一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂及制备方法与应用与流程

1.本发明属于功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂及制备方法与应用。


背景技术：

2.硒元素为动物和人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化酶的活性中心，对水产动物的生长起着重要作用，适当的补硒能增强水产动物的抗氧化能力、免疫能力等。例如，硒能够提高清除自由基相关酶的活性，从而增强机体的抗氧化能力；而且硒还能通过信号通路调节鲤鱼的炎症反应等。但是，硒的安全含量范围十分狭窄，大多数水产动物饲料最适硒浓度为1mg/kg，若低于或高于此值过多，都会对水产动物产生巨大影响。硒浓度过低时会导致硒的缺乏，进而导致水产动物食欲不振，诱发炎症等；硒浓度过高，会产生中毒现象，进而导致水产动物器官损伤甚至死亡。并且无机硒的毒性很强，溶于水，不仅会影响水产动物本身，还会对水体造成影响，所以研究合理的硒形态作为饲料添加剂具有重要意义。目前多以有机硒如酵母硒为硒源来为水产动物补硒，但近期关于微生物还原亚硒酸钠生成的纳米硒的研究也表明水产动物能够利用纳米硒，并且补硒方式更加安全。
3.水产动物中大口黑鲈生长较快，当年繁殖的鱼苗能长到0.5公斤，达到上市规格。一周龄的鱼就性成熟，即可繁殖，无论在池中单养还是在鱼塘中混养，都能有效地控制鱼塘中野杂鱼虾和罗非鱼的过度繁殖，有诸多优点，是值得大力推广的优良养殖品种。因此，如何制备一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂，并将其用于制备大口黑鲈的饲料中，进一步提高大口黑鲈的生长性能是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂及制备方法与应用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种富含生物纳米硒的发酵饲料的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将地衣芽孢杆菌接种至lb固体培养基中，挑取单菌落；
8.(2)将所述单菌落置于装有10ml lb液体培养基的细菌培养瓶中，恒温振荡培养，得到一级种子液；
9.(3)将所述一级种子液接种至装有100ml lb液体培养基的三角瓶中，再次恒温振荡培养，得到二级种子液；
10.(4)将所述二级种子液接种至装有固态发酵培养基的组培瓶中进行恒温培养，得到的发酵料即为所述富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂；所述固态发酵培养基由饲料原料与亚硒酸钠混合而成。
11.有益效果：本发明采用地衣芽孢杆菌作为发酵菌种，其作为益生菌，对水产动物有较多益处，尤其是可以预防大口黑鲈烂鳃等疾病的发生，还可以分解养殖池中的有毒有害
物质，净化水质，另外还能促进饲料营养素降解，让饲料更易被大口黑鲈吸收。
12.进一步地，步骤(1)中所述lb固体培养基由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏、10％nacl和1.5％琼脂，其余为水。
13.进一步地，步骤(2)和(3)中所述lb液体培养基由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏和10％nacl，其余为水；
14.所述恒温振荡培养均为在温度37℃，转速180rpm下振荡培养12h。
15.有益效果：本发明中先将菌株接活，然后进行扩大培养，为后续固态发酵做准备。而且本发明选择lb培养基为制备种子液培养基，其成分简单，易于配制，且能够使地衣芽孢杆菌d1有较好地生长。
16.进一步地，步骤(3)中所述一级种子液的接种量为1％。
17.进一步地，步骤(4)中所述固态发酵培养基的制备方法为：将na2seo3水溶液以料液比为1∶1加入至固态发酵培养基的原料中得到；
18.其中，所述固态发酵培养基的原料包括以下重量份数的原料：50份麸皮、20份豆粕粉、10份玉米粉、0.3份磷酸氢二钾、0.6份硫酸镁、0.05份硫酸锰和5份碳酸钙；所述na2seo3水溶液的浓度为0.2mg/ml，使其在加入至固态发酵培养基的原料中后形成的固态发酵培养基中na2seo3的浓度为0.1mg/g；
19.所述恒温培养的温度为37℃，培养时间为48h；所述恒温培养前还需要用石灰调节ph至7.0。
20.有益效果：本发明采用地衣芽孢杆菌还原亚硒酸钠进而得到纳米硒，将纳米硒作为饲料添加剂来喂养大口黑鲈，使制备的添加剂具有硒和地衣芽孢杆菌的双重功效，可以进一步提高大口黑鲈的生长性能。
