一种酶解玉米浆、其制备方法及在枯草芽孢杆菌发酵中的应用与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种酶解玉米浆、其制备方法及在枯草芽孢杆菌发酵中的应用。


背景技术：

2.玉米浆是生产玉米淀粉过程中的副产物，为玉米的亚硫酸浸泡液，经真空浓缩后得到的黄褐色液体。玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、无机盐、生长素及前体物质，约含40-50％固体物质可作为微生物生长繁殖所需有机氮源，也是谷氨酸发酵所需的重要营养剂，同时也可用作水溶性植物蛋白和复合肥料添加剂等。酸水解蛋白液对环境污染较严重，且价格昂贵。玉米浆作为廉价有机氮源，其中部分氨基酸含量高于其他氮源，可替代或减少豆粕水解液等高价位氮源应用于谷氨酸发酵中，能提高玉米浆的附加值、谷氨酸产酸及转化率，降低谷氨酸生产成本等。而玉米浆中的磷虽然以植酸钙镁形式存在，也会影响谷氨酸的发酵过程，但是玉米浆中的氨基酸及无机磷均以大分子形式存在，难以被谷氨酸菌种利用。
3.氮源的主要作用是微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质。氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的主要因素，在芽孢的形成上也发挥着重要作用。枯草芽孢杆菌在生产中常用豆饼粉、鱼粉以及(nh4)2s04等一些试剂作氮源。c/n直接影响菌体的生长和代谢，碳源转化为微生物自身的细胞物质和代谢产物，并且是能源物质。氮源是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。如果c/n偏小，会导致菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶；c/n过大，菌体繁殖数量少，发酵密度低，细菌代谢不平衡，不利于产物的积累；c/n合适，但c、n源浓度过低，则会影响菌体的繁殖，c、n浓度过高，则发酵起始导致菌体大量繁殖，代谢废物过多而增加发酵液的黏度，使溶解氧降低，引起菌体代谢异常，最终也影响产物的合成。
4.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多的研制成微生物制剂。其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，具有广阔的发展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种酶解玉米浆、其制备方法及在枯草芽孢杆菌发酵中的应用。本发明提供的酶解方法包括两步酶解，第一步中的复合酶ⅰ包括漆酶、α-葡萄糖苷酶和果胶酶；第二步中的复合酶ⅱ包括植酸酶、酸性蛋白酶和酸性纤维素酶。该酶解方法能够有效降低玉米浆的抗氧化活性，酶解后的玉米浆能够代替豆粕作为氮源用于枯
草芽孢杆菌发酵，降低发酵原料成本；在枯草芽孢杆菌发酵液喷干时，能降低干燥时蒸汽的使用量并减少干燥时间。
6.一方面，本发明提供了一种降低玉米浆抗氧化性的酶解方法，所述的方法包括两步酶解，第一步酶解中的复合酶ⅰ包括漆酶；第二步酶解中的复合酶ⅱ包括植酸酶、酸性蛋白酶、酸性纤维素酶。
7.具体地，复合酶ⅰ还包括α-葡萄糖苷酶或果胶酶中的一种或两种。
8.具体地，复合酶ⅰ包含α-葡萄糖苷酶或果胶酶中的一种时，复合酶ⅱ包含另一种。
9.具体地，所述的复合酶ⅰ可以包括漆酶、α-葡萄糖苷酶和果胶酶。
