用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物及其应用和产品

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物及其应用和产品。


背景技术：

2.核酸体外扩增技术是生命科学研究中最常用的技术之一。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称pcr)发明于1983年，目前已经成为应用最为广泛的核酸扩增技术。该技术特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的控温循环仪，难以推广到现场检测。
3.近年来，随着分子生物学技术的不断发展，恒温核酸扩增技术的出现解决了pcr技术在仪器上的局限性。该技术不需要温度循环且反应更加快速，非常适用于资源有限地区的现场检测。目前已报道的恒温扩增技术有十几种。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，简称rpa)是一种由重组酶、单链dna结合蛋白和链置换bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强、灵敏度高，非常适用于疾病诊断和现场检测。
4.与rpa基础反应体系相比，实时荧光定量rpa是通过加入一个核酸外切酶ⅲ(exonucleaseⅲ，exo)和exo荧光探针(根据酶的名称命名为exo探针)对模板扩增实现实时监测。exo荧光探针上有一个脱碱基位点类似物
‑‑
四氢呋喃(thf)位点，在该位点两侧的胸腺嘧啶上分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团，此时荧光强度很低。当探针与靶序列结合时，thf位点就会被核酸外切酶ⅲ识别并酶解，将荧光基团与淬灭基团分开，使荧光基团荧光强度增强，以此实现模板扩增过程的实时监测。
5.但上述探针仍存在很多缺陷，如探针较长，无法对短序列核酸进行检测；探针合成成本高；需另加exo酶，增加了试剂成本。
6.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，以解决上述问题中的至少一种。
8.本发明的第二目的在于提供上述引物在制备核酸检测产品中的应用。
9.本发明的第三目的在于提供核酸检测试剂盒。
10.本发明的第四目的在于提供一种非疾病诊断或治疗目的的核酸检测方法。
11.本发明的第五目的在于提供一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物。
12.本发明的第六目的在于提供上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物在制备检测幽门螺旋杆菌的产品中的应用。
13.本发明的第七目的在于提供一种用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒。
14.第一方面，本发明提供了一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，包括上游引物和下游引物；
15.所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；
16.所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交，长链寡核苷酸的3’端与靶基因互补杂交。
17.作为进一步技术方案，所述长链寡核苷酸由40-60个核苷酸组成，其中与短链寡核苷酸互补的长度为10-30个核苷酸，与靶基因互补的长度为30-35个核苷酸；
18.所述短链寡核苷酸由10-30个核苷酸组成；
19.优选地，所述下游引物由30-35个核苷酸组成。
20.作为进一步技术方案，所述荧光基团包括fam、hex、tet、rox、cy3、cy5、vic、joe、sima、alexa fluor 488、texasred或quasar 670；
21.所述淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq-1、bhq-2、bhq-3、mgb或eclipse。
22.第二方面，本发明提供了上述引物在制备核酸检测产品中的应用。
23.第三方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，包括上述引物。
24.作为进一步技术方案，所述长链寡核苷酸和短链寡核苷酸的摩尔比为1：1～1：3，优选为1：2。
25.第四方面，本发明提供了一种非疾病诊断或治疗目的的核酸检测方法，采用上述引物，通过重组酶聚合酶恒温扩增的方法对待测核酸进行扩增，实现对待测核酸的检测。
26.第五方面，本发明提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物，包括上游引物和下游引物；
27.所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；
28.所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交；
29.所述长链寡核苷酸的序列如seq id no.1所示；
30.所述短链寡核苷酸的序列如seq id no.2所示；
31.所述下游引物的序列如seq id no.3所示。
32.第六方面，本发明提供了上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物在制备检测幽门螺旋杆菌的产品中的应用。
33.第七方面，本发明提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，包括上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物。
