过表达Nudt12在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用

过表达nudt12在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及过表达核苷二磷酸连接部分x型基元12(nucleoside diphosphate linked to x-type motif 12,nudt12)在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。


背景技术：

2.急性心肌梗死(acute myocardial infarction,ami)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。在ami发展过程中，由于血管闭塞导致心脏缺血缺氧，使得心脏能量代谢、线粒体结构功能发生异常并最终导致衰竭心脏的能量代谢模式发生改变，即对葡萄糖的利用增加、对脂肪酸的利用减少。代谢状态从之前的有氧代谢转换为无氧酵解，随之产生大量乳酸，导致心肌细胞酸中毒，加重ami后心脏重构和纤维化。越来越多的证据表明，心肌细胞能量代谢障碍不仅是心衰早期收缩力降低的重要机制之一，也是梗死后心肌纤维化，心肌细胞数量减少的重要因素。因此改善心肌能量代谢，调节衰竭心肌功能成为心衰治疗的又一新靶点。当前，心衰的治疗理念也在转变，由传统的改善血流动力学、抑制神经内分泌过度激活，转变为开始重视心肌能量代谢疗法，通过改善心脏的能量代谢，使心肌细胞获得更多的能量物质，缓解心脏的“饥饿”状态，改善衰竭心肌功能。
3.能量饥饿假说指出，能量缺乏是导致心肌重构的根本原因，因此能量代谢问题的解决可进一步阻止心肌重构，故能量代谢治疗在急性心肌梗死中表现巨大潜力。目前，血管紧张素转换酶抑制剂，血管紧张素ⅱ受体阻滞剂，β-受体阻滞剂等为心力衰竭常规用药，但对心力衰竭患者的疗效欠佳，因此亟需寻找新的治疗手段来改善心肌能量代谢。
4.在大部分真核细胞mrna的5’末端有一个反式7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷(m7gppp)的起始结构，该结构有助于维持mrna的稳定性，协同mrna从细胞核向细胞质转运，以及在蛋白质生物合成中促进核糖体和翻译起始因子结合。近年来，随着研究的不断开展，在真核生物、原核生物、甚至是病毒在内的多个物种中均检测到了一个新的mrna 5’端共价修饰结构，即(还原型)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,nad
+
/nadh)。转录本5’端的nad
+
/nadh加帽修饰具有稳定rna，保护其不被核糖核酸酶降解的作用。在哺乳动物中，nad
+
/nadh加帽修饰的水解主要受核苷二磷酸连接部分x型基元12(nucleoside diphosphate linked to x-type motif 12,nudt12)的脱帽作用，该部分rna所编码的蛋白主要涉及信号转导、转录相关、蛋白翻译、细胞周期、氧化应激、线粒体相关(包括线粒体氧化磷酸化、线粒体组成、线粒体呼吸链活性、丙酮酸脱氢酶复合体活性、线粒体复合体ⅰ、ⅲ、ⅳ、
ⅴ
缺陷等)、光合作用及非生物胁迫响应如冷、热、旱、盐、营养缺失等过程。然而，目前关于nudt12在改善急性心肌梗死能量代谢中的作用还未见任何报道。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明通过建立新生小鼠心肌细胞缺血缺氧后致细胞凋亡模型和结扎小鼠冠状动脉左前降支后致急性心肌梗死模型，利用mitosox线粒体超氧化物检测、tunel细胞凋亡检测、atp合成检测以及小鼠心超、切片染色等生物学技术，评估心肌细胞凋亡、能量代谢及小鼠心功能、心肌纤维化情况。发现nudt12过表达后，可显著减轻缺血缺氧条件下心肌细胞的氧化应激及凋亡水平，增加atp的合成，增强心肌细胞的抗凋亡能力以及显著减少心梗后心肌纤维化及心肌梗死的面积，维持心肌细胞的收缩，改善心梗小鼠的心功能。本发明为临床上诊治急性心肌梗死所致心力衰竭提供了新的靶点和策略。
6.本发明中，克隆位点指限制性内切酶酶切位点，是外源dna的插入位点。
7.一方面本发明提供了nudt12基因在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用，所述的药物包括过表达nudt12基因的载体。