21.本发明还提供了一种采用上述制备方法制备得到的发酵饲料添加剂。
22.本发明还提供了一种上述发酵饲料添加剂在大口黑鲈的饲料中的应用。
23.本发明还提供了一种地衣芽孢杆菌耐受亚硒酸钠的筛选方法(富硒地衣芽孢杆菌的筛选和驯化)，具体为：
24.(1)配制浓度为60mg/ml的na2seo3溶液作为母液，然后进一步将其配制成浓度分别为0、0.1、2、5、10、15、20、25、30mg/ml的na2seo3溶液，再分别将其加入至lb固体培养基平板上，得到含有不同浓度na2seo3的lb固体培养基平板，将地衣芽孢杆菌接种在lb固体培养基平板中，在含有最低浓度(除0以外的最低浓度)的na2seo3的lb固体培养基平板上进行平板划线，然后挑取单菌落到含有高一级别浓度的na2seo3的lb固体培养基平板上进行划线，重复上述操作，直至无菌落长出，确定地衣芽孢杆菌能耐受的最高na2seo3浓度；
25.(2)根据地衣芽孢杆菌在含有不同浓度na2seo3的lb固体培养基平板上的生长情况，发现na2seo3的浓度越高，对地衣芽孢杆菌的生长抑制性越强。因此，在本发明中使用na2seo3浓度为0.1mg/g的固态发酵培养基生产地衣芽孢杆菌的富硒发酵料。
26.有益效果：本发明通过对地衣芽孢杆菌的筛选过程完成了对地衣芽孢杆菌的驯化，从含有低浓度的na2seo3培养基接种至含有高浓度的na2seo3培养基中，延长培养时间，完成驯化，使其能够耐受更高浓度的na2seo3。
27.进一步地，所述lb固体培养基由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏、10％nacl和1.5％琼脂，其余为水。
28.本发明还提供了一种分析富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料中硒组分的方法。
29.本发明用地衣芽孢杆菌还原含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基后，通过原子荧光光谱法得到残留的na2seo3含量和总硒含量，然后通过na2s显色法测量所生成的单质硒，用总硒含量减去残留的na2seo3含量和单质硒含量，即为所生成的有机硒含量。
30.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
31.本发明利用地衣芽孢杆菌还原亚硒酸钠来制备一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂，该制备方法易于生产，且采用地衣芽孢杆菌产生的红色纳米硒毒性低，能够被水产动物利用。并且将该发酵饲料添加剂用于大口黑鲈的饲料中来喂养大口黑鲈，显著增加了该种鱼的肌肉含硒量，缓解肝炎症，增强肝组织抗氧化能力。而且本发明中的经过筛选和驯化后的地衣芽孢杆菌能够耐受较高浓度的亚硒酸钠，最高可达到30mg/ml。
附图说明
32.构成本技术的一部分的附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
33.图1为实施例1中地衣芽孢杆菌在不同浓度的na2seo3的lb固体培养基平板上生长的平板示意图；
34.其中，图a中的上方的图为在含有浓度0mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，左下方的图为在含有浓度0.1mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，右下方的图为在含有浓度2mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图；图b中的上方的图为在含有浓度5mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，左下方的图为在含有浓度10mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，右下方的图为在含有浓度15mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图；图c中的上方的图为在含有浓度20mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，左下方的图为在含有浓度25mg/ml的na2seo3溶液的lb固体培养基平板上生长的平板示意图，右下方的图为在含有浓度30mg/ml溶液的na2seo3的lb固体培养基平板上生长的平板示意图；
