高剂量志贺氏菌疫苗制剂的制作方法

1.本发明涉及高剂量制剂的新型减毒志贺氏菌疫苗，通过特异性染色体和侵袭质粒突变，所述疫苗是非反应原性的。


背景技术：

2.腹泻疾病是世界范围内的一个重大医疗负担。志贺氏菌和产肠毒素大肠杆菌(etec)仍然是流行地区5岁以下儿童、高收入国家至低收入国家和中等收入国家旅行者以及部署在流行地区的军事人员腹泻表现的两个主要细菌原因。目前的报告显示，全球每年有9.5亿次腹泻，导致130万人死亡，其中50万人涉及5岁以下儿童。仅志贺氏菌每年就导致1.25亿次腹泻，而发生在5岁以下儿童身上的16.5万例病例导致5.5万人死亡。etec提高了这一比率，估计增加约2万人死亡。
3.志贺氏菌属成员引发的感染会导致中度至重度肠道综合征，称为细菌性痢疾或志贺氏菌病。自然免疫是血清型特异性的，通常对遇到的血清型产生保护作用，而对四种志贺氏菌的其他大约50种血清型没有保护作用。自然反应主要针对细菌脂多糖(lps)结构的免疫显性o抗原部分。然而，一种理想的志贺氏菌疫苗应能对所有流行的血清型产生保护作用。志贺氏菌疫苗开发中的另一个限制是免疫原性和安全性之间的最佳平衡(levine,nat rev microbiol 2007,5:540
–
553)。
4.etec是一种粘膜肠道病原体，与志贺氏菌具有重叠的地方流行性，在卫生基础设施薄弱的地区，通过粪口途径(例如志贺氏菌病时)感染。这种病原体通过两种主要的内毒素，耐热素毒素(st)和不耐热性毒素(lt)，发挥其致病性。st是一种19个氨基酸的肽，具有高毒性和弱免疫原性。lt是一种复杂的大分子，由一个lt-a亚单元和5个lt-b亚单元组成。lt全毒素在结构和功能上都与霍乱毒素(ct)密切相关。etec菌株可能表达lt或st，但通常两者都表达。因此，一种可行的疫苗应同时靶向lt和st。尽管进行了多次尝试，但很难产生针对etec毒素的高滴度中和抗体。口服免疫途径应能够递送足够解毒且理想的免疫原性抗原，但这一任务尚未成功解决(buergeois,et al.2016,vaccine,34:2887-2894；tribble,2017；j travel med,1:s6-s12)。此外，关于志贺氏菌，据报道，etec的抗生素耐药性也在增加。
5.kotloff等(infection and immunity2000,68(3):1034
–
1039)描述了一种在virg、sen、set和guaba中具有特异性缺失突变的福氏志贺氏菌(shigella flexneri)2a型减毒候选活疫苗。cvd 1207表达类型特异性o-多糖并侵袭上皮细胞。在接种高达10e8 cfu时发现耐受性良好。然而，在10e9 cfu的剂量下，出现轻度腹泻和一次呕吐。在10e10 cfu剂量下，受试者出现水样腹泻和呕吐。
6.kotloff等(the journal of infectious diseases 2004；190:1745
–
54)描述了疫苗株(1)δguaba福氏志贺氏菌2a型，其在鸟嘌呤核苷酸合成途径中存在缺失(cvd 1204)；和(2)分别由编码志贺氏菌肠毒素(shet)1和2的set和sen基因的缺失所赋予的额外减毒疫苗株(cvd 1208)；以及这些构建体的相对免疫原性。据观察，δset和δsen不影响在
hela细胞中的侵袭力。研究表明，以天然形式表达侵袭质粒抗原(ipa)的cvd 1204和cvd 1208刺激抗体响应高纯度的重组ipab、-c和-d，并且对ipab的响应是免疫显性的。单次口服剂量的cvd 1204和cvd 1208(10e7、10e8或10e9 cfu)会导致一些轻度至中度副作用。
7.据kotloff等(human vaccines 2007,3(6):268-275)所述，10e8或10e9 cfu的单次口服剂量后，尽管guaba、sen和set缺失的福氏志贺氏菌2a型菌株(菌株cvd 1208)具有良好的耐受性和免疫原性，但在摄入10e8或10e9 cfu的受试者中有14％观察到轻度腹泻或持续数小时的低热。
8.noriega等(infection and immunity 67(2):782-788,1999)描述了一种针对14种福氏志贺氏菌血清型的交叉保护策略，包括使用两种血清型2a和3a。所描述的减毒菌株是福氏志贺氏菌2a型菌株cvd1207(δguab-aδset1δsen)和福氏志贺氏菌3a型菌株cvd 1211(δguab-aδvirgδsen)。
9.据fiorentino等(plos one 2014,9(1):e85211)所述，野生型志贺氏菌感染会导致小肠细胞单层(粘膜的替代物)的屏障功能严重改变，并可能(与肠毒素一起)导致水样腹泻。耗尽主要肠毒素(shet1/2和stx)的候选疫苗表明，在暴露于最高细菌接种物后，在caco2单层中观察到细胞旁通透性增加，这可能归因于宿主对感染的特异性反应，而不是细菌毒素。减毒的志贺氏菌菌株诱导了显著的免疫反应，这表明宿主的免疫反应不仅与上皮屏障的功能损伤无关，而且与细菌的主要效应物(shet 1/2和stx)肠毒性活性无关。
10.wo2014037440a2公开了一种产生的具有特异性靶向突变的减毒志贺氏菌活疫苗株，以诱导不受血清型限制的交叉保护，并表达异源(非志贺氏菌)抗原。示例的福氏志贺氏菌2a型2457t菌株包括δrfbf突变，从而获得粗糙表型，及δipabc突变，从而使该菌株具有非侵袭性。
11.ranallo等(vaccine 2012,30:5159-5171)描述了福氏志贺氏菌2a型菌株wrsf2g12和wrsf2g15，这两种减毒活疫苗候选物在使用hela细胞的上皮细胞侵袭试验中被证明具有侵袭性。这两种菌株都缺失virg，并且通过上皮细胞侵袭试验确定具有侵袭性，但不在细胞间传播，这一特征通过sereny试验进行了确定。
12.medeiros等(npj vaccines 2020,article number 30)描述了一种二价(联合)疫苗，所述疫苗具有免疫原性，对小鼠中的福氏志贺氏菌和产肠毒素大肠杆菌感染具有保护作用。


技术实现要素：

13.本发明的目的是提供志贺氏菌疫苗，特别是具有高度免疫原性和安全性改善的预防腹泻疾病的志贺氏菌疫苗。
14.所述目的由本发明权利要求的主题解决，并在此进一步描述。
15.本发明提供一种志贺氏菌疫苗制剂，其包含10e8-10e12 cfu的活的、遗传减毒的福氏志贺氏菌菌株，所述菌株包含setba的染色体缺失，并且如通过sereny试验和通过使用hela细胞或人上皮细胞的体外侵袭试验(例如在使用例如hela细胞的人上皮细胞侵袭试验中)所确定的那样是非侵袭性的。特别是，所述菌株包含内源性侵袭质粒，所述质粒为经基因工程改造以结合表达病原体特异性抗原的异源性表达构建体。
16.特别是，所述制剂包含至少10e8、5
×
10e8、10e9、5
×
10e9、10e10、5
×
10e10、
10e11、5
×
10e11或10e12cfu的剂量，优选高达最大耐受剂量，例如5
×
10e10、6
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10e10、7
×
10e10、8
×
10e10、9
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10e10、1
×
10e11、2
×
10e11、3
×
10e11、4
×
10e11、5
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10e11、6
×
10e11、7
×
10e11、8
×
10e11、9
×
10e11或1
×
10e12中的任何一种。
17.特别是，志贺氏菌疫苗制剂包含预定体积的cfu量，例如100μl、1ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml或50ml中的至少任意一种。可以使用通过特定途径(例如口服、鼻腔或粘膜)方便地施用任何体积的疫苗制剂。
18.根据一个具体方面，福氏志贺氏菌菌株是福氏志贺氏菌2a型菌株或福氏志贺氏菌2b型菌株。特别是，所述菌株是福氏志贺氏菌2a型菌株2457t.