8.具体地，所述的急性心肌梗死包括急性st段抬高型心肌梗死，急性非st段抬高型心肌梗死，缺血性心肌病，心力衰竭。
9.具体地，所述的药物用于增强心肌细胞的抗凋亡能力或改善心肌纤维化。
10.进一步具体地，所述的所述的载体可以是病毒载体，优选为腺病毒载体或腺相关病毒载体。
11.优选地，所述的腺病毒为使nudt12高度表达的腺病毒。
12.进一步具体地，所述的病毒载体的插入序列为seq id no.1。
13.所述的病毒载体的克隆位点为kpni。
14.具体地，所述的药物还包括药学上可以接受的辅料。
15.进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料包括但不限于甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、聚山梨酯80、甘油和羟乙基哌嗪乙硫磺酸中的一种或多种。
16.具体地，所述药物的剂型可以是注射剂。
17.进一步具体地，所述注射剂可以是水针剂、油针剂或粉针剂中的一种。
18.另一方面本发明提供了一种用于治疗急性心肌梗死的药物，所述的药物包括过表达nudt12基因的病毒载体。
19.具体地，所述的载体为腺病毒载体或腺相关病毒载体。
20.具体地，所述的病毒载体上的插入序列为seq id no.1，克隆位点为kpni。
21.具体地，所述的急性心肌梗死包括急性st段抬高型心肌梗死，急性非st段抬高型心肌梗死，缺血性心肌病，心力衰竭。
22.具体地，所述的药物用于增强心肌细胞的抗凋亡能力或改善心肌纤维化。
23.具体地，所述的药物还包括药学上可以接受的辅料。
24.进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料包括但不限于甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、聚山梨酯80、甘油和羟乙基哌嗪乙硫磺酸中的一种或多种。
25.具体地，所述药物的剂型可以是注射剂。
26.进一步具体地，所述注射剂可以是水针剂、油针剂或粉针剂中的一种。
27.本发明所取得的的技术效果：nudt12过表达后，可显著减轻缺血缺氧条件下心肌细胞的氧化应激及凋亡水平，增加atp的合成，增强心肌细胞的抗凋亡能力以及显著减少心梗后心肌纤维化及心肌梗死的面积，维持心肌细胞的收缩，改善心梗小鼠的心功能。
附图说明
28.图1为缺血缺氧诱导的新生小鼠心肌细胞(neonatal mouse ventricular myocytes,nmvms)和成年小鼠心肌细胞(adult mouse cardiac myocytes,amcms)的nad
+
/nadh帽修饰及nudt12的表达水平；其中，a为采用nad帽检测和定量(nad cap detection and quantitation,nad-capq)技术检测缺血缺氧诱导的nmvms和常氧的nmvms中nad
+
/nadh帽修饰水平；b-e为采用rt-qpcr和western blot检测缺血缺氧诱导的nmvms、amcms和常氧nmvms、amcms中nudt12的mrna和蛋白表达水平。
29.图2为小鼠冠状动脉左前降支结扎后诱导的急性心肌梗死模型中缺血心肌组织内nad
+
/nadh帽修饰及nudt12的表达水平；其中，a为采用nad-capq技术检测ami术后1天、3天、7天心梗交界区组织和假手术组中组织中nad
+
/nadh帽修饰水平；b-d为采用rt-qpcr和western blot检测ami术后1天、3天、7天心梗交界区组织和假手术组中组织中nudt12的mrna和蛋白表达水平。
30.图3为过表达nudt12对缺血缺氧后nmvms功能的影响；其中a为蛋白表达水平；b为mrna表达水平；c为nad
+
/nadh帽修饰水平。
31.图4为过表达nudt12对缺血缺氧后nmvms功能的影响；其中a为线粒体形态图；b为线粒体活性氧水平；c为线体膜电位变化图。
32.图5为过表达nudt12对缺血缺氧后nmvms功能的影响；其中a为线粒体atp含量变化图；b-f为心肌细胞凋亡水平图。
33.图6为过表达nudt12对小鼠冠状动脉左前降支结扎后的心功能的影响；其中a为western blot检测图片；b为蛋白表达水平；c为mrna表达水平；d为nad