10.具体地，所述的复合酶ⅰ和复合酶ⅱ中添加液体载体；所述的液体载体配方中以终浓度计可以包括：麦芽糊精0.06-0.12g/ml，醋酸钠0.05-0.11g/ml，氯化钠0.15-0.25g/ml，山梨酸钾0.003-0.004g/ml，甘油0.1-0.3g/ml。
11.优选地，所述的液体载体配方中以终浓度计可以包括：麦芽糊精0.09g/ml，醋酸钠0.08g/ml，氯化钠0.19g/ml，山梨酸钾0.0035g/ml，甘油0.1g/ml。
12.具体地，所述的投料顺序为麦芽糊精、醋酸钠、氯化钠、山梨酸钾和甘油。
13.具体地，投料后调ph＝6.0-6.5。
14.具体地，前述的玉米浆酶解方法包括以下步骤：
15.(1)在玉米浆中加入前述的复合酶ⅰ进行酶解；
16.(2)在步骤(1)酶解后的玉米浆中加入前述的复合酶ⅱ进行二次酶解。
17.具体地，步骤(1)所述的复合酶ⅰ的添加量为玉米浆质量的1
‰‑2‰
；所述复合酶ⅰ中各酶的酶活性为漆酶800-1200u/g，α-葡萄糖苷酶800-1200u/g，果胶酶300-700u/g。
18.优选地，步骤(1)所述的复合酶ⅰ的添加量为玉米浆质量的1.5
‰
；所述复合酶ⅰ中各酶的酶活性为漆酶1000u/g，α-葡萄糖苷酶1000u/g，果胶酶500u/g。
19.具体地，步骤(2)所述的复合酶ⅱ的添加量为步骤(1)酶解后玉米浆质量的1
‰‑3‰
；所述复合酶ⅱ中各酶的酶活性为植酸酶800-1200u/g，酸性蛋白酶18000-22000u/g，酸性纤维素酶800-1200u/g。
20.优选地，步骤(2)所述的复合酶ⅱ的添加量为第一步酶解后玉米浆质量的2
‰
；所述的复合酶ⅱ中各酶的酶活性为植酸酶1000u/g，酸性蛋白酶20000u/g，酸性纤维素酶1000u/g。
21.具体地，步骤(1)的酶解条件是温度为35-45℃，ph为3.0-4.0，酶解时间为5-7h。
22.优选地，步骤(1)的酶解条件是温度为40℃，ph为3.5，酶解时间为6小时。
23.具体地，步骤(2)的酶解条件是温度为45-55℃，ph为4.0-5.0，酶解时间为10-14h。
24.优选地，步骤(2)的酶解条件是温度为50℃，ph为4.5，酶解时间为12小时。
25.另一方面，本发明提供了前述的酶解方法制备的玉米浆在枯草芽孢杆菌发酵中的应用。
26.具体地，玉米浆的添加量为280-320g/l。
27.优选地，玉米浆的添加量为295-302g/l。
28.进一步优选地，玉米浆的添加量为300g/l。
29.本发明所取得的的技术效果：该酶解方法能够有效降低玉米浆的抗氧化活性，酶解后的玉米浆能够代替豆粕作为氮源用于枯草芽孢杆菌发酵，降低发酵原料成本；在枯草
芽孢杆菌发酵液喷干时，能降低干燥时蒸汽的使用量并减少干燥时间。
附图说明
30.图1为实验3.1枯草芽孢杆菌发酵液显微镜镜检图片，其中a为发酵8小时；b为发酵16小时；c为发酵32小时。
31.图2为枯草芽孢杆菌空壳镜检图片，其中a为豆粕发酵的镜检图片；b为异常批次的镜检图片。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.以下现有技术中的酶只是作为本发明的示例：
34.α-葡萄糖苷酶：内蒙古科为博生物科技有限公司，批号：68220105。
35.漆酶：夏盛(北京)生物科技有限公司，批号：yp02s10022。
36.果胶酶：承德市天丰生物工程有限公司，批号：12013021g。
37.植酸酶：内蒙古科为博生物科技有限公司，批号：02c1230601。
38.酸性蛋白酶：内蒙古科为博生物科技有限公司，批号：16c1230525。
39.酸性纤维素酶：内蒙古科为博生物科技有限公司，批号：17c1230221。
