拷贝数的计算公式为：
49.靶基因拷贝数（copy）=仪器测定结果（copy/μl）
×
0.8（nl，生成液滴体积）
×
有效液滴数/1000
50.优选地，所述引物的扩增靶点包括is6110、is1081、gyrb和rpob。
51.优选地，所述结核分枝杆菌复合群包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌或田鼠分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
52.优选地，所述待测样本包括血浆。
53.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
54.（1）本发明创造性地设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够4个基因联合检测（包括两个多拷贝插入序列），能够提高检测的敏感性，优于单基因（is6110）检测，血浆cfdna样本检测限可达到9.81 cfu/ml，灵敏度和准确率高，易操作，特异性强，与非结核分枝杆菌无交叉；
55.（2）样本类型为血浆cfdna，对于急重症患者、婴儿、儿童病例、无呼吸道病变的肺外结核病例等来说，样本易获得；
56.（3）在数字pcr平台上进行检测，对实验人员技术要求低，操作方便，可广泛应用于临床；
57.（4）耗时短，可在2 h内检测完成，结果判读简单，检测结束后即可看到数据及图结果，显示清晰。
附图说明
58.图1为单重和四重检测结果对比图；
59.图2为单重与四重检测血浆游离dna结果对比图；
60.图3为血浆游离dna样本-1、2、3、4单重检测和四重检测图；
61.图4为引物探针预混液1特异性检测结果图；
62.图5为引物探针预混液3特异性检测结果图。
具体实施方式
63.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
64.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
65.实施例1
66.试剂制备。
67.（1）pcr反应液：包括反应缓冲液、dntps、mgcl2、cy5.5 reference dye、taq dna polymerases、pcr反应增强剂；
68.（2）引物探针预混液1（表1）：
69.表1
[0070][0071]
每个基因检测探针5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团，各个基因探针5’端标记hex，3’端均标记mgb，不做区分。
[0072]
（3）引物探针预混液2（表2）：
[0073]
表2
[0074][0075]
每个基因检测探针5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团，各个基因探针5’端标记hex，3’端均标记mgb，不做区分。
[0076]
（4）引物探针预混液3（表3）：
[0077]
表3
[0078][0079]
每个基因检测探针5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团，各个基因探针5’端标记hex，3’端均标记mgb，不做区分。
[0080]
实施例2
[0081]
使用实施例1制备的试剂进行pcr扩增。
[0082]
①
样本制备：实验样本为结核病人血浆cfdna样本，使用游离dna提取试剂盒提取。
[0083]
②ꢀ
pcr反应扩增体系配制：按照如下配比加入到pcr反应管中，震荡混匀后进行离心，总体系22 μl。
[0084]
扩增体系1见表4。
[0085]
表4
[0086]
试剂用量（μl）pcr反应液6引物探针预混液12模板14无酶水0
[0087]
扩增体系2见表5。
[0088]
表5
[0089]
试剂用量（μl）pcr反应液6引物探针预混液22模板14无酶水0
[0090]
扩增体系3见表6。
[0091]
表6
[0092]
试剂用量（μl）pcr反应液6引物探针预混液32模板14无酶水0
[0093]
③ꢀ
pcr扩增：将混匀离心后的pcr反应管放入到数字pcr中，具体操作方法如下：
[0094]
样品的设置：a.点击“设置
”→“
赋值”进入样品分配界面；
[0095]
b.荧光通道，靶基因荧光通道选择“vic”，液滴识别通道“cy5.5”；
[0096]
c. 点击“数量”设置生成液滴数量为23000个；
[0097]
d．按表7如下程序进行扩增。
[0098]
表7
[0099][0100]
e．点击“运行
”→“ꢀ
示例部分
”→“
开始”开始运行实验。
[0101]
④ꢀ
结果判读如下：
[0102]
a. dpcr反应结束后，打开“分析
”→“
1维点图
”→“
孔的筛选”可以查每个孔的扩增结果；
[0103]
b. 选择阳性对照的反应孔，阈值线应设置在阴性和阳性液滴集群间的1/3处（靠近阴性液滴集群），将阈值进行记录；
[0104]
c. 选择所有的反应孔，将记录下的阈值应用于所有反应孔；
[0105]
d. 验证所有的反应孔，确保阈值线不会穿过任何一个反应孔的液滴集群；
[0106]
e. 如果划定的阈值线无法很好的区分待测样本的阴性和阳性液滴集群或者穿过液滴集群，则可对该待测样本进行单独划定阈值线，划定的方法参考“b”步骤。
[0107]
f. 根据划定的阈值线可以得出阳性微滴数、浓度等结果。
[0108]
靶基因拷贝数及样本浓度的计算公式为：
[0109]
靶基因拷贝数（copy）=仪器测定结果（copy/μl）
×
0.8（nl，生成液滴体积）
×
有效液滴数/1000
[0110]
样本浓度（cp/ml）=( 拷贝数（copy）/投入样本体积（10 μl）)
×
1000
[0111]
制备的检出限样本进行重复性检测，单重检测结果如表8，四重检测结果如表9。
[0112]
表8
[0113][0114]
表9
[0115][0116]