+
/nadh帽修饰水平。
34.图7为过表达nudt12对小鼠冠状动脉左前降支结扎后的心肌细胞机械性能指标变化图。
35.图8为过表达nudt12对小鼠冠状动脉左前降支结扎后的心功能指标变化图。
36.图9为过表达nudt12对小鼠冠状动脉左前降支结扎后的心肌组织的纤维化程度图；其中a为he染色；b为masson染色。
37.图10为过表达nudt12对小鼠冠状动脉左前降支结扎后的心功能图；a为心动超声图；b为心功能指标变化图。
38.图11为腺病毒载体图谱。
39.图12为腺相关病毒载体图谱。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实验中所需的无特殊病原体(specific pathogen free，spf级)c57bl/6j雄鼠(8周龄，体重约25g)购置于杭州启真实验动物科技有限公司，spf级c57bl/6j小鼠乳鼠，雌雄不限(1-3日龄)购置于上海杰斯捷实验动物中心。本研究中涉及到的动物处理和实验操作均严格遵守实验动物喂养和使用指南并通过复旦大学动物伦理委员会批准。
42.1实验方法
43.1.1新生小鼠心肌细胞(neonatal mouse ventricular myocytes,nmvms)的提取培养
44.1.1.1主要溶液及相关buffer的配制
45.50ml 10％完全培养基的配制：44.5ml dmem高糖(gibco,11995-065)、0.5ml p/s双抗(biological industries,03-031-1bcs)与5ml胎牛血清(fetal bovine serum,fbs,江苏恩莫阿赛生物技术有限公司，ccs30009.02)充分搅拌混匀后，过滤分装至50ml离心管，做好标记后放置于4℃保存备用。
46.1.1.2层粘连蛋白(laminin)的铺板
47.具体步骤如下：
48.(1)根据乳鼠数量(以50只乳鼠为例)，计算所需laminin(roche,11243217001)用量。
49.(2)6孔板1个孔需1ml laminin稀释液。以2个6孔板为例，共12个孔，需12ml laminin稀释液，准备12ml pbs，混入120μl laminin原液(1∶100比例配制)，混旋均匀。
50.(3)将配制好的laminin用移液器吸入孔板，放入37℃培养箱培养2h以上。
51.(4)当液体蒸发后，在孔板底部留下一层薄薄的凝胶状物质，此时铺板完成。
52.1.1.3nmvms的原代提取
53.具体步骤如下：
54.(1)laminin铺板完成后，准备1-3d的c57小鼠乳鼠至无菌药碗中。戴无菌手套。
55.(2)准备3个10cm培养皿，往培养皿中加入预冷的pbs。准备1个无菌药碗，加入适量75％的乙醇。
56.(3)75％的乙醇浸泡消毒乳鼠，剪开左侧胸腔，挤出心脏，剪取整个心脏(乳鼠消毒1个剪取1个，防止因乙醇挥发导致乳鼠体温过低而死亡)。
57.(4)然后依次在3个10cm培养皿中清洗三次，若心腔里有血液可通过镊子挤压心脏。
58.(5)将所有心脏组织移入1.5ml ep管中，滴加几滴pbs溶液，用剪刀剪ep管中心脏组织。剪切至肉眼见不到，大于约1mm的块状组织为止，大约剪2分钟左右。
59.(6)将剪碎的心脏组织移入15ml无菌离心管中，加入3ml pbs溶液，吹打心脏组织，静置，待组织沉淀后，弃上清。重复该步骤2-3遍，待上清较为干净清澈即可(充分洗去组织中残留的血液，防止提取的心肌细胞中含有较多的血细胞，另外血液中血清的存在，会影响后续ⅱ型胶原酶的消化能力)。
60.(7)加入3ml 0.08％(m/v，pbs溶解后0.22μm滤器过滤)的ⅱ型胶原酶(worthington biochemical,ls004176)，吹打混匀，放入37℃恒温水浴箱中消化2.5min(最好把15ml离心管倾斜一定角度放置，增加与酶的接触面积，便于充分消化)。
61.(8)第一次消化结束，将15ml离心管移入超净台中，吹打心脏组织数次(让组织表面消化下来的细胞脱落到消化液中)，静置，待组织沉淀，吸取上清至50ml无菌离心管中，加入3ml 10％完全培养基终止消化。重复步骤(7)、(8)，直到组织呈现白色(无肉色)絮状物即可终止消化。大概需重复消化8至10遍。
62.(9)用100μm的细胞滤网过滤收集的上清液，室温离心1000rpm，5min，弃上清。