19.特别是，所述菌株包括野生型福氏志贺氏菌菌株内源性的set基因缺失，特别是δset或δsetba突变。
20.特别是，所述菌株包含携带内源性sen基因的内源性侵袭质粒。
21.根据一个具体方面，福氏志贺氏菌株包含内源性侵袭质粒，所述质粒包含(或编码)经侵袭质粒的遗传修饰的失活的iii型分泌系统(t3ss)，优选其中遗传修饰包括表达t3ss组分的一种或多种基因的缺失或失活。
22.特别是，侵袭质粒的遗传修饰包括侵袭性基因座中任何一个基因的缺失或失活。
23.特别是，所述缺失或失活是侵袭性基因座中，特别是ipa操纵子(例如选自ipab、ipac、ipaa和ipad组成的组)内，或mxi/spa操纵子内的一个或多个基因的缺失或失活，或作为t3ss调节子的一个或多个基因(例如选自virb和virf组成的组)的缺失或失活。
24.此处所指的特定基因产物(或基因)如下：
25.ipa操纵子：
26.ipaj(ipaj)、virb(virb)、acp(acp)、ipaa(ipaa)、ipad(ipad)、ipac(ipac)、ipab(ipab)、ipgc(ipgc)、ipgb1(ipgb1)、ipga(ipga)、icsb(icsb)，
27.mxi/spa操纵子：
28.ipgd(ipgd)、ipge(ipge)、ipgf(ipgf)、mxig(mxig)、mxih(mxih)、mxii(mxii)、mxij(mxij)、mxik(mxik)、mxin(mxin)、mxil(mxil)、mxim(mxim)、mxie(mxie)、mxid(mxid)、mxic(mxic)、mxia(mxia)、spa15(spa15)、spa47(spa47)、spa13(spa13)、spa32(spa32)、spa33(spa33)、spa24(spa24)、spa9(spa9)、spa29(spa29)、spa40(spa40)、orf131a(orf131a)和orf131b(orf131b)。
29.特别是，通过侵袭质粒的突变删除一个或多个表达t3ss组分的基因，例如ipa或mxi/spa操纵子上携带的基因，或t3ss的调节子，所述菌株是非侵袭性的。
30.根据一个具体的实例，所述菌株包含ipab和/或ipac和/或其他ipa基因的缺失。
31.特别是，非侵袭性表型的特征在于缺乏对上皮细胞的侵袭，因此不被上皮细胞吸收。此外，疫苗菌株细菌不能在感染细胞内或细胞之间传播，因此不能在细胞间和细胞内传播。因此，所述菌株是真正的非侵袭性菌株。
32.特别是，正如此处进一步所述，通过使用hela细胞的体外上皮细胞侵袭试验确定非侵袭性表型。
33.特别是，非侵袭性表型通过体内测定细菌侵袭性的标准sereny试验确定，正如在豚鼠中测量的那样。此处进一步描述了一种示例性试验。
34.根据一个具体方面，福氏志贺氏菌菌株包括内源性侵袭质粒上的突变，以并入异
源性表达构建体，特别是表达一种或多种病原体特异性抗原的基因构建体，尤其是其中病原体特异性抗原对宿主细胞是异源的。
35.特别是，所述异源性表达构建体包含编码源自病原体的抗原的核苷酸序列。
36.特别是，所述抗原选自细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原和寄生虫抗原组成的组。
37.特别是，所述抗原是源自病原体的保护性抗原，例如选自由以下组成的组
38.a)细菌抗原，优选毒素或定居因子，
39.b)-病毒抗原，优选来自引起肠内或粘膜感染的病原体，
40.c)-真菌抗原，优选来自引起肠内或粘膜感染的病原体，和
41.d)寄生虫抗原，优选来自引起肠内感染的病原体。
42.特别是，所述细菌抗原来源于肠道致病菌，优选选自
43.a.大肠杆菌抗原，特别是选自etec的ltb、突变lta和st、它们的片段、亚单元或融合物、来自肠聚集性大肠杆菌(eaec)的抗原或志贺样毒素1或2
44.b.空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)抗原，
45.c.艰难梭菌(clostridium difficile)抗原，特别是毒素a和b
46.d.霍乱弧菌(vibrio cholera)抗原，特别是cta或ctb抗原，以及
47.e.a)、b)、c)或d)的突变体或融合蛋白。
48.根据一个具体方面，所述抗原由产肠毒素大肠杆菌(etec)的不耐热毒素(ltb)的b亚单元和突变耐热毒素(stm)的融合物组成。
49.特别是，所述stm包括或由seq id no:1组成，优选排除耐热毒素st的野生型序列(seq id no:2)。
50.特别是，所述etec抗原是lt的b亚单元和突变体st的融合蛋白(在ltb和st之间具有或不具有连接子)，优选包括或由ltb序列(例如seq id no:3)和stm序列组成的融合蛋白ltb-stm，stm序列是例如seq id no：1、4、5、6、7、8或9中的任何一个，例如其包含在13和/或12位的st突变，例如在12位处的n12s、n12r或n12k；和/或13位处的p13f或p13g。
51.根据一个具体实施例，stm包括或由以下序列组成：
52.seq id no:1
53.nssnyccelccxxactgcy
54.其中
55.12位的x是s、n、k或r，和/或
56.13位的x是p、g、l或f，
57.优选其中所述stm序列不是由以下组成的野生型st序列：
58.nssnyccelccnpactgcy(seq id no:2)。
59.根据一个具体方面，
60.a)所述ltb包含或由与seq id no:3至少90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列组成；和
61.b)所述stm包含或由seq id no:1、4、5、6、7、8或9中的任何一个序列组成。
62.根据一个具体的实例，所述ltb-stm包括或由seq id no:10、11或12组成，任选其中所述ltb-stm序列包括位于ltb和stm序列之间的连接子。
63.根据一个具体的实例，包括位于ltb和stm序列之间的连接子的ltb-stm序列包括
或由seq id no:12组成。
64.连接子可以是由至少3、4、5或6个，高达例如30、25、20、15或10个氨基酸的序列组成的肽，优选由甘氨酸和/或脯氨酸和/或丝氨酸组成。
65.示例性ltb-stm包含ltb和stm，例如在seq id no:11中，具有或不具有连接子，例如包含或由例如gpgp(seq id no:20)组成的连接子。
66.根据一个具体方面，编码ltb-stm的核苷酸序列与seq id no:13或14至少90％、95％、98％或100％相同。
67.特别是，所述病毒抗原源自腹泻病毒，优选选自轮状病毒和诺沃克病毒(杯状病毒)。
68.特别是，所述寄生虫抗原源自引起腹泻的原生动物，优选选自蓝氏贾第鞭毛虫(giardia lamblia)、隐孢子虫种(cryptosporidium species)和溶组织内阿米巴虫(entameba histolytica)。
69.特别是，所述真菌抗原源自引起腹泻的真菌，优选选自皮炎芽生菌(blastomyces dermatiditis)和组织胞浆菌属(histoplasma spp.)。
70.根据一个具体方面，所述异源性表达构建体包含编码至少两种或至少三种所述抗原的核苷酸序列，例如以串联序列(理解为融合序列)的形式，其中一个编码序列与另一个编码序列融合。
71.特别是，串联序列在每个抗原编码序列前面(上游)都包含一个启动子。特别是，编码序列以终止密码子结束。在每个抗原编码序列后面(下游)可以使用特定终止子序列。
72.示例性串联构建体包含一个或多个拷贝的启动子，所述启动子包含etec的ltba操纵子的上游区域，例如包含或由seq id no:15组成的启动子。
73.特别是，可以在每个抗原编码序列的上游使用相同或不同的启动子来控制抗原的表达。
74.特别是，可以使用相同或不同的终止子序列。终止子序列的具体实例包括或由seq id no:16、17或18中的任何一个序列，或包含翻译终止子序列的任何其他合适序列组成。
75.根据具体实例，所述串联核苷酸序列包含抗原编码序列的两个拷贝或三个拷贝，以表达抗原的两个和三个拷贝(例如核酸序列的串联重复)，例如，其中抗原的至少两个或三个拷贝由所述串联重复表达。
76.根据具体实例，串联核苷酸序列包含ltb-stm编码序列的双或三联体，例如包含编码至少两种抗原的至少两个核酸序列，所述抗原包含或由seq id no:10组成，在ltb和st序列之间具有或不具有连接子，例如，包含编码seq id no:11或seq id no:12的至少一个、两个或三个核酸序列，例如包含或由seq id no:33(编码seq id no:12)或seq id no:14(编码seq id no:12)组成的至少一个、两个或三个核酸序列。
77.根据一个具体方面，福氏志贺氏菌菌株包含内源性侵袭质粒，所述质粒包含并入志贺氏菌必需基因的遗传修饰，优选选自infa、ppa、accd、acps、dape、era、frr、ftsi、ftsl、ftsn、ftsz、lgt、lpxc、msba、mura、muri、nade、parc、pros、pyrb、rpsb、trma、rho和rhol。
78.特别是，所述志贺氏菌必需基因被插入到整合在侵袭质粒中的表达构建体中。所述表达构建体包括可操作地连接志贺氏菌必需基因的启动子。
79.特别是，整合到侵袭质粒中的志贺氏菌必需基因与侵袭质粒是异源的。然而，它可
以是志贺氏菌的内源性基因，例如自然存在于志贺氏菌中但与侵袭质粒异源的基因，或染色体基因。
80.特别是，在志贺氏菌疫苗株中，染色体志贺氏菌必需基因的原始等位基因被删除。
81.根据一个具体方面，所述志贺氏菌必需基因与表达病原体特异性抗原的异源表达构建体整体插入。
82.根据一个具体方面，与没有染色体缺失的菌株相比，福氏志贺氏菌菌株通过一个或多个减少lps-o抗原的内源性基因的染色体缺失而具有粗糙表型。
83.特别是，所述内源性基因选自rfb/wbb基因簇的基因、rfa/waa基因簇的基因、wzx、wzy/rfc和rfah。
84.特别是，通过对参与lps合成、转运和表达的一个或多个基因进行诱变，使疫苗减毒。
85.根据具体实施例，所述缺失是rfb f、d、c、e、j和/或i基因中的一个或多个基因缺失，或其一部分的缺失，或各种志贺氏菌血清型中相应基因的缺失。
86.特别是，一个或多个内源性基因的缺失导致相应lps-o抗原表达减少，例如减少至少90％。
87.根据一个具体方面，提供一种志贺氏菌菌株，其是福氏志贺氏菌2a型菌株，例如福氏志贺氏菌2a型2457t，其缺失rfbf及缺失ipab和ipac基因中的一个或两个基因，或缺失其基本部分。特别是，这种志贺氏菌菌株可以进一步包括必需染色体基因的缺失并将所述基因插入到侵袭质粒中。特别是，所述志贺氏菌菌株包含重组侵袭质粒，所述重组侵袭质粒包含至少一种表达编码异源抗原的基因的异源表达构建体。
88.根据一个具体方面，本发明提供一种活的、减毒的、非侵袭性的志贺氏菌疫苗株的构建，所述疫苗株不表达lps的o-抗原组分，并引发不受血清型限制的对志贺氏菌的防护。根据一个具体的实例，异源lt-st融合蛋白由疫苗株表达，以应对etec，更广泛地覆盖腹泻病原体。
89.根据一个具体的实例，所述福氏志贺氏菌菌株的特征在于基因型福氏志贺氏菌2457tδrfbfδipabcδinfaδsetba::infa-3
×