34.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
35.本发明提供的用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，设计简单、合成费用低，用于重组酶聚合酶恒温扩增中，具有检测敏感性高、特异性强、反应时间短、检测设备要求低的特点，且不依赖于exo酶活性。
36.本发明提供的用于检测幽门螺旋杆菌的引物，合成费用低、灵敏度高、特异性强，能够用于幽门螺旋杆菌相关疾病的诊断。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为本发明的引物实时荧光rpa恒温扩增原理图；
39.图2为本发明优化引物实时荧光rpa恒温扩增体系检测幽门螺旋杆菌(hp)dna结果；
40.图3为本发明引物实时荧光rpa-hp恒温扩增体系检测hp dna灵敏度结果；
41.图4为本发明引物实时荧光rpa-hp恒温扩增体系特异性结果；
42.图5为比较本发明与实时荧光探针法rpa检测hp dna结果。
具体实施方式
43.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
44.第一方面，本发明提供了一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，包括上游引物和下游引物；
45.所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；
46.所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交，长链寡核苷酸的3’端与靶基因互补杂交。
47.本发明引物的扩增检测原理如下：
48.如图1所示。首先合成两条长度不同具有互补序列的寡核苷酸链，其中长链寡核苷酸的5’末端连接荧光基团，链寡核苷酸的3’末端连接淬灭基团，通过高温变性使这两条链杂交，淬灭基团可淬灭荧光基团，无荧光产生；在rpa反应体系中存在待测基因时，通过上游长寡核苷酸链、下游普通引物与待测基因互补杂交延伸，下游引物延伸至上游长寡核苷酸链通过链置换作用，将其短寡核酸链与长寡核酸链分离，荧光基团发出的荧光不被淬灭基团吸收，溶液中产生荧光信号，且荧光强度与溶液中靶基因数量成正比，可进行定量测定。当溶液没有靶基因时，双链寡核酸链特异性结合，溶液没有荧光产生。
49.本发明提供的用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，设计简单、合成费用低，用于重组酶聚合酶恒温扩增中，具有检测敏感性高、特异性强、反应时间短、检测设备要求低的特点，且不依赖于exo酶活性。
50.在一些优选的实施方式中，所述长链寡核苷酸的长度例如可以为，但不限于40、45、50、55或60个核苷酸，其中与短链寡核苷酸互补的长度例如可以为，但不限于10、15、20、25或30个核苷酸，与靶基因互补的长度例如可以为，但不限于30、31、32、33、34或35个核苷酸；
51.所述短链寡核苷酸的长度例如可以为，但不限于10、15、20、25或30个核苷酸；
52.优选地，所述下游引物的长度例如可以为，但不限于30、31、32、33、34或35个核苷
酸。
53.通过对引物结构的进一步优化和调整，使得引物的灵敏度更高。
54.在一些优选的实施方式中，所述荧光基团包括fam、hex、tet、rox、cy3、cy5、vic、joe、sima、alexa fluor 488、texasred或quasar 670，或者本领域技术人员所熟知的其他荧光基团。
55.所述淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq-1、bhq-2、bhq-3、mgb或eclipse，或者本领域技术人员所熟知的其他淬灭基团。
56.第二方面，本发明提供了上述引物在制备核酸检测产品中的应用。
57.本发明提供的引物能够采用重组酶聚合酶恒温扩增的方法用于核酸的检测。
58.在一些优选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
59.第三方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，包括上述引物。
60.本发明提供的试剂盒包括上述引物，因此具有该引物的全部有益效果。
61.在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括：重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶，用于实现重组酶聚合酶恒温扩增。
62.在一些优选的实施方式中，所述长链寡核苷酸和短链寡核苷酸的摩尔比为1：1～1：3，优选为1：2。
63.第四方面，本发明提供了一种非疾病诊断或治疗目的的核酸检测方法，采用上述引物，通过重组酶聚合酶恒温扩增的方法对待测核酸进行扩增，实现对待测核酸的检测。
64.本发明提供的核酸检测方法灵敏度高、特异性强、反应时间短、检测设备要求低，且不依赖于exo酶活性，能够用于基因突变、基因分型或生命科学实验研究。
65.在一些优选的实施方式中，核酸检测方法的步骤可以如下：
66.1)根据靶基因的保守区域设置引物，得到荧光基团标记的长链寡核苷酸和所述淬灭基团标记的短链寡核苷酸，下游普通引物，扩增目的片段大小例如可以为80-300bp；
67.2)将荧光基团标记的长链寡核苷酸和所述淬灭基团标记的短链寡核苷酸的摩尔比为1：2混合，在98℃条件下变性2min，按0.2℃/s缓慢降温至25℃，制备成部分互补双链修饰上游引物；
68.3)以待测核酸为模板，分别用上述含部分互补双链修饰上游引物和所述下游普通引物进行rpa恒温扩增；
69.4)实时荧光检测扩增产物，实现对待测核酸的检测。
70.在一些优选的实施方式中，核酸检测包括实时荧光rpa、基因芯片以及膜杂交中的一种或多种。