40.实施例1酶解玉米浆的制备
41.玉米浆(厂家：通辽梅花生物科技有限公司，入库批号：yl23021307)。
42.酶解玉米浆的制备：包括两步酶解。
43.1.1玉米浆第一次酶解
44.1.1.1玉米浆的调制
45.在ph为3.0-4.0，温度为40℃的条件下，以40rpm的转速对玉米浆进行搅拌，直至实验结束。
46.1.1.2复合酶的调制
47.酶活比例：α-葡萄糖苷酶1000u/g酶活、漆酶1000u/g酶活、果胶酶500u/g酶活。
48.复合酶的调制的具体步骤如下：
49.(1)计算好每组酶的使用量，称量，放入载体罐。
50.(2)周围环境消毒。
51.(3)液体载体(保持酶制剂的稳定)的配制：用超纯水依次溶解质量百分比为9％的麦芽糊精、8％的醋酸钠、19％的氯化钠、0.35％的山梨酸钾、10％的甘油，水温为常温。投料顺序为麦芽糊精、醋酸钠、氯化钠、山梨酸钾和甘油。液体载体各组分的终浓度为：麦芽糊精0.09g/ml，醋酸钠0.08g/ml，氯化钠0.19g/ml，山梨酸钾0.0035g/ml，甘油0.1g/ml。
52.(4)载体投完后调ph＝6.0-6.5。
53.(5)加入载体后将物料升温60-65℃静置10分钟后，开启冷却将温度降至最低进行除菌。
54.(6)检测比重(密度天平法)，范围1.1-1.2。
55.1.1.3玉米浆第一次酶解条件
56.复合酶的添加量为玉米浆1.5
‰
(质量比)，酶解时间为6小时，酶解ph为3.0-4.0，酶解温度为40℃。
57.1.2玉米浆第二次酶解
58.1.2.1玉米浆的调制
59.将第一次酶解后的玉米浆在ph4.5，温度为50℃的条件下，以40rpm的转速对其进行搅拌，直至试验结束。
60.1.2.2复合酶的调制
61.酶活比例：植酸酶1000u/g酶活、酸性蛋白酶20000u/g酶活、酸性纤维素酶1000u/g酶活。
62.复合酶的调制的具体步骤如下：
63.(1)计算好每组酶的使用量，称量，放入载体罐。
64.(2)周围环境消毒。
65.(3)液体载体的配制：用超纯水依次溶解9％的麦芽糊精、8％的醋酸钠、19％的氯化钠、0.35％的山梨酸钾、10％的甘油，水温为常温。投料顺序为麦芽糊精、醋酸钠、氯化钠、山梨酸钾和甘油。液体载体各组分的终浓度为：麦芽糊精0.09g/ml，醋酸钠0.08g/ml，氯化钠0.19g/ml，山梨酸钾0.0035g/ml，甘油0.1g/ml。
66.(4)载体投完后调ph＝6.0-6.5。
67.(5)加入载体后将物料升温60-65℃静置10分钟后，开启冷却将温度降至最低进行除菌。
68.(6)检测比重，范围1.1-1.2。
69.1.2.3玉米浆第二次酶解条件
70.第二次复合酶的添加量为第一次酶解后的玉米浆的2
‰
(质量比)，酶解时间为12小时，酶解ph为4.5，酶解温度为50℃。
71.由于漆酶会降低植酸酶、酸性纤维素酶、酸性蛋白酶的酶活，所以不能放在一起做复合酶。
72.具体实验评估数据见表1：
73.表1
[0074][0075]
实施例2酶解液性能检测
[0076]
利用orac(氧化自由基吸收能力)法进行抗氧化活性的测定。
[0077]
2.1trolox(水溶性维生素e)标准溶液的制备
[0078]
称取0.0562g trolox(品牌：ruibio)标准品，加入适量磷酸盐缓冲溶液溶解并定容至11.23ml，即得20mm trolox母液。-20℃避光储存。
[0079]
2.2标准曲线
[0080]
用75mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)稀释到20，40，60，80，100μm系列浓度的trolox标准溶液制作标准曲线。