[ltb-st(n12s)]。
[0090]
本发明进一步提供一种药物制剂，其包含此处所述的志贺氏菌疫苗制剂，提供特定剂量，特别是用于单次使用。
[0091]
特别是，所述剂量是例如在一次或多次(例如重复)施用时引发免疫反应的有效剂量。
[0092]
特别是，所述制剂以适合通过一次(或单次)施用向需要所述疫苗的受试者施用的制剂提供。特别是，可以采用初免-加强策略以有效剂量向受试者施用。
[0093]
所述制剂可以包含药学上可接受的载体，例如在免疫原性制剂中，任选可以包含或不包含佐剂。
[0094]
本发明进一步提供用于配制此处所述的药物制剂或疫苗的组分的试剂盒，例如包含一个或多个容器的药物试剂盒，所述容器内装一种或多种试剂盒组分，例如志贺氏菌菌株和药学上可接受的载体。所述试剂盒可用于体外配制疫苗，然后再向受试者施用。在一个具体的实施例中，所述试剂盒进一步包括使用试剂盒各组分的说明书。
[0095]
根据一个具体方面，福氏志贺氏菌菌株在药物制剂中提供，包括口服(包括经口)
或粘膜制剂，优选为液体、粉末或片剂。
[0096]
特别是，治疗包括以相应制剂施用此处所述的疫苗。特别是，通过口服、舌下、鼻内或胃内施用的方式向受试者施用疫苗。
[0097]
根据一个具体方面，本发明进一步提供此处所述的志贺氏菌疫苗制剂的医学用途。特别是，医学用途涉及免疫疗法，特别是免疫预防，如主动免疫疗法。特异性免疫疗法通过包括诱导、增强、抑制或其他改变免疫反应的方法，提供对患有疾病的受试者的治疗，或对存在感染或罹患疾病或疾病复发风险的受试者的治疗。
[0098]
本发明进一步提供疫苗和相应制剂在治疗受试者，以诱导针对志贺氏菌感染的免疫反应，或针对福氏志贺氏菌菌株表达的异源抗原的免疫反应中的用途。
[0099]
因此，特别是，本发明提供一种通过施用有效剂量的疫苗治疗需要预防性治疗的受试者的方法，例如预防志贺氏菌感染或志贺氏菌疾病的爆发，以及任选所述志贺氏菌菌株表达的异源抗原对其具有特异性的靶病原体(或相应的病原体特异性疾病)感染。
[0100]
特别是，福氏志贺氏菌菌株表达etec抗原作为异源抗原，并且免疫预防是针对etec作为靶病原体引起的传染病。
[0101]
根据本发明，还提供一种通过对有需要的受试者进行疫苗接种和免疫而预防受试者传染病的方法。
[0102]
特别是，传染病是由靶志贺氏菌或靶病原体，特别是与志贺氏菌异源的靶病原体引起的疾病或病症。根据一个具体方面，所述疫苗用于受试者的预防或免疫预防，以预防传染病，特别是肠内疾病，如腹泻疾病。特别是，所述疾病选自志贺氏菌病、痢疾和腹泻。
[0103]
根据本发明，进一步提供一种特别是通过施用有效剂量的此处所述的疫苗制剂，预防受试者传染病，特别是肠内疾病的方法。
[0104]
特别是，所述肠内疾病是由任何志贺氏菌血清型或种引起的。
[0105]
具体实施例涉及疫苗，其中所述疫苗是使用表达一种或多种异源抗原和志贺氏菌抗原的菌株的多价疫苗。
[0106]
特别是，免疫反应对福氏志贺氏菌(福氏志贺氏菌的任何或所有血清型)、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌(痢疾志贺氏菌的任何或全部血清型)和鲍氏志贺氏菌(鲍氏志贺氏菌的任何或全部血清型)中的一种或多种具有保护作用。
[0107]
特别是，免疫反应是交叉保护性靶向福氏志贺氏菌(福氏志贺氏菌的任何或所有血清型)、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌(痢疾志贺氏菌的任何或全部血清型)和鲍氏志贺氏菌(鲍氏志贺氏菌的任何或全部血清型)中的一种或多种。
[0108]
特别是，所述疫苗在小鼠致死性肺部攻击模型中诱导了对志贺氏菌的不受血清型限制的保护。
[0109]
根据一个具体方面，福氏志贺氏菌菌株包括内源性侵袭质粒上的突变，以结合表达病原体特异性抗原的异源表达构建体，用于治疗受试者，诱导针对抗原对其具有特异性的病原体的免疫反应。
[0110]
根据一个具体方面，所述治疗诱导血清、粘膜和/或粪便免疫反应，优选诱导特异性iga、igg和/或igm抗体。
[0111]
根据一个具体方面，疫苗制剂在受试者中是可耐受的和非反应原性的，例如通过没有恶心或呕吐、腹泻、腹痛、食欲不振、头痛、疲劳或肌痛确定。
[0112]
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种制备此处所述疫苗制剂的方法。
[0113]
特别是，所述方法包括以下步骤：
[0114]
a)提供亲本福氏志贺氏菌菌株；
[0115]
b)通过以下方式对菌株进行减毒
[0116]
i.内源性set的染色体删除，使其是非侵袭性的；
[0117]
ii.任选工程化所述菌株，减少lps o-抗原，优选获得粗糙的lps表型；和
[0118]
iii.任选工程化所述菌株，将异源表达构建体掺入到所述内源性侵袭质粒中，所述异源表达构造体表达病原体特异性抗原；和
[0119]
iv.任选工程化所述菌株，将志贺氏菌必需基因掺入到内源性侵袭质粒中，优选其中志贺氏菌必需基因已从志贺氏菌染色体中删除；
[0120]
c)培养所述菌株，并制备包含预定数量cfu的疫苗制剂。
[0121]
特别是，疫苗制剂以冻干或冷冻的形式提供。
[0122]
具体制剂包括缓冲液，例如pbs缓冲液，任选含有peg，例如10％ peg-6000。根据一个具体的实例，疫苗制剂配制为活细菌冷冻浓缩物，在解冻和任选稀释后口服递送。
附图说明
[0123]
图1.此处提及的序列。
[0124]
seq id no:19：实例中使用的shigetec的大侵袭质粒携带的遗传构建体的示意图。ltb(用粗体表示的编码序列)通过gpgp(seq id no:20)连接子(由位于ltb和st(n12s)编码序列之间的核苷酸序列编码)与st(n12s)(带下划线的编码序列)融合。st通过n12s突变解毒。表达由lta启动子(双下划线)驱动，并由ltb终止序列终止。融合基因以3
×
串联重复的形式表达。所述构建体还将infa(斜体)表达为具有内在启动子和终止子序列的独立基因。
[0125]
图1所示序列：engpgpnssnyccelccspactgcy(seq id no:21)
[0126]
图2.使hela细胞感染野生型亲本福氏志贺氏菌2a型2457t、shigetec或相应的等基因突变体，moi为80。平板接种后通过cfu计算确定细胞内(侵袭)细菌相对于接种物的百分数。示出了4个生物复制品和2个技术复制品的综合数据。
[0127]
图3.shigetec的解毒的etec抗原的表达。(a)通过在elisa中与ltb受体gm1结合来测试shigetec全细胞裂解物的ltb-st(n12s)的表达(灰色柱)。通过抗ctb抗体检测结合的ltb。将ltb-st(n12s)的表达水平与连续稀释的ltb(黑色柱)进行比较。使用缺乏ltb-st(n12s)融合构建体的粗糙、非侵袭性志贺氏菌突变体(δrfbfδipabc)作为阴性对照(白色柱)。(b)在大肠杆菌中重组产生野生型st及其n12s突变体。使用培养物的上清液(sn)刺激t84人上皮细胞，并通过elisa测量st诱导的cgmp产生。使用指示量的合成st作为阳性对照。来自携带空载体的细菌的sn作为阴性对照。将来自两个独立实验的三次测量结果进行综合。
[0128]
图4.shigetec诱导对异源志贺氏菌菌株的致死攻击的保护作用。小鼠采用108cfu shigetec(灰色线)或缓冲液(黑色线)鼻内接种3次。最后一次接种疫苗四周后，用致死剂量的(a)宋内氏志贺氏菌(9
×
106cfu)或(b)福氏志贺氏菌6型(1.2
×
107cfu)对小鼠进行鼻内攻击。监测14天的生存情况。示出了来自每组总共10只小鼠的两个独立实验的数据。
[0129]
图5.shigetec疫苗接种后诱导的血清igg和粘膜iga抗体的检测。(a)小鼠采用108cfu shigetec鼻内接种3次。使用所示血清稀释液，在elisa中评估针对最后一次接种后4周获得的血清中的所示抗原的特异性igg抗体水平。符号表示来自三个独立的疫苗接种实验的单只小鼠(每组43只小鼠)的血清的重复测量平均值。(b)小鼠采用108cfu shigetec鼻内接种3次，并在最后一次接种6周后采用致死剂量的宋内氏志贺氏菌或福氏志贺氏菌6型攻击。攻击两周后收集支气管肺泡灌洗液(bal)。使用所示血清稀释液，在elisa中评估针对所示抗原的特异性iga抗体水平。符号表示来自三个独立疫苗接种实验的单只小鼠的bal样品的重复测量平均值，空白对照组和shigetec组分别有18只和41只小鼠。
[0130]
图6.shigetec接种诱导小鼠血清的毒素中和能力。(a)小鼠采用108cfu shigetec鼻内接种3次。将所示稀释度的血清与所示数量的lt一起孵育，并测量lt与gm1包被板的结合。采用多克隆抗霍乱毒素抗体检测结合的lt。(b)将来自单只小鼠的血清(采用108cfu shigetec(灰色符号)或缓冲液(空白对照，黑色符号)鼻内接种3次)与5ng lt预孵育。测量t84人结肠上皮细胞中lt诱导的camp释放。
[0131]
图7.seq id no:19：实例文本中提及的核苷酸序列(infa-3
×
[ltb-st(n12s)])。
[0132]
在序列中：(斜体)、(粗体)、st(n12s)：下划线(突变(粗体加下划线))和启动子(双下划线)；ltb和st(n12s)之间的连接子序列(未强调显示)
[0133]
ltb(用粗体表示的编码序列)通过gpgp(seq id no:20)连接子(由位于ltb和st(n12s)编码序列之间的核苷酸序列编码)与st(n12s)(带下划线的编码序列)融合。st通过n12s突变解毒。表达由lta启动子(双下划线)驱动，并由ltb终止序列终止。融合基因以3
×
串联重复的形式表达。所述构建体还将infa(斜体)表达为具有内在启动子和终止子序列的独立基因。
[0134]
图8(实例8)。一次接种不同cfu的shigetec的队列(图a)或多次接种5
×
10^10cfu shigetec疫苗的队列(图b)的几何平均滴度。在elisa中分析在(最后一次)免疫后第6、10、28、60天采集的血清样本对疫苗株裂解物反应的iga滴度。
具体实施方式
[0135]
整个说明书使用的特定术语具有以下含义。
[0136]
此处使用的术语“包括”、“含有”、“具有”和“包含”可以作为同义词使用，并应理解为开放的定义，允许其它的成员或部分或元素。“由
……
组成”被认为是最封闭的定义，没有组成定义特征以外的其它元素。因此，“包括”范围更宽，包含了“由
……
组成”的定义。
[0137]
此处使用的术语“大约”是指给定值的相同值或与给定值相差+/-10％或+/-5％的值。
[0138]
此处使用的术语“抗原”应特别指任何抗原决定簇，其可能被抗体的结合位点识别。特别是，优选抗原是那些已经被证明是或能够是免疫或治疗相关的分子或结构，特别是那些已经测试了临床疗效的分子或结构。此处所述术语应特别包括选自包括免疫可及和免疫相关表位的抗原，特别是在一种或多种物种或血清型中发现的保守抗原的分子或结构。免疫可及表位通常由病原体外表面或感染细胞表面上表达的抗原呈递或包含在抗原中。
[0139]
抗原可以特别地包括一个或多个免疫相关表位，其在此处理解为被受试者的免疫系统和/或相应的抗体识别的结构。表位可以是例如b细胞表位或t细胞表位，例如cd4+t细