71.第五方面，本发明提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物，包括上游引物和下游引物；
72.所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；
73.所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交；
74.所述长链寡核苷酸的序列如seq id no.1所示：
75.ccagctgaacggtacggcaacggcattaaataccgacctgcatg aatggcgtaacgag(seq id no.1)；
76.所述短链寡核苷酸的序列如seq id no.2所示：
77.tgccgtaccgttcagctgg(seq id no.2)；
78.所述下游引物的序列如seq id no.3所示：
79.gccaaagcccttacttcaaagcctcccacctat(seq id no.3)。
80.本发明提供的用于检测幽门螺旋杆菌的引物，合成费用低、灵敏度高、特异性强，反应时间短、检测设备要求低，能够用于幽门螺旋杆菌相关疾病的诊断。
81.第六方面，本发明提供了上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物在制备检测幽门螺旋杆菌的产品中的应用。
82.第七方面，本发明提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，包括上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物。
83.该试剂盒包括上述用于检测幽门螺旋杆菌的引物，因此具有该引物的全部有益效果。
84.在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括：重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶，用于实现重组酶聚合酶恒温扩增。
85.在一些优选的实施方式中，所述长链寡核苷酸和短链寡核苷酸的摩尔比为1：1～1：3，优选为1：2。
86.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
87.实施例1实时荧光rpa恒温扩增法检测hp dna
88.一、设计优化hp dna部分互补双链修饰引物和下游普通引物
89.引物设计原理：上游引物由长短不同但具有互补序列的两条寡核苷酸组成，长链寡核苷酸的5’末端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’末端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交，长链寡核苷酸的3’端与靶基因互补杂交。长链寡核苷酸由40-60个核苷酸组成，其中与短链寡核苷酸互补的长度为10-30个核苷酸，与靶基因互补的长度为30-35个核苷酸。短链寡核苷酸由10-30个核苷酸组成。下游引物由30-35个核苷酸组成。
90.根据上述引物设计原理，依照待测靶分子hp dna序列(genbank:cp116234.1)，设计合成三组用于检测hp dna的部分互补双链修饰引物和下游普通引物(组合1、组合2和组合3)进行筛选优化，并委托江苏赛索飞生物科技有限公司合成并纯化，序列见表1。
91.表1
[0092][0093]
注：下横线为与hp-短f互补序列。
[0094]
二、hp dna提取
[0095]
样本收集与dna提取：在知情同意基础上，收集5名河南省中医院临床幽门螺旋杆菌感染患者的胃黏膜样本。所有样本均使用天根生化科技(北京)有限公司的组织基因组dna提取试剂盒提取dna(货号：dp304)，使用sanger测序法鉴定该5名待测样本为hp基因。
[0096]
三、实时荧光rpa反应
[0097]
反应试剂为英国twistdx公司的rpa基础款扩增试剂盒(货号：tabas03kit)，反应体系配置方法：向每管冻干粉中加入29.5μl rehydration buffer(twistdx公司)，加入双链寡核苷酸(hp-长f与hp-短f摩尔比为1：2高温变性杂交)0.3μmol/l，下游普通引物hp-r 0.2μmol/l，补ddh2o 48μl，轻轻混匀，简易离心，将其一分为二(每份24μl)至pcr反应管中，每管加入2μl hp dna模板或阴性对照(ddh2o)，在管盖内壁上加入2.5μl 140mm的mgoac，上机前将mgoac离心至管中，混匀，立即进行上机检测。
[0098]
反应条件：37℃，30min；每30s采集一次fam通道荧光信号，所用荧光定量pcr仪器为abi7500。
[0099]
反应曲线见图2，组合1-3的hp dna反应孔呈明显的扩增曲线，且组合1的扩增信号最强，而阴性对照孔无扩增曲线产生，表明该体系可特异性检测到hp dna。
[0100]
实施例2部分互补双链修饰引物实时荧光rpa-hp恒温扩增体系检测hp dna灵敏度
[0101]
将数字pcr定量的hp dna(原液为5.8x106拷贝/ml)进行稀释，浓度依次为1x106拷贝/ml、1x105拷贝/ml、1x104拷贝/ml、1x103拷贝/ml、5x102拷贝/ml、1x102拷贝/ml，ddh2o为阴性对照。按照实施例1的方法采用组合1的引物进行检测，测试其检测限。检测结果如图3
所示，1x106拷贝/ml～5x102拷贝/ml模板均有荧光扩增曲线，1x102拷贝/ml和ddh2o组无扩增曲线，表明该体系检测hp dna的检测限为500拷贝/ml。
[0102]
实施例3部分互补双链修饰引物实时荧光rpa-hp恒温扩增体系检测hp dna特异性
[0103]
特异性验证样本核酸：幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、诺如病毒、轮状病毒a组、肠道病毒71型，来源为本实验室临床检测样本保存。
[0104]
