维生素D3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用的制作方法

维生素d3在制备缓解由
β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用
技术领域
1.本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。


背景技术：

2.食物过敏是当反复暴露于特定食物中时，机体产生不良特异性免疫反应的现象。90％以上食物过敏反应是由八大类食物引起的，包括牛奶、鸡蛋、花生、大豆、小麦、坚果、鱼和水生贝壳类动物。对婴幼儿而言，最常见的食物致敏原为鸡蛋，其次是牛奶、虾和鱼。美国一项调查研究估计10.8％的人对食物过敏，而婴幼儿食物过敏患病率比成年人更高。日本调查显示在婴儿中食物过敏患病率为5-10％，幼儿患病率为13％。2013年中国居民营养与健康监测项目数据显示2至3岁幼儿患食物过敏病率在4.37％。2017年中国儿童食物过敏问卷调查中，儿童食物过敏发生率为5.83％。最新调查研究显示中国牛乳过敏婴幼儿食物过敏的发生率为2.69％。
3.食物过敏是一种免疫疾病，是免疫失调和正常口服耐受性丧失的结果。食物过敏的免疫机制均为对摄入的抗原产生的反应：一是速发型过敏反应，主要为ige介导的过敏反应，特异性ige抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合，触发介质的释放，导致迅速的生理反应。与其对应的为迟发型过敏反应，迟发型过敏性炎症过程主要局限于肠道，是食物蛋白诱导的直肠结肠炎、小肠结肠炎和嗜酸性食管炎综合征的基础。婴幼儿免疫系统发育不完善，相较成人来说，更易发生食物过敏。
4.食物过敏症状主要有皮肤、胃肠道和呼吸道症状。对于婴幼儿来说皮肤症状多为急性荨麻疹，特应性皮炎及血管性水肿；胃肠道症状为腹泻、呕吐、便秘，严重患者可能存在便血或者休克，非ige介导过敏患者可能患有嗜酸性食管炎、结肠炎；呼吸道症状有过敏性鼻炎、结膜炎、哮喘等。
5.婴幼儿过敏的营养素干预最先被关注的是维生素d营养干预，早在2007年，camargo等人首次报道了发达国家治疗食物过敏的主要方法—肾上腺素自动注射针在美国存在着纬度梯度，日照较少的北方地区处方使用率比南方高出4倍，而紫外线能促进维生素d的合成，这个报道引发了对维生素d干预效果的广泛研究，由此食物过敏的营养素干预逐渐走入人们的视野，如今研究较多的也是对婴幼儿的维生素和脂肪酸营养干预效果。一个基于沙特阿拉伯人群的哮喘研究中显示：过敏患者饮食中摄入定量膳食纤维、维生素e、镁、钙、钠和钾均明显少于正常人群，这也提示了营养素干预和免疫类疾病有一定的关联性。维生素在免疫系统中起着重要作用。有研究表明，维生素及其代谢产物能够通过影响固有免疫应答和适应性免疫应答，发挥重要调节作用。其中，效果最显著的是作为重要抗氧化剂的脂溶性维生素a、d和e。
6.目前国内外对于维生素d与食物过敏的关系的研究多是流行病学调查，有的甚至是通过问卷调查形式来评估维生素d摄入量，不能准确反映体内真实的维生素d状态，仅少
量的临床研究是通过检测25-(oh)d来反映体内维生素d水平，目前尚缺乏维生素d与食物过敏很多相关的实验研究。所以维生素d与食物过敏关系还需要更多的研究。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
8.本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
9.优选的，所述过敏反应包括胃肠道过敏反应、皮肤过敏反应和/或呼吸道过敏反应。
10.优选的，所述婴幼儿牛乳胃肠道过敏反应包括腹泻、呕吐或便秘中的一种或几种。
11.优选的，所述皮肤过敏反应包括急性荨麻疹、特应性皮炎或血管性水肿。
12.优选的，所述呼吸道过敏反应包括过敏性鼻炎、结膜炎或哮喘中的一种或几种。
13.优选的，所述维生素d3的剂量为0.55～5.54μg/kg
·
bw。
14.优选的，所述缓解包括：减少th2型细胞因子的分泌、增加th1型细胞因子的分泌或调控体内th1/th2平衡向正常水平发展。
15.优选的，所述缓解包括：降低组胺炎症水平或降低血清中β-乳球蛋白特异性抗体水平。
16.优选的，所述β-乳球蛋白特异性抗体包括ige、igg、igg1和iga。
17.优选的，所述缓解包括：改善小肠绒毛破损。