胞表位或cd8+t细胞表位。此处所述抗原特别设计用于在患者体内引发免疫反应，特别是包括一个或多个可被抗体的结合位点识别或能够与hla i类或ii类分子或其它抗原呈递分子(如cd1)的肽槽结合的抗原决定子，从而，可作为特异性t细胞的刺激剂。
[0140]
此处使用的术语“减毒”用于描述志贺氏菌的毒性菌株经过修饰不再能够引起疾病，即修饰后的菌株是无毒的。关于减毒志贺氏菌的术语“活的”在此处用于描述能够生长和繁殖的志贺氏菌。因此，此处所述的志贺氏菌活菌株用于减毒活疫苗，并且能够特异性地在受试者的结肠中定植，但不会引发与肠内或腹泻病原体导致的肠内疾病相关的临床症状。此外，此处所述的活菌株特别能够在接种疫苗的受试者中进行有限复制，并且能够诱导保护性免疫反应，提供针对有毒志贺氏菌菌株的保护作用。减毒菌株是指减毒的细菌。减毒可能包括基因工程，以产生与天然菌株不同的突变体。
[0141]
此处所述的减毒福氏志贺氏菌菌株特别来源于任何相应的志贺氏菌血清组(福氏志贺氏菌的任何血清型)的有毒菌株。例如，血清组b：福氏志贺氏菌(15种血清型和亚血清型)。
[0142]
此处用于减毒目的的有毒志贺氏菌菌株可以是临床上已知的有毒菌株或被鉴定为含有毒力因子的菌株。特别是，所述菌株选自福氏志贺氏菌，特别是福氏志贺氏菌2a型，例如福氏志贺氏菌2a型2457t(atcc 700930,dna＝700930d-5)或cip 107659(法国pasteur研究所)，或福氏志贺氏菌2b型菌株中的任一种。
[0143]
有毒志贺氏菌菌株可以采用本领域已知的方法进行修饰，包括多次连续传代、温度敏感减毒、诱变，特别是靶向诱变等，从而使所得突变菌株减毒，特别是无毒，不能在受试者中引发疾病。
[0144]
在一些实施例中，对有毒菌株的修饰导致基因缺失和/或失活，包括减少或抑制编码毒力因子的多核苷酸或基因的表达，或导致表达非功能性毒力因子。
[0145]
本领域中有许多众所周知的技术可获得减毒突变，例如用于减少或消除多核苷酸表达。例如，可以使用重组dna技术在预定位点(例如启动子区)或编码序列内引入突变，以产生无义突变。重组dna技术包括克隆感兴趣的基因，通过定点诱变修饰基因序列，限制性内切酶消化然后再连接，然后用突变基因替换野生型基因。
[0146]
合适的标准重组dna技术是本领域熟悉的，并且特别是在sambrook等人的《molecular cloning:a laboratory manual"(1989),2nd edition(cold spring harbor laboratory press)中进行了描述。
[0147]
可以使用本领域已知的方法进行减毒突变，包括将野生型基因的dna序列克隆到载体(例如质粒)中，任选将选择性标记插入到克隆的dna序列中或删除dna序列的一部分，导致其失活。例如，可以通过使用限制性内切酶在编码序列内或刚好在编码序列外的两个点处切割dna序列，并将剩余序列中的两个末端连接在一起，从而引入缺失。或者，可以构建突变等位基因，其中靶基因的侧翼区域单独进行扩增，并在单独的重叠pcr反应中直接连接在一起，而省略中间插入靶序列。携带突变dna序列的质粒可以通过已知的技术，例如电穿孔化学转化或偶联转化到细菌中。然后可以通过适当的筛选鉴定其中失活的dna序列已经重组到细菌的染色体中，并且野生型dna序列已经通过同源重组而变得无功能的突变体。
[0148]
此外，如果使用抗生素耐药基因，通常会在细菌用于疫苗之前将所述基因从细菌中去除。根据datsenko等人(proc.natl.acad.sci.u.s.a 97,6640-6645(2000))的方法，诱
变基于允许质粒编码基因和染色体基因的特异性破坏的λ噬菌体red重组酶系统。该策略是采用例如选择性抗生素耐药基因取代这些基因，所述基因是通过使用与靶基因具有40-60nt同源性延伸的引物开展pcr产生的。基于red的重组是在这些同源序列中介导的。在筛选后，也可以使用表达flp重组酶的辅助载体消除抗生素耐药基因，flp重组酶使用位于抗生素耐药基因侧翼的frt直接重复序列(flp识别靶)。
[0149]
在某些实施例中，可以通过一个核苷酸的插入、删除或被另一个核苷酸取代在染色体或染色体外dna(例如质粒)中的预定位点处引入突变(例如点突变)，得到表达减少或没有表达的突变基因。这种突变应该会产生一种引发痢疾的能力降低的志贺氏菌菌株。优选突变是缺失突变，其中基因的破坏是由核酸的切除引起的。例如，这种突变可以通过删除连续的碱基对实现。即使是非常小的缺失，例如10个碱基对延伸，也会导致该基因不编码蛋白质或编码无功能蛋白质。即使一个单个碱基对的缺失也可能导致没有蛋白质或无功能蛋白质，因为作为这种突变的结果，其他碱基对不再处于正确的阅读框中，或者转录被抑制或减少。更优选的是，去除较长的延伸，例如100个碱基对或至少基因的重要部分，例如基因的至少50％。甚至更优选的是删除整个基因。
[0150]
与经典诱导的突变相比，涉及片段或整个基因删除或其组合的明确和特意制造的突变具有优势，即它们不会恢复为野生型。因此，在此处所述的一些实施例中，疫苗株包括活的减毒志贺氏菌菌株，其中编码毒力因子的基因中的突变包括删除或插入以破坏编码该毒力因子的多核苷酸序列，从而不产生相应的蛋白质或产生的蛋白质是无功能的。
[0151]
减毒可以是，例如，通过删除和/或失活以下基因中的一个或多个基因，或其(重要)部分，或影响所述基因功能的所述基因的任何调节子：rfb、wzy、waalaroa、aroc、arod、aroe、guaa、guab、virg以及ipaa-d中的任一个或多个基因。此处所述的优选减毒志贺氏菌菌株是具有至少三个或更多减毒突变的双突变或多突变菌株。用于减毒突变的靶基因的优选组合包括至少一种rfb基因(例如rfb f、d、c、e、j和/或i基因)和至少一种ipa基因(例如ipab、ipac)。
[0152]
鉴定毒力因子编码基因中具有一个或多个突变的细菌的技术是本领域技术人员已知的。因此，检测通过上述技术突变的志贺氏菌菌株的常规技术包括rna印迹法和蛋白质印迹法、pcr、elisa和此处其他地方所述的细胞毒性测定法。使用标准技术可以很容易地筛选没有编码特定毒力因子的功能基因的突变菌株。
[0153]
编码待减毒毒力因子的基因可能是质粒携带的。因此，在一些实施例中，对有毒志贺氏菌菌株的修饰包括突变一种或多种内源性志贺氏菌质粒。术语“质粒”，特别是指独立于细菌染色体之外复制的细胞质dna。可以设想志贺氏菌有毒或侵袭质粒部分突变，或甚至消除质粒。然而，优选减毒的志贺氏菌仍然包含内源性侵袭质粒，更优选稳定的侵袭质粒。这确保了减毒菌株的稳定性，特别是关于减毒细胞引起的侵袭质粒的潜在损失，或来自野生型志贺氏菌的(天然)侵袭质粒的可能摄取，这些可能与不稳定菌株或不稳定侵袭质粒一起发生。
[0154]
志贺氏菌侵袭质粒在大多数志贺氏菌菌株中是内源性的。尽管侵袭质粒可能在培养志贺氏菌菌株时损失，但它可以经工程化而获得表现出高水平稳定性的重组质粒，这使它成为一个有吸引力的靶点，可以作为一种有用的载体开发，从而整合编码抗原，特别是保护性抗原的异源基因。
[0155]“交叉反应”疫苗或相应的免疫反应被理解为保护免受至少一种不同病原体(例如与用于引发反应的病原体不相同的不同血清型或细菌种类)感染的疫苗。交叉保护效力通常可以采用来自暴露于不同病原体的受试者的免疫血清测试，所述不同病原体与elisa或其他免疫测定中的不同病原体反应。
[0156]
此处使用的关于抗原和对所述抗原的免疫反应的术语“交叉反应”应指交叉血清型或交叉物种反应，分别为一种或多种目标血清型和物种提供免疫力。此处所述的交叉反应疫苗可以特异性地引发跨物种免疫反应和相应的免疫球蛋白，例如通过使用缺乏免疫显性o抗原或ipa基因的粗糙志贺氏菌菌株，诱导识别一系列目标志贺氏菌血清型的免疫反应。表位或抗原可以来源于一个源物种，并且对不同于源物种的目标物种具有交叉反应性。表位可以在一系列物种之间共享，因此具有交叉反应性。交叉反应性表位和抗原可以引发跨物种反应性免疫反应和相应的交叉反应性免疫球蛋白。
[0157]
对特定靶病原体的(交叉)反应性可以例如通过免疫学方法确定，例如elisa、fia、ria、荧光显微镜或流式细胞术。
[0158]
当交叉反应性抗原被设计为诱导交叉保护性免疫时，这可以在动物模型中进行测试，例如通过采用源自一种病原体的交叉反应性抗原对动物进行免疫引发免疫反应，并采用至少一种与用于引发免疫反应的病原体不同的病原体攻击动物。例如，采用交叉反应性抗原的这种针对一种以上志贺氏菌血清型或其他肠侵袭性细菌(例如大肠杆菌)的交叉保护性免疫，具体是指针对不同个体的细菌种类中的不同变体(例如亚种水平的变体)的保护。具有共同抗原的血清变型称为血清组或血清型。
[0159]
开发广谱，例如多毒株和/或多血清型和/或多物种志贺氏菌疫苗的基础是鉴定志贺氏菌血清变型中占优势的交叉反应抗原。这尤其包括与人类感染相关的分离株。
[0160]
当多价疫苗被设计为诱导针对不同病原体的交叉保护性免疫时，免疫反应通常由几种抗原引发，例如来自不同病原体的单个抗原。例如，这种多价疫苗可以基于来自不同物种的至少两种不同的保护性抗原，例如来源于志贺氏菌和大肠杆菌属，但也可以基于其他细菌、病毒、真菌或寄生虫抗原。交叉保护性多价疫苗可以例如在动物模型中进行测试，采用包含源自至少两种不同病原体的不同保护性抗原的疫苗对动物进行免疫，引发免疫反应，并采用一种、两种或多种病原体攻击动物。
[0161]
如此处所述，开发基于特定减毒志贺氏菌的多物种候选疫苗的基础是鉴定保护性抗原对(针对其提供保护作用的)不同致病物种中普遍存在的一系列不同血清型是否具有交叉反应性。
[0162]
此处专门用于与疾病或病原体相关的术语“肠内”也称为“肠”，应指的是与肠道有关或影响肠道的疾病状况或病原体，如痢疾或腹泻。特别是，所述肠内疾病是指结肠的感染性疾病。具体症状包括带血、粘液充盈的腹泻；腹痛；发烧和体液流失。腹泻疾病是指每天出现三次或三次以上稀便或流便，或排便次数超过正常情况。肠内病原体被理解为在受试者感染所述病原体或受试者在毒素，特别是肠毒素中毒时引起的肠内疾病。
[0163]
引起感染性肠内疾病的原因有很多，如痢疾或腹泻，其中包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。提供的实例如下：诺如病毒是导致成人病毒性腹泻的最常见原因，但轮状病毒是五岁以下儿童腹泻的最常见原因。40型和41型腺病毒以及星状病毒会导致大量感染。弯曲杆菌是细菌性痢疾或腹泻的常见原因，但在一些地区，沙门氏菌、志贺氏菌和某些大肠杆菌菌
spring harbor laboratory,cold spring harbor laboratory press,new york(2001)中描述的那些。表达载体可以包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体和专门设计的质粒。
[0173]
此处所述的具体表达构建体包含待表达的核酸序列和在宿主细胞中表达所述基因所需的可操作连接的调控元件(从而可操作地控制所述核酸序列的表达)。调控序列的实例包括启动子、操作子、增强子、核糖体结合位点以及控制转录和翻译起始和终止的序列。具体表达构建体是包含与待表达的dna序列可操作地连接的启动子的表达盒，即其中dna序列的表达由所述启动子控制。
[0174]
关于此处所述的异源抗原，该术语特别指在未经基因工程化以表达所述抗原的志贺氏菌菌株中未天然表达的抗原。如果抗原序列中包含野生型志贺氏菌菌株中未天然发生的突变，则所述抗原也理解为异源。
[0175]