[0081]
2.3样品溶液制备
[0082]
待测样品：称2.5g玉米浆，加5ml 100℃双蒸水溶解，震荡。冷却至室温，4000转离心5分钟，取上清液，得到500mg/ml母液，置4℃冰箱保存备用。使用时，取适量母液用75mm pbs(ph＝7.2)稀释到2，6，10μg/ml三个浓度，用于orac活性测定。
[0083]
2.4荧光素钠：称0.006g荧光素，溶解于2.53ml蒸馏水水中，配制6mm母液，分装后置于-20℃冰箱避光储存，使用时用75mm pbs稀释，使反应体系终浓度为63nm。
[0084]
2.5aaph：称0.0496g aaph，溶解于10ml去离子水中，使反应体系中的终浓度为12.8mm，现用现配。
[0085]
2.6测定
[0086]
orac反应体系为75mmol/l pbs(ph＝7.2)，反应总体积＝200μl，温度＝37℃。步骤为：
[0087]
(1)先加入20μl样品或标准品(n＝3)；
[0088]
(2)再加入20μl的荧光指示剂；
[0089]
(3)最后加入140μl的aaph提供自由基。
[0090]-aaph组不加aaph和样品，+aaph组不加样品。加样后振荡混匀2分钟，立刻置于荧光酶标仪，恒温37℃，激发波长485nm，发射波长527nm，监测60分钟内的荧光强度，每4分钟测定一个点。
[0091]
2.7测定结果
[0092]
用graphpad prism 8.0软件处理测定结果，绘制荧光衰减曲线，计算曲线下面积(area under curve，auc)，得到回归方程：y＝3.511x+4.471(r2＝0.9985)
[0093]
结果：orac当量μmol trolox/g。见表2(实验组1-3的酶解方法均参照实施1)。
[0094]
表2
[0095]
[0096][0097]
由表2可知，实验组1-3大幅度降低了酶解玉米浆的抗氧化活性，其中实验组3的降低程度最大，下降了75％。
[0098]
实施例3将酶解玉米浆代替豆粕用于枯草芽孢杆菌发酵
[0099]
3.1枯草芽孢杆菌发酵工艺
[0100]
(1)接种量：10％
[0101]
(2)培养温度37℃。
[0102]
(3)ph：6.6
±
0.1(按实测为准，接种前氨水调节)，培养过程ph自然。
[0103]
(4)转速：起始转速140rpm，发酵过程根据溶氧调整。
[0104]
(5)风量：起始风量1200m3/h，发酵过程根据溶氧调整，罐压：0.05mpa。
[0105]
(6)风量、转速调整：发酵后期溶氧大于45％，降低风量和转速使溶氧维持20-40％。
[0106]
(7)检测指标：ph、od
600
、镜检。
[0107]
(8)取样时间点：6h后每3小时取样检测，24h后每2小时检测，30h后每小时检测。
[0108]
(9)停罐：镜检芽孢率大于90％降温停罐。
[0109]
枯草芽孢杆菌发酵配料(豆粕发酵)：
[0110]
葡萄糖15g/l，玉米粉66.6g/l，豆粕粉90g/l，玉米浆干粉4.2g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.5g/l，磷酸二氢钾1.7g/l，面粉23.3g/l，硫酸钙2.7g/l，食用碱1.3g/l。
[0111]
替代计算：配料中豆粕含量为90g/l，粗蛋白含量为43-44％，含氮量为36.98-37.84g/l。玉米浆的粗蛋白含量为15-17％(液体)，比重为1.18-1.25g/l，所以玉米浆的理论添加量为295-302g/l，实际添加量为300g/l。