18.与现有技术相比，本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。本发明构建caco-2细胞模型，评估维生素d2和维生素d3的生物安全性及跨细胞膜的转运吸收能力。采用不同致敏阶段的维生素d3干预，结合临床病理特征、血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1和iga的水平、空肠he染色和脾细胞分泌细胞因子等方面评估了维生素d3对牛乳过敏幼鼠的缓解作用。实验结果表明：维生素d3的转运吸收量是维生素d2的2倍左右。对致敏幼鼠进行长期的维生素d3干预可显著降低幼鼠血清中特异性抗体水平、修复肠道屏障，调节幼鼠体内th1/th2平衡。因此维生素d3可以用于制备缓解牛乳过敏的婴幼儿配方奶粉。
附图说明
19.图1为实施例1中维生素d对caco-2细胞生物安全性评价；
20.图2为实施例1中维生素d跨细胞膜的转运吸收能力；
21.图3为实施例1中幼鼠致敏造模期间体重变化；
22.图4为实施例1中幼鼠过敏症状评分；
23.图5为实施例1中幼鼠激发不同阶段体温；
24.图6为实施例1中幼鼠血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga的水平；
25.图7为实施例1中幼鼠血清中组胺的水平；
26.图8为实施例1中幼鼠脾细胞分泌细胞因子水平；
27.图9为实施例1中幼鼠空肠组织的he染色结果；
28.图10为实施例1中动物分组及处理；
29.图11为实施例2幼鼠血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga的水平；
30.图12为实施例2中幼鼠血清中组胺的水平；
31.图13为实施例2中幼鼠脾细胞分泌细胞因子水平；
32.图14为实施例2动物分组及处理。
具体实施方式
33.本发明提供了本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
34.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示:单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a,b可以是单数或者复数。
35.除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。
36.本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白(blg)引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
37.本发明所述过敏反应包括胃肠道过敏反应、皮肤过敏反应和/或呼吸道过敏反应。
38.在本发明其中一部分实施方式中，本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白(blg)引起的胃肠道过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
39.在本发明其中一部分实施方式中，本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白(blg)引起的皮肤过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
40.在本发明其中一部分实施方式中，本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白(blg)引起的呼吸道过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。
41.食物过敏症状主要有皮肤、胃肠道和呼吸道症状。
42.对于婴幼儿来说皮肤症状多为急性荨麻疹，特应性皮炎及血管性水肿；胃肠道症状为腹泻、呕吐、便秘，严重患者可能存在便血或者休克，非ige介导过敏患者可能患有嗜酸性食管炎、结肠炎；呼吸道症状有过敏性鼻炎、结膜炎、哮喘等。
43.作为本发明的一种优选实施方式，前述应用中，维生素d的种类为维生素d3，剂量为为0.55～5.54μg/kg
·
bw，优选具体为0.55ug/kg、2.77ug/kg或5.54ug/kg；或者上述任意二者之间的点值。
44.本发明上述剂量为本领域技术人员熟知的根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值计算。
45.例如，小鼠给药剂量折算为人体剂量折算比值为387.9，已知每日20g小鼠摄入剂量为0.1μg、0.5μg、1μg，等效剂量折算人体为0.1*389.7/70＝0.55ug/kg；0.5*387.9/70＝