根据实施例1的方法采用组合1的引物进行检测，结果如图4所示。由图4扩增曲线可见，本研究建立的检测方法检测hp dna呈阳性扩增曲线，而消化道常见的其他病原体样本均未有阳性扩增反应，说明本方法具有较好的特异性，不会产生假阳性扩增。
[0105]
实施例4比较部分互补双链修饰引物实时荧光rpa(rpa-1)与实时荧光探针法rpa(rpa-2)检测hp dna
[0106]
依照待测靶分子hp dna序列(genbank:cp116234.1)，设计合成用于检测hp dna的实时荧光探针法rpa引物与探针，并委托江苏赛索飞生物科技有限公司合成并纯化，序列见表2，反应试剂为英国twistdx公司的rpa实时荧光探针法扩增试剂盒(货号：talqexo01)，反应体系配置方法：缓冲液25μl、上游引物0.2μmol/μl、下游引物0.2μmol/μl、探针0.1μmol/μl、补ddh2o至48μl。轻轻混匀，简易离心，将其一分为二(每份24μl)至pcr反应管中，每管加入2μl hp dna模板或阴性对照(ddh2o)，在管盖内壁上加入2.5μl 140mm的mgoac，上机前将mgoac离心至管中，混匀，立即进行上机检测，即刻置于荧光定量pcr仪进行反应。荧光rpa反应条件：37℃30min，每30s收集一次fam通道荧光信号。部分互补双链修饰引物实时荧光rpa检测hp dna的引物为实施例1中的组合1，采用实施例1的方法进行检测。上述两种方法同时检测3个不同浓度的样本hp dna(浓度依次为1x103拷贝/ml、5x102拷贝/ml、1x102拷贝/ml)。
[0107]
结果如图5所示，部分互补双链修饰引物实时荧光rpa表示为rpa-1，实时荧光探针法rpa表示为rpa-2，当样本浓度≥5x102拷贝/ml时该两种方法均可出现显著荧光扩增，其ct值与荧光信号均相近；当样本浓度≤1x102拷贝/ml时，与空白对照扩增曲线一致，未出现荧光扩增，表明该两种方法检测灵敏度相近。
[0108]
表2
[0109][0110]
注：上述hp-rpa-p为修饰后的探针，修饰包括：采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，两个基团之间间隔了1个碱基t和1个碱基g，其中碱基a用四氢呋喃残基替换，修饰前探针的序列如seq id no.9所示：
[0111]
tgggagctgtctcaaccagagattcagtgaaattgtagtggagg tgaaa(seq id no.9)。
[0112]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交，长链寡核苷酸的3’端与靶基因互补杂交。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述长链寡核苷酸由40-60个核苷酸组成，其中与短链寡核苷酸互补的长度为10-30个核苷酸，与靶基因互补的长度为30-35个核苷酸；所述短链寡核苷酸由10-30个核苷酸组成；优选地，所述下游引物由30-35个核苷酸组成。3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述荧光基团包括fam、hex、tet、rox、cy3、cy5、vic、joe、sima、alexa fluor 488、texasred或quasar 670；所述淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq-1、bhq-2、bhq-3、mgb或eclipse。4.权利要求1-3任一项所述的引物在制备核酸检测产品中的应用。5.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物。6.根据权利要求5所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述长链寡核苷酸和短链寡核苷酸的摩尔比为1：1～1：3，优选为1：2。7.一种非疾病诊断或治疗目的的核酸检测方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的引物，通过重组酶聚合酶恒温扩增的方法对待测核酸进行扩增，实现对待测核酸的检测。8.一种用于检测幽门螺旋杆菌的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交；所述长链寡核苷酸的序列如seq id no.1所示；所述短链寡核苷酸的序列如seq id no.2所示；所述下游引物的序列如seq id no.3所示。9.权利要求8所述的引物在制备检测幽门螺旋杆菌的产品中的应用。10.一种用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的引物。

技术总结
本发明提供了一种用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物及其应用和产品，涉及生物技术领域。本发明提供的用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增的引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物由长链寡核苷酸和短链寡核苷酸组成；所述长链寡核苷酸的5’端连接荧光基团，短链寡核苷酸的3’端连接淬灭基团，长链寡核苷酸的5’端与短链寡核苷酸的3’端互补杂交，长链寡核苷酸的3’端与靶基因互补杂交。该引物，设计简单、合成费用低，用于实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增中，具有检测敏感性高、特异性强、反应时间短、检测设备要求低的特点，且不依赖于exo酶活性。赖于exo酶活性。赖于exo酶活性。


技术研发人员：吴鸿 高水波 韩勇军 常红波 施伟丽 刘珊珊 闫京京 曹盼夏
受保护的技术使用者：河南中医药大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/20