此处所述的志贺氏菌菌株可以经基因工程化以表达异源抗原，例如lt和/或st的无毒成分或形式，例如突变体st(stm)。特别是，stm与野生型st的不同之处在于至少一个或两个点突变，例如氨基酸取代。所述细胞诱导针对异源抗原以及天然抗原的免疫反应，从而提高了疫苗提供的保护。
[0176]
此处基因的“失活”通常被理解为指基因的瞬时、可诱导的或组成性下调，从而减少或抑制基因产物的表达。这可以通过基因或与该基因可操作连接的调控序列，例如调节基因表达的启动子、增强子等的突变具体实现。失活突变特别是那些导致减少或抑制多核苷酸或基因(例如编码毒力因子的基因)的表达或导致表达相应非功能蛋白(例如非功能毒力因子)的突变。
[0177]
此处使用的关于基因的术语“侵袭性”或“非侵袭性”理解如下。侵袭性致病细菌能够侵袭真核细胞。例如，在侵袭后，志贺氏菌可能在细胞内繁殖并扩散到邻近的上皮细胞，导致志贺氏菌病的组织破坏和特征性病理。介导志贺氏菌侵袭性的基因有，例如编码侵袭质粒抗原的ipa基因。所述基因中至少一个基因的缺失和/或失活可能导致非侵袭性志贺氏菌。
[0178]
上皮细胞侵袭试验是用于测定志贺氏菌菌株侵袭性的标准体外试验。使用例如hela细胞(人上皮细胞)测定侵袭性和细胞内生长。如果在对照侵袭至少约10％或20％的孵育时间(例如，至少30、40、50或60分钟)后，与对照(侵袭性(例如，野生型)志贺氏菌菌株)相比，未观察到上皮细胞侵袭(小于检测最小值)，则确定志贺氏菌菌株是非侵袭性的。在所述试验中，当侵袭细胞的百分数例如小于2％或小于1％时，则菌株被认为是非侵袭性的。
[0179]
sereny试验是确定志贺氏菌或肠侵袭性大肠杆菌(eiec)等生物体侵袭性的另外一种体内(非人类动物)标准试验。(wood等人.j.clin.microbiol.24:498
–
500,1986)。该试验通过将细菌悬浮液接种到豚鼠的眼睛中完成。严重的粘液脓性结膜炎和严重的角膜炎表明试验呈阳性。如果没有观察到角膜结膜炎的任何症状，则确定菌株是非侵袭性的或无毒的。
[0180]
关于革兰氏阴性细菌(例如志贺氏菌)的术语“粗糙”是指不光滑的细菌，应特别包括“轻度粗糙”(即o-抗原合成下调)或“半粗糙”(表达一个单一o-抗原重复)或“深度粗糙”(lps核心被截短)细菌。此处使用的术语“粗糙”可以包括例如不规则菌落形态的特征，并且可以包括例如波状和/或叶状形态。该术语特别指菌株不能和/或基本上不能产生o-多糖。lps中含有的重复多糖聚合物被称为革兰氏阴性菌的o-抗原、o-多糖或o-(侧)链。o抗原与
核心寡糖连接，并包含lps分子的最外层结构域。o链的存在与否决定了lps是粗糙的还是光滑的。o-抗原结构改变的细菌菌株在琼脂平板上生长时，其外观从光滑变为粗糙。全长o-链使lps光滑，而o-链的缺失或减少使lps粗糙。“光滑”细菌包括完整的核心和o-抗原。“粗糙”细菌包括缺乏lps o-抗原，这意味着没有o-抗原或o-抗原链长缩短或光滑lps链数量减少。术语“轻度粗糙”是指o-抗原链长缩短或光滑lps链数量减少的粗糙细菌亚群。“深度粗糙”细菌是失去部分lps核心，因此也缺乏o-抗原的粗糙细菌亚群。“半粗糙”突变体是由于o-抗原聚合酶功能丧失，lps-核心上表达一个单一的o-抗原重复的粗糙细菌亚群。
[0181]
此处使用的关于粗糙志贺氏菌的术语“lps o-抗原的减少”应具体指标准试验测定的lps o-抗原小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％、或小于10％、或基本上没有或没有。
[0182]
可以使用标准试验测定菌株的粗糙特性。
[0183]
例如，lps突变体的表型可以，例如通过lps的sds-page分离和银染色或使用o-抗原特异性免疫血清的凝集试验测定。
[0184]
粗糙志贺氏菌可以通过至少一个基因或基因重要部分的突变产生，例如通过缺失和/或失活，所述基因参与lps合成、转运和/或表达，优选选自rfb操纵子簇中的基因，或编码o-抗原合成的rfb/wbb基因簇中的一个或多个基因，编码o-抗原连接酶的waal，编码参与o-抗原转运的o-抗原翻转酶的wzx，参与o-抗原聚合的wzy/rfc，编码lps核心合成的rfa/waa基因簇内的基因，影响o-抗原表达的调控基因，如rfah，或其功能丧失导致o-抗原表达减少至少90％。
[0185]
参与lps糖合成的基因的具体实例是rfb a、b、d和c。
[0186]
参与lps糖转移酶的基因的具体实例是rfb f和g。
[0187]
参与lps o-抗原聚合酶的基因的一个具体实例是rfc/wzy。
[0188]
rfb操纵子的簇位于染色体上或侵袭质粒(宋内氏志贺氏菌)上。该簇中的具体基因是rfb f、d、c、e、j和/或i基因。
[0189]
此处使用的术语“set”或“setba”应指志贺氏菌内源性且编码志贺氏菌肠毒素(shet)，特别是shet1的基因，例如正如kotloff等人.(2000，2004，or 2007)所述。
[0190]
此处使用的术语“sen”应指志贺氏菌内源性且编码志贺氏菌肠毒素2型(shet2)的基因，例如正如kotloff等人.(2000，2004，or 2007)所述。
[0191]
关于源自病原体的抗原时使用的术语“源自”在此处理解为定义与病原体中天然存在的相应序列相同的相应氨基酸序列，其可被用作所述抗原的来源，并且其可以用作模板，通过修饰天然存在的(来源)序列产生修饰序列，从而产生其突变体或衍生物。这种突变体在此处理解为源自来源的突变体。
[0192]
此处使用的术语“重组”指的是并非宿主细胞中天然存在的分子或构建体。在一些实施例中，重组核酸分子包含两个或多个非天然方式连接在一起的天然序列。重组蛋白质指的是重组核酸编码与/或表达的蛋白质。在一些实施例中，“重组细胞”表达细胞天然形式(即非重组)内未发现的相同形式的基因与/或表达因人为故意干预异常过表达、低表达与/或完全不表达的天然基因。重组细胞包含至少一个重组多核苷酸或多肽。“重组”、“重组”和产生“重组的”核酸通常包括组装至少两个核酸片段。
[0193]
此处使用的术语“重组”具体指的是“基因工程制备的或导致的”，即通过人工干预
的。重组核苷酸序列可以通过在亲本核苷酸序列中引入一个或多个点突变而被工程化，并且可以在包含包括所述重组核苷酸序列的表达盒的重组宿主细胞中表达。所述表达盒和宿主细胞分别表达的多肽也被称为“重组”。在此处描述的目的，可以采用本领域熟悉的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。此处所述的具体实施例涉及嵌合抗原的制备以及用于所述制备的重组手段，包括编码氨基酸序列的核酸、表达盒、包括编码待表达氨基酸序列的核酸的载体或质粒，及包括任何这些手段的宿主细胞。合适的标准重组dna技术是本领域熟悉的，并且特别是在sambrook等人的“molecular cloning:a laboratory manual"(1989),2nd edition(cold spring harbor laboratory press)中进行了描述。
[0194]
此处术语“受试者”应理解为包括人类或温血哺乳动物受试者，例如人类或牲畜(特别包括猪)、伴侣动物和实验动物，这些受试者是患有特定疾病的患者或健康受试者。术语“受试者”包括接受预防性或治疗性治疗的受试者。
[0195]
特别是，此处所述的治疗和医学用途适用于需要预防或治疗与病原体感染相关的疾病状况的受试者。特别是，治疗可以是干扰病原体是其致病因子的疾病的发病机制。受试者可以是存在患上这种疾病风险的受试者或患有疾病的受试者。
[0196]
术语患上某种疾病的“风险”，是指可能患这种疾病的受试者，例如，由于某种易患病体质，暴露于病原体或病原体感染的受试者，或者已经处于这种疾病的不同阶段，特别是与其他致病疾病条件或病原体感染引起的其他条件或并发症有关。
[0197]
此处使用的术语“治疗”应总是指的是出于预防(即防止感染与/或疾病状态)或治疗(即治疗疾病，不管其发病机理)目的治疗受试者。此处所述的疫苗制剂专门用于主动免疫疗法。
[0198]
特别是，术语“预防”指的是预防发病的预防措施或降低发病风险的预防措施。
[0199]
此处使用治疗受试者的术语“治疗”是指对受试者进行医疗管理，目的是治愈、改善、稳定、降低发病率或预防单独或一起理解为“疾病状况”的疾病、病理状况或失调。
[0200]
此处所述的疫苗特别包含有效剂量的志贺氏菌细胞，有效剂量在此处具体理解为“有效剂量”或“免疫有效剂量”。“免疫有效剂量”是指对受试者以单剂量或一系列剂量的一部分施用，在治疗或预防治疗目标的基础上是有效的。“预防有效剂量”是指在剂量和必要的时间内实现所需预防效果(例如预防目标病原体感染或抑制目标病原体疾病的发作或进展)有效的剂量。这一剂量将随治疗患者的健康和体格状况、年龄、患者免疫系统合成抗体的能力、所需的免疫反应类型和程度、疫苗配方及其它条件而异。
[0201]
有效用量或剂量可以以一定数量的菌落形成单位(cfu)表示，菌落形成单位决定制剂中活细菌的数量。
[0202]
术语“cfu”是术语“菌落形成单位”的缩写，此处用于量化制剂中活细菌的数量。采用菌落形成单元计数需要培养微生物，只计数活细胞，而显微镜检查则计数所有细胞(活细胞或死细胞)。cfu的数量通常由样本中存在的细胞数量决定，这些细胞能够在营养培养基、温度和时间的特定条件下产生菌落。cfu结果可以通过微生物平板接种和计数方法获得。通常，将细菌悬浮液的系列稀释液接种到适当的琼脂板(例如lb琼脂或tsa)上，并在37℃下孵育16-24小时。随后，对适当稀释度下形成的菌落计数，并将获得的数量乘以稀释因子，得到初始细菌悬浮液的细菌浓度(即cfu/ml)。
[0203]
此处所述的疫苗制剂可以在主动免疫治疗过程中以高剂量治疗向受试者施用，从
而预防肠内疾病，特别是由志贺氏菌和任选异源肠内或腹泻病原体引起的痢疾。这可以通过此处所述的交叉保护性和/或多价疫苗实现。
[0204]
例如，在免疫接种后1-3个月，有效剂量能够在受试者体内引发有效抗体滴度水平的免疫反应，结合和中和靶病原体。有效性可通过受试者血液标本中相应的抗体滴度确定。
[0205]
在一些实施例中，有效剂量是当作为特定给药方案的一部分施用时与有益效果相关的剂量，例如单次施用或系列施用(例如“加强”方案)。为了进行治疗，此处所述的疫苗可以施用一次，或者分为单独的组分与/或多个更小的剂量，按时间间隔施用。一般说来，在首次向受试者施用此处所述疫苗后，相隔一段时间，通过相同或不同的施用途径执行一次或多次加强施用。在多次施用的情况下，后续施用可以例如在前一次施用的1、2、3、4、5、6天中的任何一天内；或在1、2、3、4、5、6、7或8周中的任何一周内；或2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月中的任何一个月内(例如，在1至52周内)施用。
[0206]
此处所述的疫苗可在药物制剂中包含志贺氏菌细胞，所述药物制剂任选包含免疫原性制剂。具体实施例包含药学上可接受的赋形剂或载体。
[0207]
适合方便某些施用手段的药物载体是本领域熟悉的。具体实施例涉及引发体液(b细胞、抗体)或细胞毒性(t细胞)免疫反应的免疫原性制剂，包含药学上可接受的载体和/或佐剂。佐剂可特别用于增强疫苗的效果。佐剂可直接加入到疫苗组合物中或可以单独施用，与疫苗抗原同时施用或在疫苗抗原施用之前或之后立即施用。
[0208]