2.77ug/kg；1*387.9/70＝5.54ug/kg。
46.本发明的目的在于提供一种一周龄幼鼠的牛乳过敏模型，其中过敏原为β-乳球蛋白。进行四次blg的腹腔注射致敏和两次blg的灌胃激发。腹腔注射blg剂量为25μg，灌胃激发blg剂量为5mg。通过在三、四致敏后采血清检测β-乳球蛋白特异性ige的水平来判断致敏效果。
47.本发明的目的在于提供一种维生素d3干预牛乳过敏幼鼠的构建方法，其特征在于使用维生素d3进行灌胃干预，一周四次，共28次。维生素d3的剂量为100μg/kg
·
bw。
48.本发明采取腹腔注射致敏和灌胃激发相结合的方式构建动物致敏模型。
49.按照本发明，所述缓解包括：减少th2型细胞因子的分泌、增加th1型细胞因子的分泌或调控体内th1/th2平衡向正常水平发展。
50.按照本发明，所述缓解包括：降低组胺炎症水平或降低血清中β-乳球蛋白特异性抗体水平。所述β-乳球蛋白特异性抗体包括ige、igg、igg1和iga。
51.按照本发明，所述缓解包括：改善小肠绒毛破损。
52.本发明提供了维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。本发明构建caco-2细胞模型，评估维生素d2和维生素d3的生物安全性及跨细胞膜的转运吸收能力。采用不同致敏阶段的维生素d3干预，结合临床病理特征、血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1和iga的水平、空肠he染色和脾细胞分泌细胞因子等方面评估了维生素d3对牛乳过敏幼鼠的缓解作用。实验结果表明：维生素d3的转运吸收量是维生素d2的2倍左右。对致敏幼鼠进行长期的维生素d3干预可显著降低幼鼠血清中特异性抗体水平、修复肠道屏障，调节幼鼠体内th1/th2平衡。因此维生素d3可以用于制备缓解牛乳过敏的婴幼儿配方奶粉。
53.本发明通过构建caco-2细胞模型，评估维生素d的生物安全性及维生素d跨细胞膜的转运吸收能力，结果显示：维生素d3的转运吸收量是维生素d2的2倍左右。基于此，本发明对维生素d3的牛乳过敏干预作用进行了研究，利用动物实验，采取腹腔注射致敏和灌胃激发相结合的方式构建动物致敏模型，从临床病理特征如过敏相关症状、肛温变化情况、血清中组胺水平、血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1和iga的水平、空肠炎症情况和脾细胞分泌th1和th2型细胞因子水平等方面评估维生素d3的干预对牛乳过敏幼鼠的影响。实验结果表明：相较于模型组，维生素d3可以一定程度减轻过敏幼鼠的症状和组胺等炎症水平，降低过敏小鼠血清中的β-乳球蛋白特异性抗体水平，并减少脾脏中th2型细胞因子的分泌，增加th1型细胞因子的分泌，调控幼鼠体内th1/th2平衡向正常水平发展。
54.本发明对比不同干预阶段的维生素d3缓解过敏效果，进一步发现，相较于模型组，在致敏的前期便进行干预的长期干预组改善牛乳过敏的效果要好于在致敏中期干预的中期干预组和在致敏后期干预的短期干预组。长期干预组能减轻过敏症状，减少血清内组胺的水平，降低过敏幼鼠血清中特异性抗体的水平，显著改善幼鼠肠道小肠绒毛的破损情况，最大程度将幼鼠的th1/th2平衡向正常水平发展。其中模型组幼鼠血清中组胺含量高达36.59ng/ml，经过维生素d干预后，幼鼠血清中组胺水平显著下降至20ng/ml至23ng/ml。模型组中幼鼠脾脏分泌th2型细胞因子il-4和il-13均显著上升，而维生素d干预使il-4、il-13含量平均下降了18％和32％，同样也是长期干预组下降最为明显。
55.本发明创建一种利用幼鼠建立食物过敏模型的方法，由于幼鼠免疫系统不成熟不
完善，体重轻体积小，仍需要母鼠进行喂养等原因，相关食物过敏模型的建立一直是技术难点，本发明对幼鼠的食物过敏模型进行研究，突破幼鼠难喂养、难给药的问题，对幼鼠模型的建立有重大指导意义。
56.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用进行详细描述。
57.实施例1：维生素d在caco-2细胞中的转运吸收能力及维生素d3在缓解牛乳过敏幼鼠中的应用
58.30-35代caco-2细胞可以用于构建单层肠上皮细胞模型，将细胞融合度较高的caco-2细胞悬液进行洗涤、消化步骤后，对细胞悬液进行计数并将其浓度调整为2
×