63.(10)加入8ml 10％完全培养基后，充分吹打混匀，将所得细胞悬液加入10cm培养皿中进行差速贴壁。
64.(11)清理台子并照上紫外。90min后将10cm培养皿中的培养基(培养基中为未贴壁的心肌细胞，培养皿底为贴壁的成纤维细胞)移入15ml/50ml离心管中，并加入2-3ml完全培养基至10cm培养皿中，上下左右倾斜皿(动作一定要轻柔，切不可用吸管去吹打，否则会将贴壁的成纤维细胞冲下)，以便完全冲洗皿中残留的心肌细胞，吸出完全培养基至离心管中，再次重复1遍冲洗过程即可。弃10cm培养皿(为贴壁的成纤维细胞)。
65.(12)取出铺好laminin的6孔板，弃去pbs，充分吹打离心管中收集到的心肌细胞悬液，根据6孔板孔数，计算每孔细胞悬液(最好不要超过3ml，若不足2ml，种板后用完全培养基补齐)，用1ml枪将细胞悬液均匀种入6孔板中，按“米”字型平晃6孔板，以便细胞种板均匀。将6孔板放回37℃恒温孵箱中(上述所有吸管吹打细胞悬液的步骤中，操作时切不可猛烈快速吹打，一定要是慢吸慢吹)。
66.(13)48h后心肌细胞换液。换液后即可开始干预。
67.1.2成年小鼠心肌细胞(adult mouse cardiac myocytes,amcms)的分离培养
68.1.2.1主要溶液及相关buffer的配制
69.(1)100
×
2,3-丁二酮一肟(＝1mol/l)的配制：将1.01g 2,3-丁二酮一肟(bdm,sigma-aldrich,b0753-100g)溶解于10ml超纯水中，37℃水浴锅中振荡加速溶解，溶解后500μl一管分装至1.5ml ep管中，-20℃保存备用。
70.(2)5％牛血清白蛋白(bsa)的配制：将250μg bsa(上海威奥生物科技有限公司，wh1044)溶解于5ml pbs中，配制完成后漩涡振荡溶解，当日现配现用。
71.(3)50ml细胞培养基(culture media,cm)的配制：47ml 199培养基(gibco,12340-030)、1ml 5％ bsa、0.5ml 100
×
bdm、0.5ml 100
×
its(its是人重组胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸钠的一种混合物，sigma-aldrich,i3146-5ml)、0.5ml化学成分明确的脂质浓缩液(cd lipid是一种浓缩脂肪乳剂，gibco,11905031)、0.5ml p/s双抗。20ml注射器充分混匀培养基，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，4℃保存备用。
72.(4)50ml铺板培养基(plating media,pm)的配制：46.5ml m199(199培养基)、2.5ml fbs、0.5ml 100
×
bdm、0.5ml p/s双抗。20ml注射器充分混匀培养基，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，4℃保存备用。
73.(5)100
×
collagenase(胶原酶)和1000
×
protease xiv(蛋白酶xiv)储存液(＝50mg/ml)的配制：分别将500mg胶原酶ⅱ(worthington biochemical,ls004176)和胶原酶ⅳ(worthington biochemical,ls004188)溶解于10ml超纯水中，漩涡振荡混匀，离心，500μl一管分装至1.5ml ep管中，将50mg蛋白酶xiv(sigma-aldrich,p5147)溶解于1ml超纯水中，漩涡振荡混匀，离心，50μl一管分装至200μl ep管中，将上述分装好后的3种酶置于-80℃保存备用。
74.(6)edta buffer(e液)的配制：130mmol/l氯化钠(上海凌峰化学试剂有限公司，223102129)、5mmol/l氯化钾(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，p112143-100g)、0.5mmol/l磷酸二氢钠、10mmol/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(北京索莱宝科技有限公司，h8090-100g)、10mmol/l葡萄糖(sigma-aldrich,v900392-500g)、10mmol/l bdm、10mmol/l牛磺酸(国药集团化学试剂有限公司，62021436)、5mmol/l乙二胺四乙酸(上海生工生物工程股份