35.图2为实施例3中地衣芽孢杆菌在含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基中培养0-48h残留的na2seo3浓度随时间变化的曲线图；
36.图3为实施例3中单质硒标准曲线图；
37.图4为实施例3中地衣芽孢杆菌在含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基中培养0-48h单质硒生成量随时间变化的曲线图；
38.图5为富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料作为大口黑鲈饲料添加剂后，实验组与对照组肌肉组织含硒量的差异图；
39.图6为富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料作为大口黑鲈饲料添加剂后，实验组与对照组血清生化指标的差异图；
40.图7为富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料作为大口黑鲈饲料添加剂后，实验组与对照组肝组织gsh-px活性的差异图；
41.图8为富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料作为大口黑鲈饲料添加剂后，实验组与对照组肝组织mda含量的差异图。
具体实施方式
42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
45.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
46.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
47.本发明的实施例中所述lb固体培养基平板均由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏、10％nacl和1.5％琼脂，其余为水。
48.实施例1
49.富硒地衣芽孢杆菌d1的筛选和驯化，具体包括以下步骤：
50.将保存的地衣芽孢杆菌d1在lb固体培养基平板上划线，37℃恒温培养箱培养24h后挑取单菌落于lb固体培养基中，37℃，180rpm恒温振荡器中培养24h，完成接活。
51.配制浓度为60mg/ml的na2seo3溶液作为母液，然后进一步将其配制成浓度分别为0、0.1、2、5、10、15、20、25、30mg/ml的na2seo3溶液，再分别将其加入至lb固体培养基平板上，得到含有不同浓度na2seo3的lb固体培养基平板，将地衣芽孢杆菌接种在lb固体培养基平板中，接着将单菌落菌液用接种环在含有最低浓度(除0以外的最低浓度)的na2seo3的lb固体培养基平板上进行平板划线，在37℃的恒温培养箱培养24h，待菌落长出后，继续挑取单菌落至下一个浓度梯度的lb固体培养基平板上划线，直至延长培养时间至72h或更长时间无菌落长出时，表示最高能耐受na2seo3浓度为上一级浓度。地衣芽孢杆菌在不同浓度的na2seo3的lb固体培养基平板上生长的平板示意图如图1所示。
52.实施例2
53.一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
54.(1)将实施例1筛选和驯化的地衣芽孢杆菌接种到lb固体培养基平板(10％蛋白胨、5％酵母膏、10％nacl和1.5％琼脂，其余为水)上，挑取单菌落；
55.(2)将步骤(1)中挑取的单菌落置于装有10ml lb液体培养基(10％蛋白胨、5％酵母膏和10％nacl，其余为水)的25ml的细菌培养瓶中，在37℃、转速为180rpm下恒温振荡培养12h，得到一级种子液；
56.(3)以接种量1％将步骤(2)得到的一级种子液接种至装有100ml lb液体培养基(10％蛋白胨、5％酵母膏和10％nacl，其余为水)的三角瓶中，再次在37℃、转速为180rpm下恒温振荡培养12h，得到二级种子液；
57.(4)以接种量5％将步骤(3)得到的二级种子液接种至装有固态发酵培养基的组培瓶中，在37℃下培养48h，用石灰调节ph至7.0，得到的发酵料即为富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂。其中，固态发酵培养基为：将浓度为0.2mg/ml的na2seo3水溶液以料液比为1∶1加入至固态发酵培养基的原料中得到，使固态发酵培养基中的na2seo3浓度为0.1mg/g；固态发酵培养基的原料包括以下重量份数的原料：50份麸皮、20份豆粕粉、10份玉米粉、0.3份磷酸氢二钾、0.6份硫酸镁、0.05份硫酸锰和5份碳酸钙。
58.实施例3
59.对富硒地衣芽孢杆菌发酵料中硒组成成分的分析，具体为：