106个/ml。往12孔transwell板的空白孔上室(ap侧)中滴加500μldmem完全培养基，实验孔上室滴加500μl细胞悬液，同时所有孔的下室(bl侧)加入1500μl的完全培养基。
59.使用cck-8试剂盒测定维生素d对caco-2细胞单层模型的增殖毒性，具体实验操作步骤如下。
60.①
细胞培养：将处于对数生长期的caco-2细胞悬液进行同“2.3.1.3传代”中洗涤、消化步骤后，对细胞悬液进行计数并将其浓度调整为2
×
105个/ml，取96孔细胞培养板，在外圈加入100μlhank’s溶液，内部设置维生素d样品孔、对照孔及空白孔，设置3个平行；对照孔、维生素d样品孔每孔加入100μl细胞悬液，空白孔加入不含细胞的dmem完全培养基。培养36h左右直至细胞成功贴壁。
61.②
加样：培养后，使用显微镜观察细胞融合度达到90％，弃去每孔中的旧培养基，对照孔中加入100μldmem不完全培养基，将50mg维生素d3、维生素d2标品溶于1ml dmso，再取1μl维生素d/dmso溶液加至1ml不完全培养基中，使终浓度为50μg/ml，再使用不完全培养基依次梯度稀释至40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、10μg/ml。样品孔中每孔加入各100μl样品，空白孔中加入100μldmem不完全培养基。培养24h。
62.③
加cck-8工作液：培养24h后，弃去孔内液体，每孔加入100μl完全培养基和10μlcck-8工作液，轻晃混匀后放于培养箱中培养2h。
63.④
检测计算：取出培养板测量各孔在450nm处的吸光度，计算细胞活性，公式如下：
64.细胞活性(％)＝(样品孔od值-空白孔od值)/(对照孔od值-空白孔od值)
×
100％
65.建立的caco-2细胞单层模型可以进行维生素d2和维生素d3的跨膜转运实验，具体步骤如下：
66.①
加样：取电阻值相近的孔作为样品孔，在上室加入500μl适当浓度的维生素d，下室加入1500μlhank’s缓冲液。
67.②
转运：在培养箱中孵育4h。结束后吸取下室液体。
68.③
裂解：吸出样品后，用pbs洗涤2次分别为1分钟、5分钟，往上室加入200μlwestern及ip细胞裂解液，在冰上反应5min，结束后吹打，收集细胞裂解液，用10000
×
g离心5min，取上清，测定其中维生素d2和维生素d3含量。
69.④
测定：使用人维生素d2elisa商业化试剂盒及人维生素d3elisa商业化试剂盒检测下室液体及裂解液中维生素d的含量。
70.通过腹腔注射和灌胃激发β-乳球蛋白相结合的方式对一周龄幼鼠进行致敏。出于
对幼鼠日龄的考量，选用妊娠15天左右的孕鼠共25只，给予适宜安静的环境待其生产，共产下仔鼠125只，筛选出60只雌仔鼠进行随机分组，每组各10只，生产后1周对仔鼠进行腹腔注射致敏并每2天监测体重等发育指标；对幼鼠分组如下：a组：阴性对照组(pbs)；b组：佐剂对照组(al)；c组：阳性对照组(blg)；d组：长期干预组(vd-l)；e组:中期干预组(vd-m)；f组:短期干预组(vd-s)。其中b、c、d、e、f组每周进行一次blg注射(每只100μl内含25μgblg溶于pbs中)。d组(vd-l组)从致敏0天起灌胃100μl内含1μgvd3进行干预，每周四次；e组(vd-m组)从致敏10天起灌胃100μl内含1μgvd3进行干预，每周四次；f组(vd-s组)从致敏21天起灌胃100μl内含1μgvd3进行干预，每周四次。
71.图10为动物分组及处理。
72.从第3周(d14)开始每周通过眼球静脉取血分离出血清，用间接elisa法测定ige含量，看是否有显著变化。具体步骤如下：
73.(1)包被：96孔酶标板中分别包被100μl 2.5μg/ml的blg，4℃孵育16h。
74.(2)封阻：次日，取出酶标版，恢复至室温，倾去包被液，用pbst(含0.1％吐温)，洗涤三次，每次5min。加入250μl 3％鱼明胶封阻，37℃孵育1.5h。
75.(3)一抗反应：用pbst洗板三次，酶标板每孔加入100μl稀释过后的幼鼠血清，血清稀释倍数分别为1:200(ige)。37℃烘箱中孵育1h。
76.(4)二抗反应：用pbst洗板三次，酶标板每孔加入100μl 1:5000稀释的对应羊抗小鼠二抗ige。37℃烘箱中孵育1h。
77.(5)生物素-亲和素反应：用pbst洗板三次，加入100μl 1：60稀释的hrp标记的亲和素。37℃烘箱中孵育1h。
78.(6)显色与终止：用pbst洗板三次，酶标板每孔加入100μl tmb显色液，37℃孵育13-15min，加入50μl 2m h2so4终止反应，3分钟内在450nm处检测od值。