此处所述的术语“佐剂”特别指的是一种化合物，当其与抗原一起施用时增强与/或重新定向抗原的免疫反应，但是，当其单独施用时，并不会产生针对抗原的免疫反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫反应，包括淋巴细胞募集、刺激b细胞与/或t细胞及刺激巨噬细胞。
[0209]
此处所述的疫苗可以使用配制减毒细菌疫苗的已知技术配制。疫苗优选口服施用，例如作为水溶液或干粉，在施用前在合适的缓冲液中重构。重构优选在合适ph的缓冲液中进行，以确保细菌的活力。为了保护减毒细菌和疫苗免受胃酸的影响，每次施用疫苗时优选施用保护剂，例如碳酸氢钠。或者，疫苗以冻干胶囊形式提供。
[0210]
疫苗菌株可以在药学上可接受的载体中施用，例如，以喷雾的形式施用，或混合在食物和/或水中，或与合适的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合递送。根据施用途径和所需制剂，疫苗菌株可含有辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、佐剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、色素等。制备药物组合物和药物的药物载体是本领域熟知的，例如教科书如“remington's pharmaceutical sciences”(1990)，第18版(mack publishing co.)所述。
[0211]
药学上可接受的载体通常包括与此处所述的细菌制剂在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、防腐剂，例如抗菌剂(特别是对志贺氏菌无效的药剂)和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的具体实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、聚乙二醇等以及它们的任何组合。其它药学上可接受的载体是本领域熟悉的，例如，在remington：the science and practice of pharmacy,22
nd revised edition(allen jr,lv,ed.,pharmaceutical press,2012)中进行了描述。液体制剂可以是溶液、乳液或悬浮液，也可以包括赋形剂，例如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐
剂和螯合剂。示例性载体是脂质体或阳离子肽。根据此处称为shigetec的具体实例，所述制剂是在含10％ peg-6000的pbs缓冲液中的活细菌浓缩物，用于口服递送，可以以冷冻形式储存和提供。
[0212]
优选的制剂是储存稳定的即用形式，保质期至少为一到两年。本发明还提供递送装置，例如预装此处所述疫苗的注射器。
[0213]
此处所述的疫苗可以通过疫苗领域已知的常规途径施用，例如粘膜(例如，眼、鼻内、口腔、胃、肠、直肠)表面，或局部施用(例如，通过贴片)。
[0214]
考虑到受试者的年龄、性别、体重、物种和状况以及施用途径等因素，可以以医学或兽医领域技术人员熟知的剂量和技术施用此处所述的疫苗株。疫苗株可以单独施用，也可以与其他治疗或疗法联合施用或顺序施用。施用形式可以包括悬浮液、糖浆或酏剂，例如无菌悬浮液或乳液。
[0215]
参照下述实例将更充分地理解前述说明。但是，这些实例仅代表实践本发明一个或多个实施例的方法，不应视为限制本发明的范围。
[0216]
实例
[0217]
实例1.shigetec疫苗株的产生
[0218]
采用携带约200kbp(140mda)大侵袭质粒的全序列福氏志贺氏菌菌株2457t(genbank登录号：aduv00000000.1)作为亲本菌株(wei等人.infect immune 2003，71，2775-2786)。遗传操作采用red重组酶方法(datsenko and wanner，proc.natl.acad.sci.u.s.a 97，6640-6645(2000))。为了去除血清型决定的显性抗原，实现不受血清型限制的保护，从染色体上删除rfbf基因，使野生型亲本菌株变得粗糙-即缺乏lps o-抗原的表达。为了产生口服用非侵袭性疫苗株，从侵袭质粒(ip)中删除了两个参与iii型分泌系统功能的基因ipab和ipac。此外，为了降低疫苗的反应原性风险，还通过从染色体上删除基因setba,去除福氏志贺氏菌2型特异性推定肠毒素shet-1，这是一种类似于霍乱毒素和lt的ab5毒素(kotloff et al.2004)，这一步骤还消除了在互补dna链上同一基因座编码的毒力因子pic。
[0219]
为了增加疫苗的etec覆盖范围，构建了一种编码嵌合ltb-stm融合类毒素的合成融合基因。
[0220]
ltb-stm融合类毒素的氨基酸序列标识为seq id no:12。编码核苷酸序列标识为seq id no:13。
[0221]
在缺乏lt全毒素的lta亚单元的情况下，ltb亚单元是无毒的，而st肽是天生有毒的。因此，在st基因中引入n12s突变。该突变已被证明可以消除毒性，同时保留st的抗原性(taxt等人.infect immun 2016,84,1239
–
1249)。为了确保更高的表达水平，将三串联ltb-mst融合蛋白基因插入到ip中。插入物补充infa基因，这是一种单拷贝必需基因(cummings等人.j bacteriol 1994,176,198-205)，随后将其从染色体上删除，从而实现侵袭质粒的稳定(schuch等人.infect immun 1997,65,3686
–
3692)。该合成构建体的示意结构以及st类毒素的序列以及ltb和st类毒素之间的连接子区域如图1所示。
[0222]
得到的菌株命名为福氏志贺氏菌2457tδrfbfδipabcδinfaδsetba::infa-3
×
[ltb-st(n12s)]，或shigetec。为了证明所有预期的遗传操作都在shigetec菌株中成功完成，通过pcr和测序对所有预期的表型变化进行验证。
[0223]
cfu测定
[0224]
将shigetec在胰酶大豆肉汤(tsb)中培养，在pbs中洗涤，并在制剂缓冲液中浓缩至所需的cfu/ml。将冷冻原液在-80℃下保存。
[0225]
疫苗制剂中准确的cfu计数通过平板接种测定。在pbs中进行适当的稀释。制备和平板接种选择哪种稀释液取决于起始材料的预期cfu。为了获得可计数的菌落数(大于或等于10，小于或等于250)，将100μl的至少3种稀释液一式两份分散在tsa板上。例如，对于预期的cfu数量，可以采用以下稀释液进行平板接种：
[0226][0227][0228]
在15毫升试管中制备无菌pbs中的系列稀释液。1/10稀释的最小样品体积为500μl添加到4.5ml稀释介质中。对于1/10稀释，添加1体积的样品和9体积的稀释剂。
[0229]
将100μl适当稀释的样品分为两份或三份(每个稀释液接种2或3块板)进行平板接种，并在37℃下孵育16至24小时。cfu(出现在琼脂平板上的菌落)在第二天进行计数。原始疫苗制剂的实际cfu/ml通过将计数的cfu的平均值乘以稀释因子确定。
[0230]
实例2.shigetec的表型表征
[0231]
2.1.shigetec表达粗糙脂多糖
[0232]
由于rfbf缺失，缺少野生型志贺氏菌菌株lps制剂的银染凝胶特征的o-抗原梯状条带，证明了o-抗原完全丧失。疫苗株与抗福氏志贺氏菌分型血清没有凝集证实了缺乏o-抗原表达。
[0233]
2.2.shigetec是非侵袭性的和无毒的
[0234]
人上皮细胞的侵袭是志贺氏菌的固有特征，需要iii型分泌装置的功能。ipab和ipac的缺失预计会导致shigetec侵袭能力的丧失。这在使用hela(人上皮)细胞的体外侵袭试验中得到了证实。虽然亲本野生型菌株能够侵袭细胞，但shigetec完全失去了其侵袭能力(图2)。仅缺乏rfbf的单一粗糙突变体显示出与野生型菌株相似的侵袭性。另一方面，发现单突变δipabc是完全非侵袭性的，例如shigetec。这些数据清楚地表明，在此测试中，从shigetec的多个突变来看，rfbf缺失并不会得到非侵袭性表型。
[0235]
ser
é
ny试验是评估志贺氏菌菌株毒力的金标准体内模型，广泛用于在人类志愿者的临床试验前确认减毒情况(ser
é
any，b.acta microbiol acad sci hung 1955，2293-296)。它是这样执行的：在豚鼠眼睛中接种毒力志贺氏菌菌株的细菌悬浮液，导致严重角结膜炎。为了测试shigetec在该模型中的毒力，采用shigetec或其野生型亲本菌株(福氏志贺氏菌2a型2457t)对豚鼠进行眼部接种。亲本野生型菌株诱导的角结膜炎的严重程度分数与接种量成正比，而疫苗株即使在最高的细菌接种量下也完全无毒
[0236]
总之，体外和体内试验已经证明了shigetec的非侵袭性和无毒性。这完全符合预
期，因为ipab和ipac在t3ss的功能和侵袭性中发挥着重要作用。
[0237]
方法：使用上皮细胞在体外评估shigetec疫苗株以及等基因单个突变体(δrfbf或δipabc)的侵袭性。将侵袭性与亲本野生型菌株2457t的侵袭性进行比较。hela细胞(atcc，ccl-2)在含10％胎牛血清(fcs)达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)的24孔板中生长直到融合。采用野生型或疫苗株在37℃下以80的感染复数(moi)感染细胞1小时。培养后，采用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤平板两次，并采用50μg/ml庆大霉素(在37℃/5％ co2条件下30分钟)杀死细胞外细菌。在采用1％ triton x-100裂解之前，先用pbs洗涤细胞3次。通过将细菌接种到胰酶大豆琼脂(tsa)平板上进行定量。计算相对于在tsa上接种确定的接种物中细菌数量的侵袭性(细胞内)细菌的百分数。
[0238]
在ser
é
ny试验中，雌性豚鼠(4-5个月龄，charles river)在左眼接种shigetec，在右眼接种其野生型亲本菌株(福氏志贺氏菌2457t)，细菌剂量是10
6-109个菌落形成单位(cfu)/只眼睛(悬浮在50μl pbs中)。对4只动物(每个剂量共2只动物)进行两个相同的独立实验。感染后对动物监测6天，症状的严重程度(粘液脓性结膜炎和角膜炎)按0-4分进行评分。
[0239]
实例3：shigetec表达解毒的etec毒素抗原
[0240]
ltb和st(n12s)融合蛋白的表达使用在不同生长阶段收集的shigetec培养物的裂解物，通过基于gm1(即ltb受体)结合的elisa进行证明和定量。融合类毒素在所有生长阶段都有表达，随着细菌浓度增加，其表达更高(图3a)。使用不携带嵌合毒素抗原元件的δrfbfδipabc突变体的裂解物，表明了检测的特异性(图3a)。
[0241]
暴露于表达重组野生型st或st(n12s)的大肠杆菌培养物上清液后，t84人上皮细胞中缺乏cgmp诱导，证明了st(n12s)突变体的完全解毒性(图3b)。
[0242]
方法：ltb-st(n12s)融合蛋白表达的检测：从生长到od