[0112]
枯草芽孢杆菌检测方法：依据：gb/t26428-2010进行。
[0113]
3.2用未酶解的玉米浆代替豆粕
[0114]
直接用未酶解的玉米浆100％代替豆粕进行枯草芽孢杆菌发酵实验，发酵条件同3.1。结果表明(见表4)枯草芽孢杆菌的发酵液菌数降低到35.6％，甚至更少；并且喷干成品的收率降低了34.3％(收率＝发酵液总菌数/干燥成品总菌数；发酵液总菌数＝发酵液菌数
×
发酵液重量；干燥成品总菌数＝成品菌数
×
成品重量)。经过对发酵过程的镜检(图1)发现，发酵开始32小时会出现异常芽孢空壳形态，这个形态就是影响菌数的主要原因。对发酵8小时、16小时和32小时发酵液的od
600
值见表表3。
[0115]
表3
[0116]
时间phod
600
8h6.998616h7.4419332h8.30265
[0117]
表4
[0118][0119]
对异常空壳的说明：发酵终止前大部分菌体会形成芽孢，染色镜检能看到空壳。豆粕发酵的空壳大小匀称，椭圆形，不会大量聚集，而异常空壳为圆形，大小不一，并且聚在一起(见图2)。
[0120]
3.3用实验组3的方案酶解的玉米浆100％代替豆粕
[0121]
直接用实验组3的方案酶解的玉米浆100％代替豆粕进行枯草芽孢杆菌发酵实验，发酵条件同3.1。结果表明(表5)通过多次实验发现，利用实验组3的两次酶解工艺酶解玉米浆后，在枯草芽孢杆菌的发酵中代替豆粕率可达到100％。
[0122]
表5
[0123][0124]
综上所述，用未酶解的玉米浆，直接100％代替豆粕，发酵后发现枯草芽孢杆菌的菌数大幅下降，并且喷干的收率降低。这是由于用未酶解的玉米浆，在形成芽孢过程的后期，会出现异常的芽孢空壳形态。经过两次酶解后的玉米浆，再100％代替豆粕后消除了异常的芽孢空壳的现象，菌数也回升了，但是没有明显的菌数的提高。
[0125]
另外，相对于豆粕发酵利用玉米酶解液进行发酵还具有以下优势：(1)利用烘干塔对发酵液喷干的时候料液比较稀，不用额外加水(用豆粕粉的时候发酵的料液特别粘稠，必须加水才能喷干)；(2)降低干燥时蒸汽的使用量(理论计算能够降低16.7％)；(3)能提高收率(目前实验结果，平均提高了3％)；(4)减少干燥时间，提高生产效率(同等量的发酵液，喷干时间减少了15％)。
[0126]
对芽孢异常空壳现象的初步分析：
[0127]
分析了玉米浆酶解前和酶解后的游离氨基酸组成；粗蛋白含量；氨基态氮的变化；黄曲霉素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的变化；乳酸含量的变化；总糖的变化。这些都没有大的变化。
[0128]
分析玉米浆中的各类组分后，酶解前和酶解后，最大的变化是抗氧化性的变化。因此判断抗氧化性过高是枯草芽孢杆菌出现异常芽孢空壳的主要原因。
[0129]
对比例1-27
[0130]
根据实施例2的实验方法设置对比例1-27，具体设计方法其酶解液性能检测结果见表6。
[0131]
表6对比例1-27
[0132]
[0133][0134]
由表6和表2可知，对比例4与实验组1、对比例5与实验组2、对比例27与实验组3的比较，说明了漆酶在第一步酶解的重要性；对比例3与实验组1-3说明了使用漆酶与α-葡萄糖苷酶和果胶酶中的一种或两种作为复合酶时，玉米浆的抗氧化活性的下降比例增大，其中实验组3的下降比例最大；对比例1与实验组3说明了颠倒两次酶解中复合酶的顺序会严重影响玉米浆的抗氧化活性的下降比例；对比例2与实验组3说明了第二步酶解的重要性。
[0135]