79.第28天进行两次激发(间隔30min)，灌胃的blg为5mg溶于100μlpbs中。第二次激发20min以后，观察幼鼠表现出的症状并按照表1的评分标准进行评分，同时，对第一次激发20min后、第二次激发30min后、第二次激发50min后幼鼠肛温的变化进行检测，进行分析对比。第一次激发18h后通过眼球取血采集血清，处死，摘取脾。
80.表1幼鼠过敏症状评分标准
[0081][0082]
实验方法：在动物实验期间，每两天称量幼鼠体重，绘制体重检测曲线。在二次激发后依照评分表对幼鼠的过敏临床症状进行评分，第二次激发后18h，处死幼鼠，采用elisa法测定幼鼠血清中组胺、β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga水平。同时取幼鼠的空肠组织于4％多聚甲醛中固定，进行石蜡组织切片和he染色，使用显微镜观察幼鼠空肠组织结构。无菌环境下分离幼鼠脾脏，用70μm细胞筛和研磨棒研磨于6cm培养皿中，研磨过程中加入5ml红细胞裂解液，研磨完成后冲洗细胞筛，加入7ml 1640培养基(cellmax rpmi1640，货号：cgm112.05)1200rpm离心5min再次倾去上清，加入2ml完全培养基，计数，每组调整细胞浓度为5
×
106个/ml后铺板，于48孔无菌细胞培养板中每孔加入1ml细胞悬液，并以40μl 10mg/ml激发蛋白blg刺激细胞，细胞置于37℃，5％co2无菌培养箱中培养72h。培养结束，1000g，离心20min，取细胞上清，分装，保存于-80℃备用。利用商业化elisa试剂盒对il-4、il-13、ifn-γ进行检测。
[0083]
对本实施例得到的结果进行分析，结果如图1-9所示：
[0084]
(1)设置样品孔浓度为50μg/ml、40μg/ml、25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、5μg/ml及1μg/ml，对dmso、维生素d2、维生素d3及维生素d2：维生素d3＝1：1进行毒性实验，结果如图1a、b、c、d所示。所有浓度的dmso对细胞均无毒害作用，当维生素d浓度小于25μg/ml时，细胞活性均在95％以上。因此后续转运实验浓度选择为25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml。
[0085]
(2)使用25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml维生素d2、维生素d3等进行跨膜转运实验的结果如图2所示。从图中可见，在caco-2细胞单层膜模型中，细胞裂解液内维生素d含量普遍高于bl侧中维生素d含量，维生素d3转运及吸收量明显高于维生素d2，当维生素d2浓度为10μg/ml时细胞裂解液内维生素d2浓度最高，显著高于转运后维生素d2浓度；当维生素d3浓度为5μg/ml时细胞裂解液内维生素d3浓度最高，同样显著高于转运后维生素d3浓度。
[0086]
(3)致敏期间，幼鼠的体重变化如图3所示，在0至28天，所有幼鼠的体重均稳定上
升，说明本发明方法能最大程度保证幼鼠的正常生长发育而达到相应致敏效果。
[0087]
(4)幼鼠大剂量激发后过敏症状评分如图4所示，模型组幼鼠大多临床症状评分达到3，且幼鼠表现为多次抓挠，搔鼻，减少活动及毛发蓬松，呼吸加速及大便松软；维生素d3干预组的幼鼠则更多表现为呼吸加速和减少活动，大便松软的情况消失，症状有所减轻。
[0088]
(5)幼鼠大剂量激发后不同阶段的体温如图5所示，多个研究表明，小鼠在激发一段时间后会过敏反应，随之其直肠温度会有所改变，一般过敏表现为肛温降低。模型组幼鼠肛温较其余几组均有显著性差异，幼鼠体温明显降低。维生素d3干预后肛温出于正常水平。
[0089]
(6)幼鼠血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga的水平如图6所示，我们发现blg组幼鼠血清中针对blg特异性的igg、ige、igg1及iga相较空白组来说均有上升，且存在显著性差异，同时vd干预组幼鼠血清中ige及igg抗体水平均低于blg组。其中长干预组的igg、igg1抗体水平显著低于中干预组和短干预组。表明腹腔注射blg致敏幼鼠模型是成功的，作为阳性对照组的blg组幼鼠过敏机制以th2型抗体为主。且维生素d3长干预组缓解牛乳过敏的效果要明显好于中干预组和短干预组
[0090]