600nm 0.5、2或过夜(o/n)的培养物制备shigetec全细胞裂解物。通过gm1结合测定ltb-st(n12s)融合蛋白的表达。elisa板在4℃下每孔包被10μg gm1(sigma-aldrich)过夜(o/n)。在室温(rt)下采用2％牛血清白蛋白(bsa，fisher scientific)封闭平板1小时。重组ltb(sigma-aldrich)以系列稀释液使用，作为阳性对照。使用缺乏ltb-st(n12s)构建体的粗糙、非侵袭性志贺氏菌突变体(δrfbfδipabc)的裂解物作为阴性对照。将裂解物和对照在平板上孵育，并采用hrp抗霍乱毒素b亚单元(ctb)兔多克隆抗体(fisher scientific)和abts底物(fisher scintific)检测结合的ltb。
[0243]
实例4.shigetec疫苗接种针对志贺氏菌攻击提供不受血清型限制的保护作用
[0244]
由于在小型实验动物中缺乏合适的腹泻模型，通常对志贺氏菌疫苗在志贺氏菌病小鼠肺模型中的疗效进行评估(van de verg等人.infect immun 1995,63,1947
–
1954)。在该模型中，每隔两周对小鼠进行三次鼻内免疫，测试shigetec的疫苗潜力。在最后一次免疫接种四周后，采用致死剂量的野生型志贺氏菌菌株：福氏志贺氏菌6型或宋内氏志贺氏菌(在初步研究中确定了最低致死剂量，数据未显示)对这些动物进行鼻内感染。shigetec疫苗接种针对这两种异源血清型菌株都具有100％的保护作用(图4)。
[0245]
方法：为了测量shigetec疫苗的效力，5只6周大的雌性balb/c小鼠(charles river)为一组，每两周鼻内(i.n.)接种3次shigetec(每只动物50μl pbs中的108cfu细菌悬浮液)。最后一次接种疫苗四周后，采用最低致死剂量的宋内氏志贺氏菌#598(9
×
106cfu)
或福氏志贺氏菌6型#542(1.2
×
107cfu)对小鼠进行攻击。在初步实验中对使用的最小致死剂量进行了滴定。对攻击后14天的生存情况进行监测。
[0246]
实例5：shigetec疫苗接种诱导针对志贺氏菌和etec毒素的全身性和粘膜抗体反应
[0247]
在小鼠中1次、2次或3次鼻内免疫后，评估其对shigetec疫苗接种的抗体反应。为了评估针对志贺氏菌和etec抗原ltb和st的全身性抗体反应，我们通过elisa测量了血清igg抗体。在第一次接种疫苗后，检测到针对shigetec裂解物的igg水平，该水平随着接种次数的增加而增加(图5a，左图)。只有在两次接种疫苗后才能检测到针对ltb和st的抗体，并且各个动物之间变化较大(图5a，中图和右图)。抗-st igg抗体水平预计较低，但3次免疫后明显得到诱导，与个体免疫前水平相比，44％的动物中其水平增加了4倍，83％的动物中其水平增加了2倍。
[0248]
在三次鼻内免疫之后，采用异源志贺氏菌菌株攻击，2周后，收集动物的支气管肺泡灌洗液(bal)。还检测抗志贺氏菌、抗ltb和抗-st iga抗体的粘膜抗体反应。在bal中可检测到抗-shigetec和抗-ltb iga抗体，表明其具有特异性适应性反应。(图5b)。
[0249]
方法：为了监测shigetec诱导的全身性igg和粘膜iga反应，采用108cfu的疫苗株对小鼠进行3次鼻内免疫接种，并在第一次和第二次接种后两周和最后一次免疫后四周采集血清。攻击后14天收集支气管肺泡灌洗液(bal)。分别测定血清或bal中针对shigetec裂解物(采用1
×
107cfu/孔的shigetec过夜培养物制备)或包被在elisa板上的重组ltb(sigma-aldrich，100ng/孔)的特异性igg和iga抗体水平。将生物素化的st(通过pepscan合成)以100ng/孔包被在链霉亲和素预包被板(fisher scientific)上。采用过氧化物酶affinipure f(ab')2片段山羊抗小鼠igg(h+l)(jackson immunoresearch)检测igg，采用过氧化物酶偶联物山羊抗小鼠iga(sigma-aldrich)和abts底物(fisher scientific)检测iga。
[0250]
实例6：shigetec疫苗接种诱导中和性抗etec毒素抗体
[0251]
为了提供针对etec的保护作用，疫苗应诱导具有毒素中和能力的抗-lt和抗-st抗体。采用shigetec进行3次鼻内免疫后，我们发现血清中诱导了抗-ltb和抗-st igg。在基于无细胞elisa的测定中测试了疫苗诱导的抗体阻断lt与其受体gm1结合的能力。我们观察到血清-和lt-浓度依赖性抑制(图6a)。血清抗体还能够抑制lt诱导的t84人结肠上皮细胞的camp释放(图6b)。为了证明shigetec表达的ltb-st(n12s)融合蛋白可能会产生抗st中和抗体(图3a)，我们采用重组ltb-st(n12s)或ltb-st(野生型st)融合蛋白进行了肠外疫苗接种，其在血清中诱导了高水平的抗-st igg。这些血清抗体可以完全中和t84人结肠上皮细胞中st诱导的cgmp释放(图6c)。针对ltb-st(n12s)产生的抗体能够以与针对ltb野生型st产生的抗体相同的方式中和野生型st，这证实了针对突变体st产生的抗体能够在功能上中和野生型etec st。这些数据证实，从shigetec的侵袭质粒表达的ltb-st(n12s)融合蛋白可以诱导能够有效中和etec lt和st的抗体反应。
[0252]
方法：基于elisa的lt中和试验：将鼻内接种三次shigetec的小鼠的血清采用10、25、50或100ng的lt以2倍、10倍和50倍的稀释度孵育。如上所述，使用抗霍乱毒素β抗体在gm1包被的elisa板上测量保持不与抗体结合的lt的数量。
[0253]
基于细胞的lt和st中和测定：将t84人结肠上皮细胞(atcc)接种在1ml dmem/f12
(5％fcs，p/s)中的24孔板中，并生长直至融合。实验前一天更换培养基。采用培养基(不含fcs的dmem/f12，p/s)洗涤细胞3次，并用含有1mm 3-3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的培养基(ibmx，sigma-aldrich)预孵育。将5ng重组lt或合成st(pepscan)与来自空白对照(mock)或shigetec接种小鼠的血清(3次鼻内免疫后具有高ltb滴度的个体组合池，或采用200μg重组ltb-st(n12s)蛋白进行3次腹膜内免疫后具有高st滴度的个体组合池)预孵育。毒素和血清预孵育后，将混合物转移到t84细胞中，并在37℃(5％ co2)下孵育3小时。取出上清液，采用0.1m hcl/1％ triton x-100在室温下裂解细胞。对细胞裂解物进行离心，根据制造商的说明，分别使用直接camp或cgmp elisa试剂盒(enzo life sciences)，评估上清液中lt诱导的camp或st-诱导的cgmp。
[0254]
st突变体在大肠杆菌中的表达：
[0255]
构建体的产生：通过使用ndei-st-prev(5
’‑
ccccgatatacatatgaaaaaatc-3’(seq id no:22))和st-bamhi-pfw(5
’‑
tcgcggatccttaatagcacccggtac-3’(seq id no:23))引物扩增etec h10407菌株的pre-pro-st基因，并在bamhi和ndei限制性位点之间插入pet24a(+)表达载体，产生pet24a(+)-pre-pro-st构建体。使用st-mut-p-fw(5
’‑
aagcaggagaacaacacaattcac-3’(seq id no:24)和st-mut-p-rev(5
’‑
gtaccgggtgctattaaggatc-3’(seq id no:25))引物，对pet24a(+)-st载体进行定点诱变，产生pet24a(+)-pre-pro-st(n12s)。使用sanger测序法确认载体中的st序列。将两种载体以及pet24a(+)空载体进一步转化到de3-tuner表达细胞中。st和st(n12s)肽的表达：将含有pet24a(+)、pet24a(+)-pre-pro-st或pet24a(+)-pre-pro-st(n12s)载体的de3-tuner细胞的过夜培养物稀释，并在含有1％酪蛋白氨基酸和25μg/ml卡那霉素的rpmi中在37℃、200rpm条件下生长至od
600nm 1。然后，使用1mm iptg在37℃、250rpm条件下诱导肽的表达4小时。细胞在5000rpm下离心10分钟，收集培养上清液，并使用0.2μm醋酸纤维素无菌过滤器过滤。
[0256]
st肽表达和st(n12s)肽解毒的验证：将t84人结肠上皮细胞(atcc)接种在1ml dmem/f12(5％fcs，p/s)中的24孔板中，并生长直至融合。实验前一天更换培养基。采用培养基(不含fcs的dmem/f12，p/s)洗涤细胞3次，并用含有1mm ibmx的培养基预孵育。在dmem/f12中以100ng、25ng和5ng制备合成st(pepscan)稀释液，并在37℃/5％co2下在t84细胞上孵育1小时。此外，在大肠杆菌细胞表达st或st(n12s)肽后，以200μl/孔测试过滤的培养上清液。孵育后，除去上清液，并在0.1m hcl/1％ triton x-100中裂解细胞。对细胞裂解物进行离心，根据制造商的说明，通过直接cgmp elisa(enzo life sciences)，评估上清液的cgmp诱导。
[0257]
实例7：shigetec的耐受性
[0258]
为了评估高剂量志贺氏菌疫苗的安全性和耐受性，对84名健康成年人(18-45岁)进行了一项安慰剂对照的双盲1期临床研究。主要结果指标是评估局部和全身反应，重点是与志贺氏菌感染相关的胃肠道症状。急性安全性(免疫后第1天至第6天)和总体安全性(从免疫后第7天到第60天)之间存在区别。研究发现，单剂量1
×
10e9、1
×
10e10、5
×
10e10和2
×
10e11cfu以及多剂量5
×
10e10 cfu(以3天间隔施用2次、3次和4次)通常是安全的和良好耐受的。高剂量shigetec疫苗的口服施用并没有引起新发现的安全性问题，之前发现的与预期症状和/或不良反应相关的安全性状况也没有发生有意义的变化。共发现25例不良事
件。研究中报告了14例反应原性病例和11例其他不良事件，均为轻度或中度。研究结束时，所有这些问题都得到了解决。在研究中，没有任何因疫苗引起的实验室异常，也没有报告严重不良事件(sae)，在任何参与者接种最后一剂疫苗后的60天内，在筛查中也没有发现任何医疗状况恶化。
[0259]
反应原性事件的具体描述：总共有14个事件被认为与疫苗有关，并被评估为反应原性。据报道，13例为轻度，1例为中度，所有事件均已恢复/解决。在第1阶段(单剂量施用)，最高剂量的2
×
10^11cfu与8名疫苗接种者中2人的轻度和短暂胃肠道症状有关。一名参与者出现腹泻和恶心，第二名参与者出现呕吐。没有疫苗接种者出现志贺氏菌病的证据。在第2阶段(多次施用最大耐受剂量：5
×
10e10 cfu)，三种多剂量方案(2次、3次、4次)中疫苗的耐受性均良好。
[0260]
在两剂组中，八分之一的疫苗接种者在接种当天报告恶心。在三剂组中，共报告了五起反应原性事件，均发生在疫苗接种当天。一名参与者报告了四次事件(恶心和呕吐，每种均两次)。另一名参与者报告了一次呕吐。
[0261]
在四剂组中，只有一名参与者出现了反应原性事件，在所有四剂疫苗的接种日都出现呕吐，在最后一次接种后腹泻一天。在第1阶段和第2阶段，所有反应原性事件都在一天内解决。安慰剂组未发生反应原性不良事件。