另外，对比例6-20是玉米浆两步酶解中均为单酶时，进行的抗氧化活性检测，结果表明效果均不如实验组3；对比例21-26是6种单酶分别对玉米浆做一次酶解，效果也均不如实验组3。
[0136]
参照实施例3实验方法，用对比例1的方案酶解的玉米浆100％代替豆粕用于枯草芽孢杆菌发酵。结果(表7)表明对比例1的方法酶解的玉米浆代替豆粕用于枯草的发酵，发酵液的菌数明显低于实验组3的方案酶解的玉米浆100％代替豆粕的发酵实验。这是由于实验组3的酶解方法酶解后抗氧化活性能下降75％，而对比例1的方案只下降36％，抗氧化性
过高导致发酵过程中出现异常的芽孢形态。
[0137]
表7
[0138]

技术特征：
1.一种降低玉米浆抗氧化性的酶解方法，其特征在于，包括两步酶解，第一步酶解中的复合酶ⅰ包括漆酶；第二步酶解中的复合酶ⅱ包括植酸酶、酸性蛋白酶、酸性纤维素酶。2.根据权利要求1所述的酶解方法，其特征在于，所述的复合酶ⅰ还包括α-葡萄糖苷酶或果胶酶中的一种或两种。3.根据权利要求2所述的酶解方法，其特征在于，复合酶ⅰ包含α-葡萄糖苷酶或果胶酶中的一种时，复合酶ⅱ包含另一种。4.根据权利要求1-2任一项所述的酶解方法，其特征在于，所述的复合酶ⅰ包括漆酶、α-萄糖苷酶和果胶酶。5.根据权利要求1所述的酶解方法，其特征在于，所述的复合酶ⅰ和复合酶ⅱ中添加液体载体；所述的液体载体配方中以终浓度计包括：麦芽糊精0.06-0.12g/ml，醋酸钠0.05-0.11g/ml，氯化钠0.15-0.25g/ml，山梨酸钾0.003-0.004g/ml，甘油0.1-0.3g/ml。6.根据权利要求1所述的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在玉米浆中加入权利要求4中所述的复合酶ⅰ进行酶解；(2)在步骤(1)酶解后的玉米浆中加入权利要求4中所述的复合酶ⅱ进行二次酶解。7.根据权利要求6所述的酶解方法，其特征在于，步骤(1)所述的复合酶ⅰ的添加量为玉米浆质量的1
‰‑2‰
；所述复合酶ⅰ中各酶的酶活性为漆酶800-1200u/g，α-葡萄糖苷酶800-1200u/g，果胶酶300-700u/g。8.根据权利要求6所述的酶解方法，其特征在于，步骤(2)所述的复合酶ⅱ的添加量为步骤(1)酶解后玉米浆质量的1
‰‑3‰
；所述复合酶ⅱ中各酶的酶活性为植酸酶800-1200u/g，酸性蛋白酶18000-22000u/g，酸性纤维素酶800-1200u/g。9.根据权利要求6所述的酶解方法，其特征在于，步骤(1)的酶解条件是温度为35-45℃，ph为3.0-4.0，酶解时间为5-7h；步骤(2)的酶解条件是温度为45-55℃，ph为4.0-5.0，酶解时间为10-14h。10.利用权利要求1-9任一项所述的酶解方法制备的玉米浆在枯草芽孢杆菌发酵中的应用。

技术总结
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种酶解玉米浆、其制备方法及在枯草芽孢杆菌发酵中的应用。本发明提供的酶解方法包括两步酶解，第一步中的复合酶Ⅰ包括漆酶、α-葡萄糖苷酶和果胶酶；第二步中的复合酶Ⅱ包括植酸酶、酸性蛋白酶和酸性纤维素酶。该酶解方法能够有效降低玉米浆的抗氧化活性，酶解后的玉米浆能够代替豆粕作为氮源用于枯草芽孢杆菌发酵，降低了发酵原料成本；在枯草芽孢杆菌发酵液喷干时，能降低干燥时蒸汽的使用量并减少干燥时间。燥时间。燥时间。


技术研发人员：吴培均 奎奎 罗建杰 李富伟
受保护的技术使用者：内蒙古科为博生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/20