(7)幼鼠血清中组胺水平如图7所示，幼鼠血浆中的组胺水平与食物过敏密切相关。
[0091]
图5为实施例1中幼鼠血清中组胺的水平研究发现，blg致敏组幼鼠血清中组胺含量高达达36.59ng/ml，维生素d3干预后，幼鼠血清中组胺水平显著下降至20ng/ml至23ng/ml。这也证明维生素d3干预能减少机体组胺的释放。
[0092]
(8)幼鼠脾细胞分泌细胞因子水平如图8所示，从整体看，blg致敏组幼鼠脾脏分泌的th2细胞因子(il-4、il-13)相较pbs对照组均出现显著上升，blg组il-4水平是pbs组及al佐剂的3倍，blg组il-13水平是pbs组及al佐剂的20倍，这均表明blg组的幼鼠处于th1/th2失衡状态，机体平衡朝th2方向偏移。而维生素d3干预使il-4、il-13含量平均下降了18％和32％。明显看出维生素d3可以抑制blg致敏幼鼠脾细胞分泌th2型细胞因子。而维生素d3长干预组抑制th2型细胞因子分泌的程度最大。而对于th1型细胞因子即ifn-γ来说，维生素d3干预组(vd-l、vd-m、vd-s组)与阳性对照组blg组相比，其ifn-γ分别增加了144.67％、1063.91％、586.64％。增幅极为明显，表明经维生素d3干预后的blg免疫幼鼠，机体免疫朝th1方向偏倚，调控机体th1/th2朝正常水平发展。
[0093]
(9)幼鼠空肠组织的he染色结果如图9所示，可以看到pbs和al组空肠结构完整，绒毛排列有序且整齐；造模组即blg致敏组的空肠有明显的破裂，肠道绒毛出现严重断裂，紊乱，且结构难以区分，说明blg组小鼠过敏反应涉及到严重胃肠反应；vd长、中干预组的结构与pbs较为接近，vd短干预组也有肠道绒毛断裂情况，但远轻于blg组。这也说明维生素d长期干预组能减缓肠道过敏症状，对过敏症状起到极大缓解作用。
[0094]
综合以上结果表明，长期进行的维生素d3干预具有有效缓解过敏的作用。
[0095]
实施例2
[0096]
基于前期方法构建，通过腹腔注射和灌胃激发β-乳球蛋白相结合的方式对一周龄幼鼠进行致敏，采用长期干预方法进行干预实验。选用妊娠15天左右的孕鼠共23只，给予适宜安静的环境待其生产，共产下仔鼠121只，筛选出50只雌仔鼠进行随机分组，每组各10只，对幼鼠分组如下：a组：阴性对照组(pbs)；b组：佐剂对照组(al)；c组：阳性对照组(blg)；d组：低剂量干预组(0.1μg vd3组)；e组：高剂量干预组(0.5μg vd3组)。其中b、c、d、e组每周
进行一次blg注射(每只注射100μl内含25μgblg)。d组从致敏0天起灌胃100μl内含0.1μgvd进行干预，每周四次；e组从致敏10天起灌胃100μl内含0.5μgvd3进行干预，每周四次。
[0097]
实验方法：生产后1周对仔鼠进行腹腔注射致敏，第28天进行两次灌胃激发(间隔30min)，灌胃的blg为5mg溶于100μlpbs中。小鼠实验第二次激发后18h，处死幼鼠，采用elisa法测定幼鼠血清中组胺、β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga水平。无菌环境下分离幼鼠脾脏，用70μm细胞筛和研磨棒研磨于6cm培养皿中，研磨过程中加入5ml红细胞裂解液，研磨完成后冲洗细胞筛，加入7ml 1640培养基(cellmax rpmi1640，货号：cgm112.05)1200rpm离心5min再次倾去上清，加入2ml完全培养基，计数，每组调整细胞浓度为5
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106个/ml后铺板，于48孔无菌细胞培养板中每孔加入1ml细胞悬液，并以40μl10mg/ml激发蛋白blg刺激细胞，细胞置于37℃，5％co2无菌培养箱中培养72h。培养结束，1000g，离心20min，取细胞上清，分装，保存于-80℃备用。利用商业化elisa试剂盒对il-4、il-13、il-10、ifn-γ进行检测。
[0098]
得到的结果进行分析，结果如图11-13所示：
[0099]
幼鼠血清中β-乳球蛋白特异性ige、igg、igg1及iga的水平如图11所示，blg组幼鼠血清中针对blg特异性的igg、ige、igg1及iga相较pbs组来说均有上升，且存在显著性差异，表明腹腔注射blg致敏幼鼠模型成功，作为阳性对照组的blg组幼鼠过敏机制以th2型抗体为主。而vd干预组幼鼠血清中ige及igg抗体水平均显著低于blg组，说明维生素d3干预组具有明显缓解牛乳过敏的效果。
[0100]
幼鼠血清中组胺水平如图12所示，幼鼠血浆中的组胺水平与食物过敏密切相关。