60.富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料硒组成成分分析
61.(1)将地衣芽孢杆菌d1以5％接种量接种到含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基中，以未接种na2seo3的固态发酵培养基为对照。然后立即取样，本次取样时间点记为0h，后续每隔8h取样，至48h。每次取样2g，加水至2ml，以12000rpm，离心10min。
62.(2)取1ml上清液，用原子荧光光谱仪(北京吉天仪器有限公司)测量se
4+
浓度，进而得出残留的na2seo3浓度，测量结果如表1所示。其中，地衣芽孢杆菌在含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基中培养0-48h残留的na2seo3浓度随时间变化的曲线图如图2所示。
63.表1
[0064][0065]
(3)将样品中的上清液吸出，得到离心后所获得的菌体，将菌体用1mnacl溶液清洗3次，每次清洗后在12000rpm下离心15min，完成清洗后吸出nacl溶液，加入2ml 1m na2s溶解所得沉淀，20min(期间轻柔混匀数次)后在12000rpm下离心15min，将得到的上清液用紫外分光光度计(屹普仪器制造有限公司，型号为u-t3c)在490nm处测量吸光值。对比单质硒标准曲线(如图3所示)得出培养基中所含单质硒的量，结果如表2所示，其中，地衣芽孢杆菌在含有0.1mg/g的na2seo3的固态发酵培养基中培养0-48h单质硒生成量随时间变化的曲线
图如图4所示。
[0066]
表2
[0067][0068][0069]
0h时所测得的上清液中na2seo3浓度为总硒浓度，有机硒浓度为总硒浓度减去上述上清液中经过还原后残留的na2seo3浓度和所生成的单质硒量，由图2可以看出，16h时地衣芽孢杆菌d1已完成对na2seo3的还原。根据生成单质硒的量可知(理论上完成2g培养基中na2seo3的还原所生成的红色单质硒(纳米硒)为0.082mg，实际测得的单质硒含量为0.087mg)，所有na2seo3完全转化为了纳米硒，则生成的有机硒量为0。
[0070]
应用例
[0071]
将实施例2制备富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂加入到大口黑鲈的普通饲料(购买于浙江欣欣天恩水产饲料股份有限公司)中，得到硒含量为1mg/kg的饲料；
[0072]
选取初重为9.68
±
0.3g的大口黑鲈，每个养殖池饲养32条，以喂养上述硒浓度为1mg/kg的饲料的大口黑鲈为实验组，以喂养普通饲料的大口黑鲈为对照组，每组做3个重复；养殖完成后取样，每个养殖池随机取4条，每个组共12条。
[0073]
1、富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料对大口黑鲈的肌肉组织的影响
[0074]
从采集的12条大口黑鲈中随机取3条，将大口黑鲈解剖，取肌肉组织，然后根据gb 5009.93-2017《食品中硒的测定》对大口黑鲈的肌肉组织中的硒含量进行测定，测定结果如表3所示。
[0075]
表3
[0076][0077]
由表3可知，实验组和对照组相比，喂养硒浓度为1mg/kg的饲料的大口黑鲈的肌肉
组织中含硒量明显上升。其中，实验组和对照组的肌肉组织含硒量的差异图如图5所示。
[0078]
2、富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料对大口黑鲈的血清生化指标的影响
[0079]
从采集的12条大口黑鲈中再次随机取3条，从其尾部取血后进行血清生化指标检测，其中，血清生化指标包括谷丙转氨酶、碱性磷脂酶和谷草转氨酶，测定结果如表4所示。
[0080]
表4
[0081][0082]
由表4可知，实验组和对照组相比，大口黑鲈血清中谷丙转氨酶、碱性磷脂酶和谷草转氨酶均有显著性降低，其中，实验组与对照组血清生化指标的差异图如图6所示。谷丙转氨酶、碱性磷脂酶和谷草转氨酶这三种酶含量上升代表着大口黑鲈的肝可能患有炎症，而喂养添加了本发明制备的饲料添加剂后的大口黑鲈的谷丙转氨酶、碱性磷脂酶和谷草转氨酶的含量得到了降低，说明富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料对大口黑鲈的肝炎症有缓解作用。
[0083]
3、富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料对大口黑鲈的肝组织的影响
[0084]