结果：单重检出率为87.5%，样本检测浓度为165.98 cp/ml；四重检出率为100%，样本检测浓度为264.20 cp/ml（图1）。
[0117]
实施例3
[0118]
血浆游离dna临床样本检测。
[0119]
使用实施例1试剂对血浆游离dna临床样本检测，对比单基因和4基因联合检测试剂的差异。
[0120]
单重检测值（使用预混液2引物探针）和四重检测值（使用预混液1引物探针）的结果如表10所示。
[0121]
表10
[0122]
样本名称单重检测值（cp/μl）四重检测值（cp/μl）血浆游离dna-116.9417.75血浆游离dna-29.6754.06血浆游离dna-30.290.72血浆游离dna-482104.89
血浆游离dna-531.1937.96血浆游离dna-613.7513.71血浆游离dna-71132.441357.21血浆游离dna-80.721.28血浆游离dna-91.071.42血浆游离dna-100.310.46
[0123]
结果：针对血浆游离dna样本，四重比单重能够多检测，相当于针对更低浓度的样本四重的检出概率更高（图2、图3）。
[0124]
血浆游离dna样本-1、2、3、4单重检测和四重检测结果图如图3所示，依次为血浆游离dna样本-1、2、3、4单重检测和血浆游离dna样本-1、2、3、4四重检测，结果表明四重比单重能够多检测。
[0125]
实施例4
[0126]
特异性检测。
[0127]
以非结核分枝杆菌（鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔默分枝杆菌质粒 ，购自擎科生物），使用4重检测试剂（引物探针预混液1）进行特异性检测，均无交叉阳性检出，特异性较优（图4从左到右依次为鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔默分枝杆菌、阳性对照）；使用4重检测试剂（引物探针预混液3）进行特异性检测，结果与非结核分枝杆菌有交叉反应（图5从左到右依次为鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔默分枝杆菌、阳性对照）。
[0128]
综上所述，本发明创造性地设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够联合检测is6110、is1081、gyrb和rpob 4个基因检测位点，敏感性提升到单靶点检测的1.5倍，灵敏度和准确率高，易操作。
[0129]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.8所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.9-seq id no.12所示的序列。2.权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。3.一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针。4.权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在检测结核分枝杆菌复合群中的应用。5.一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，其特征在于，所述方法包括：从待测样本中提取cfdna作为模板，利用权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针进行多重液滴数字pcr扩增，根据pcr扩增结果进行判断。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重液滴数字pcr扩增的方法包括：（1）反应体系配置、分装至8联排中；（2）模板投入；（3）震荡混匀、上机检测；（4）设置检测程序；步骤（1）中所述反应体系包括pcr缓冲液、dntp和taq dna聚合酶；步骤（1）中所述反应体系包括pcr反应mix，所述pcr反应mix包括dna反应mix，所述mix的浓度为3
×‑5×
；所述pcr缓冲液为3
×‑5×
pcr缓冲液，所述dntp的浓度为50 nm
ꢀ‑
200 nm，所述taq dna聚合酶的浓度为0.1 u
ꢀ‑
5 u；步骤（2）中所述模板的上样量为20 ng
ꢀ‑
300 ng。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：（1）当3≤靶基因拷贝数≤1.5
×
105时，检测结果为阳性，为定量结果；（2）当靶基因拷贝数为0时，检测结果为阴性。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物的扩增靶点包括is6110、is1081、gyrb和rpob。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌复合群包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌或田鼠分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括血浆。

技术总结
本发明公开了一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示的序列，所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示的序列。本发明创造性地设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够联合检测IS6110、IS1081、GYRB和RPOB 4个基因检测位点，灵敏度和准确率高，易操作。易操作。易操作。


技术研发人员：杨康 李修春 李海龙 况丽莎
受保护的技术使用者：思纳福（北京）医疗科技有限公司
技术研发日：2023.08.11
技术公布日：2023/9/19