[0101]
图12为实施例2中幼鼠血清中组胺的水平研究发现，pbs和al组以及维生素d3干预组的组胺释放能力无显著差异，blg致敏组幼鼠血清中组胺含量高达37.56ng/ml，低、高剂量维生素d3干预后，幼鼠血清中组胺水平显著下降至20.08ng/ml至22.58ng/ml，证明维生素d3干预均能减少机体组胺的释放。
[0102]
幼鼠脾细胞分泌细胞因子水平如图13所示，blg致敏组幼鼠脾脏分泌的th2细胞因子(il-4、il-13)相较pbs对照组均出现显著上升，blg组il-4水平是pbs组及al组的3倍，blg组il-13水平是pbs组及al组的20倍，这均表明blg组的幼鼠处于th1/th2失衡状态，机体的免疫表达向th2方向偏移。而维生素d3干预组小鼠的th2型细胞因子有不同程度的下调，说明维生素d3可以抑制blg致敏幼鼠脾细胞分泌th2型细胞因子。而对于th1型细胞因子和treg型细胞因子(il-10)来说，维生素d3干预组与blg组相比，blg组ifn-γ、il-10含量远高于pbs和al组。vd干预使ifn-γ、il-10显著升高，使th1和treg型细胞因子水平升高，维生素d的摄入可以诱导treg细胞因子的表达。表明经维生素d3干预后的blg免疫幼鼠，机体免疫朝th1方向偏倚，调控机体th1/th2朝正常水平发展。
[0103]
综合以上结果表明，使用0.1μg～1.0μg维生素d3进行长期干预具备有效缓解过敏的作用。
[0104]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.维生素d3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过敏反应包括胃肠道过敏反应、皮肤过敏反应和/或呼吸道过敏反应。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述婴幼儿牛乳胃肠道过敏反应包括腹泻、呕吐或便秘中的一种或几种。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述皮肤过敏反应包括急性荨麻疹、特应性皮炎或血管性水肿。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述呼吸道过敏反应包括过敏性鼻炎、结膜炎或哮喘中的一种或几种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述维生素d3的剂量为0.55～5.54μg/kg
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bw。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解包括：减少th2型细胞因子的分泌、增加th1型细胞因子的分泌或调控体内th1/th2平衡向正常水平发展。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解包括：降低组胺炎症水平或降低血清中β-乳球蛋白特异性抗体水平。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β-乳球蛋白特异性抗体包括ige、igg、igg1和iga。10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解包括：改善小肠绒毛破损。

技术总结
本发明提供了维生素D3在制备缓解由β-乳球蛋白引起的婴幼儿牛乳过敏反应的婴幼儿配方乳粉中的应用。本发明构建Caco-2细胞模型，评估维生素D2和维生素D3的生物安全性及跨细胞膜的转运吸收能力。采用不同致敏阶段的维生素D3干预，结合临床病理特征、血清中β-乳球蛋白特异性IgE、IgG、IgG1和IgA的水平、空肠HE染色和脾细胞分泌细胞因子等方面评估了维生素D3对牛乳过敏幼鼠的缓解作用。实验结果表明：维生素D3的转运吸收量是维生素D2的2倍左右。对致敏幼鼠进行长期的维生素D3干预可显著降低幼鼠血清中特异性抗体水平、修复肠道屏障，调节幼鼠体内Th1/Th2平衡。调节幼鼠体内Th1/Th2平衡。调节幼鼠体内Th1/Th2平衡。


技术研发人员：李欣 陈红兵 曾小玲 鄢宇婷 潘丽娜 汪家琦 叶望娟 李威 董玲 梁琳 胡一波
受保护的技术使用者：澳优乳业（中国）有限公司
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/20