[0262]
非反应原性事件的具体描述：发生了11起非反应原性事件。第i阶段有6例非反应原性不良事件，第ii阶段有5例。其中9例被评估为轻度，2例被评估为中度，没有1例被评估为重度。所有事件均被认为与疫苗无关，并且在研究结束时全部恢复/解决。
[0263]
研究期间未出现严重不良事件或重度不良事件。此外，没有病史恶化的报告。
[0264]
方法：这第1期安全性和免疫原性研究采用双盲安慰剂对照设计，分两个阶段进行。在第1阶段，共有48名受试者(2名疫苗受试者对应一名安慰剂受试者)依次纳入4个不同的递增剂量组(每组12名受试者)，从第一组1
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10^9菌落形成单位(cfu)疫苗或安慰剂的剂量开始，接受单次口服剂量的shigetec疫苗。在其余受试者进组之前，每个剂量组招募两名哨兵受试者(一个接受疫苗和一个接受安慰剂)。如果哨兵受试者在6天的随访中没有达到停药规则(由src审查)，则该组的其余受试者进组并给药。如果整组受试者在6天的随访中没有达到停药规则(由src审查)，则下一组的受试者进组，直到所有4组均进组，并通过6天的评估进行评估。第1阶段在住院环境中在单一地点进行6天。如果每组受试者无志贺氏菌病样疾病症状，则在给药后6天(住院7天)出院，开展门诊随访。任何有症状疾病的受试者在出院时都会接受适当疗程的抗生素治疗。所有受试者都进行了粪便(如果可能的话，每天一次)的shigetec疫苗检测，直到至少2个连续样本呈阴性。如果脱落持续14天，则受试者将接受抗生素治疗，而不考虑是否有任何症状。所有受试者在免疫接种后随访60天，收集不良事件和血液样本。
[0265]
dsmb(数据安全监测委员会)对第一阶段安全性数据的审查宣布该研究可以进入第二阶段，并确定了shigetec疫苗的最佳疫苗剂量(ovd)，该研究的第二阶段是一项门诊双盲、安慰剂对照研究。在这一阶段，共有36名受试者(2名疫苗受试者对应一名安慰剂受试者)被纳入3个不同的组(每组12名受试者)。根据第1阶段的数据和dsmb的建议，第2阶段选择5
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10^10cfu(2、3或4剂)的疫苗剂量。正如第1阶段所述，每个给药方案之间的推进取决于前一给药方案的安全性(使用与第1阶段相同的安全性参数)是否令人满意。给药间隔的
选择根据对第1阶段受试者脱落持续时间的分析确定，目的是在脱落周期结束时或接近结束时给药。经dsmb审查，满足安全性参数，通过分析第1阶段中每个免疫剂量的安全性和脱落数据确定了shigetec的最佳剂量和时间表，并为第2阶段选择了3天的给药间隔(例如，四剂分别在第1、4、7和10天施用)。第二阶段在门诊进行。
[0266]
根据ich-gcp定义不良事件。该分级系统基于2017年11月27日发布的第5版不良事件通用术语标准(ctcae)。
[0267]
关于急性反应原性/耐受性评估，第1阶段住院期间，在免疫接种后2小时时及在免疫接种后的6天中，每天对参与者进行一份特定的体征和症状清单评估。在第2阶段，每个参与者在免疫接种后2小时离开医院前对照该体征和症状清单进行评估，然后在最后一剂疫苗接种后6天内由参与者自己在日记提醒卡上进行评估。评估的体征和症状清单有：恶心/呕吐、腹泻、腹痛、食欲不振、头痛、疲劳、肌肉疼痛、疾病或临床不良事件(根据适用规定定义)。
[0268]
安全性报告窗口被定义为从免疫接种当天开始，直到参与者接种最后一剂疫苗/安慰剂后60天。
[0269]
在没有未解决ae的情况下，对于第1阶段，由于每个参与者只施用一剂，这是在免疫后60天。类似地，对于第2阶段，这随分组和给药间隔而变化。该区间至少是92天至110天。
[0270]
所有不良事件均在规定的随访期内得到解决。没有因不良事件而退出。
[0271]
急性安全性定义为免疫接种后第1至6天与急性胃肠道和全身疾病症状相关的特定事件：包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发烧、肌肉/关节疼痛、疲劳/不适、头痛、食欲不振。
[0272]
反应原性定义为预期急性安全期体征和症状的数量和比例及其相关的毒性等级。第1阶段的反应原性事件由研究住院阶段的现场人员记录。第2阶段的反应原性事件由参与者在其主要住所(门诊)记录在提醒日记卡上，并在第10天与研究人员一起审查，记录在数据库中。急性安全性审查期间的意外事件记录为不良事件(ae)。
[0273]
实例8：高剂量shigetec在人类志愿者中的免疫原性
[0274]
根据最后一次免疫后的不同时间点(第6天、第10天和第28天)获得的血清样本，评估接种者的免疫反应。在elisa中测量对裂解疫苗株和ltb的免疫反应性，以分别评估对志贺氏菌抗原和异源表达的etec类毒素融合蛋白的反应。相对于相应的免疫前血清样品，免疫后任何时间点的血清，增加4倍以上都被认为是显著的。表1总结了不同疫苗队列中血清转化个体的数量(括号中的百分数)。
[0275]
血清转化率和抗体数量的增加与疫苗剂量(第1阶段)和接种疫苗次数(第2阶段)成比例(表1，图8)。对于1
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10^9和1
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10^10cfu队列，在组层面上没有观察到gmt(几何平均滴度)的增加，但只有在接种一次疫苗时，两个更高剂量(5
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10^10和2
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10^11cfu)的gmt才增加(图8a)。多次接种疫苗(每次剂量为5
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10^10)后，发现gmt随免疫接种次数成比例增加(图5b)。
[0276]
对ltb的免疫反应仅在单次免疫后的最高疫苗接种剂量(2
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10^11)下检测到。在每次接种5
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10^10cfu的多次疫苗接种的情况下，最多3次免疫都无法检测到对ltb的显著反应(即比基线水平增加4倍)。然而，在接受4剂疫苗的队列中，50％的接种者(8人中有4人)表现出对该抗原的血清转化。这表明，需要高剂量的疫苗株，优选多次接种，才能对异源抗原产生抗体反应。
[0277]
表1：不同队列中对shigetec裂解物出现》4倍血清转化的接种者人数(百分数)
[0278][0279]

技术特征：
1.一种志贺氏菌疫苗制剂，其包含10e8-10e12cfu的活的、遗传减毒的福氏志贺氏菌菌株，所述菌株包含染色体setba缺失，并且经sereny试验和使用hela细胞的体外侵袭试验确定是非侵袭性的，其中所述菌株包含经基因工程化并入表达病原体特异性抗原的异源表达构建体的内源性侵袭质粒。2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述福氏志贺氏菌菌株是福氏志贺氏菌2a型菌株或福氏志贺氏菌2b型菌株。3.根据权利要求1或2所述的疫苗制剂，其中所述内源性侵袭质粒编码经侵袭质粒的遗传修饰的失活的iii型分泌系统(t3ss)，优选其中遗传修饰包括表达t3ss组分的一种或多种基因的缺失或失活。4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗制剂，其中所述病原体特异性抗原选自细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原和寄生虫抗原。5.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其中所述病原体特异性抗原由产肠毒素大肠杆菌(etec)的不耐热毒素(ltb)的b亚单元和突变耐热毒素(stm)的融合物组成。6.根据权利要求5所述的疫苗，其中：a)所述ltb包含或由与seq id no:3至少90％相同的氨基酸序列组成；和b)所述stm包含或由seq id no:1、4、5、6、7、8或9中的任何一个序列组成。7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，其中所述异源表达构建体包含编码至少两种或至少三种所述抗原的核苷酸序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗，其中所述内源性侵袭质粒包含遗传修饰以掺入志贺氏菌必需基因，优选选自infa、ppa、accd、acps、dape、era、frr、ftsi、ftsl、ftsn、ftsz、lgt、lpxc、msba、mura、muri、nade、parc、pros、pyrb、rpsb、trma、rho和rhol，优选其中志贺氏菌必需基因与表达病原体特异性抗原的异源表达构建体整体插入。9.根据权利要求1至8中任一项所述的疫苗，其中，与没有染色体缺失的菌株相比，所述福氏志贺氏菌菌株通过染色体缺失一个或多个内源性基因减少lps-o-抗原而具有粗糙表型，优选其中所述内源性基因选自由rfb/wbb基因簇的基因、rfa/waa基因簇的基因、wzx、wzy/rfc和rfah组成的组。10.根据权利要求1至9中任一项所述的疫苗，其中所述福氏志贺氏菌菌株的特征在于基因型福氏志贺氏菌2457tδrfbfδipabcδinfaδsetba::infa-3
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[ltb-st(n12s)]。11.根据权利要求1至10中任一项所述的疫苗，其中所述福氏志贺氏菌菌株在药物制剂中提供，包括口服或粘膜制剂，优选为液体、粉末或片剂。12.根据权利要求1至11中任一项所述的疫苗，用于治疗受试者，诱导针对志贺氏菌，优选福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌中的任何一种或多种菌株所引发感染的免疫反应。13.根据权利要求1至11中任一项所述的疫苗，用于治疗受试者，诱导针对病原体特异性抗原对其具有特异性的病原体的免疫反应。14.根据权利要求12或13所述疫苗的用途，其中所述治疗诱导血清、粘膜和/或粪便免疫反应，优选诱导特异性iga、igg和/或igm抗体。15.根据权利要求12至14中任一项所述疫苗的用途，其中所述疫苗通过口服、鼻内或舌下或胃内途径施用。

技术总结
一种志贺氏菌疫苗制剂，其包含10E8-10E12CFU的活的、遗传减毒的福氏志贺氏菌菌株，所述菌株包含染色体setBA缺失，并且经Sereny试验和使用HeLa细胞的体外侵袭试验确定是非侵袭性的，其中所述菌株包含经基因工程化掺入表达病原体特异性抗原的异源表达构建体的内源性侵袭质粒。体的内源性侵袭质粒。


技术研发人员：E
受保护的技术使用者：埃韦利库雷生物技术有限公司
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2023/9/20