从采集的12条大口黑鲈中再次随机取3条进行解剖后，取肝组织，并将所得到的肝组织制成20％匀浆，采用南京建成谷胱甘肽过氧化酶测定试剂盒(比色法)测量gsh-px活性，结果如表5所示；采用南京建成丙二醛(mda)测定试剂盒(tba法)测量肝组织中mda含量，结果如表6所示。
[0085]
表5
[0086][0087]
由表5可知，实验组和对照组相比，肝组织gsh-px活性有显著上升，说明富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料能够显著增强大口黑鲈的抗氧化能力。其中，实验组与对照组肝组织gsh-px活性的差异图如图7所示。
[0088]
表6
[0089][0090]
由表6可知，实验组和对照组相比，肝组织中的mda含量有明显降低，说明富硒地衣芽孢杆菌d1发酵料能够显著增强大口黑鲈的抗氧化能力。其中，实验组与对照组肝组织mda含量的差异图如图8所示。
[0091]
综上，本发明制备的富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂，能够显著提高大口黑鲈的肌肉含硒量，缓解肝炎症，增强肝组织抗氧化能力。
[0092]
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将地衣芽孢杆菌接种至lb固体培养基中，挑取单菌落；(2)将所述单菌落置于装有10mllb液体培养基的细菌培养瓶中，恒温振荡培养，得到一级种子液；(3)将所述一级种子液接种至装有100mllb液体培养基的三角瓶中，再次恒温振荡培养，得到二级种子液；(4)将所述二级种子液接种至装有固态发酵培养基的组培瓶中进行恒温培养，即得到所述富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂；所述固态发酵培养基由饲料原料与亚硒酸钠混合而成。2.根据权利要求1所述的一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述lb固体培养基由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏、10％nacl和1.5％琼脂，其余为水。3.根据权利要求1所述的一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所述lb液体培养基由以下质量分数的原料组成：10％蛋白胨、5％酵母膏和10％nacl，其余为水；所述恒温振荡培养均为在温度37℃，转速180rpm下振荡培养12h。4.根据权利要求1所述的一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述一级种子液的接种量为1％。5.根据权利要求1所述的一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述固态发酵培养基的制备方法为：将na2seo3水溶液以料液比为1∶1加入至固态发酵培养基的原料中得到；其中，所述固态发酵培养基的原料包括以下重量份数的原料：50份麸皮、20份豆粕粉、10份玉米粉、0.3份磷酸氢二钾、0.6份硫酸镁、0.05份硫酸锰和5份碳酸钙；所述na2seo3水溶液的浓度为0.2mg/ml；所述恒温培养的温度为37℃，培养时间为48h；所述恒温培养前还需要用石灰调节ph至7.0。6.如权利要求1-5任一项所述的一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂的制备方法制备得到的发酵饲料添加剂。7.如权利要求6所述的发酵饲料添加剂在大口黑鲈的饲料中的应用。

技术总结
本发明公开了一种富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂及制备方法与应用，属于功能微生物筛选及应用领域。具体方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基中，挑取单菌落；将其置于装有LB液体培养基的细菌培养瓶中培养，得到一级种子液；将其接种至装有LB液体培养基的三角瓶中培养，得到二级种子液；最后将其接种至装有由饲料原料与亚硒酸钠混合而成的固态发酵培养基的组培瓶中培养，即得到发酵饲料添加剂。本发明采用地衣芽孢杆菌还原亚硒酸钠制备富含生物纳米硒的发酵饲料添加剂，生成的红色纳米硒毒性低，能够被水产动物利用。并且将该发酵饲料添加剂用于饲料中喂养大口黑鲈，增加了鱼的肌肉含硒量，缓解肝炎症，增强肝组织抗氧化能力。氧化能力。氧化能力。


技术研发人员：李英俊 李晓虎 李克克 梁运祥
受保护的技术使用者：河南金百合生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/20