有限公司，a100322-0500)。超纯水定容至1l，充分搅拌混匀后，氢氧化钠调节ph至7.8，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，4℃保存备用，1月内可用。
75.(7)perfusion buffer(p液)的配制：130mmol/l氯化钠、5mmol/l氯化钾、0.5mmol/l磷酸二氢钠、10mmol/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10mmol/l葡萄糖、10mmol/l bdm、10mmol/l牛磺酸、1mmol/l氯化镁(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，m113687-250g)。超纯水定容至1l，充分搅拌混匀后，氢氧化钠调节ph至7.8，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，4℃保存备用，1月内可用。
76.(8)50ml collagenase buffer(胶原酶buffer)的配制：49ml p液、0.5ml100
×
胶原酶ⅱ、0.5ml 100
×
胶原酶ⅳ、50μl 1000
×
蛋白酶xiv。吸管吹打混匀，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，37℃水浴锅中预热备用，当日现配现用。
77.(9)终止消化液(即5％ fbs)的配制：47.5ml p液、2.5ml fbs。吸管吹打混匀，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，当日现配现用。
78.(10)10ml(钙恢复液)的配制：钙恢复液1(7.5ml p液﹢2.5ml cm)，钙恢复液2(5ml p液﹢5ml cm)，钙恢复液3(2.5ml p液﹢7.5ml cm)。吸管吹打混匀，每管钙恢复液总量为10ml，当日现配现用。
79.1.2.2amcms的提取
80.(1)层粘连蛋白铺板，实验操作具体步骤同1.1.2。
81.(2)37℃水浴锅提前预热p液、e液和配制好的胶原酶buffer。
82.(3)每只小鼠用0.2ml 1％戊巴比妥钠麻醉。
83.(4)用20ml注射器吸17ml e液。装上1ml针头。加热垫预热。
84.(5)用10ml注射器吸取10ml p液。装上1ml针头。加热垫预热。
85.(6)取出麻醉完成的小鼠，用泡沫板固定，喷洒75％乙醇。
86.(7)剪开小鼠胸部皮肤，扩大创口，暴露心脏。剪断心脏下行主血管。
87.(8)从右心室注入7ml e液。控制近针深度，防止扎穿室间隔。看到肺部充水膨胀，颜色变白且胸腔中流出大量血水(注射稍快，时长约1min，防止左心腔内凝血)。
88.(9)用弯止血钳夹住主动脉弓，尽量远离心底，剪断连接处，取出心脏，置于6cm培养皿中，吸管吸取少量e液润湿冲洗心脏表面。针头对准心底上2mm位置处，左心室注射10ml e液，此时注射要慢，时长约7min，观察左、右心耳的充盈程度，尤其是右心耳，若右心耳充盈良好，说明体外灌流建立成功。
89.(10)从左心室的原孔扎入针头，注射3ml p液，注射要慢，时长约3min。
90.(11)更换6cm培养皿。从左心室原孔扎入针头，缓慢注射15ml预热好的酶混合液。结束后从培养皿中吸取酶混合液，重复2-3遍，注射要慢，每遍时长约10min。
91.(12)观察心脏形态，拎起止血钳发现心脏下垂且质地变软，将心脏转移到另外一个新的6cm培养皿中，剪断心脏与止血钳的连接处，同时将左右心耳也一并剪去。
92.(13)吸取3ml酶混合液置于皿中，用精细镊分离心脏，成小颗粒状，若消化良好，该分离过程会相当容易，没有组织纤维的撕扯感。
93.(14)用吸管缓慢冲洗心脏颗粒，持续3min，冲洗过程尽量避免气泡的产生。
94.(15)加入5ml终止消化液，用吸管缓慢冲洗心脏终止消化。
95.(16)吸取一滴心肌细胞液，在显微镜下观察心肌细胞分离状况。
96.(17)在50ml离心管中，用100μm的细胞滤网过滤心脏颗粒悬液，过滤后转移至15ml离心管中，静置30min后，弃上清。
97.(18)吸取2ml钙恢复液1入离心管中，重悬后静置10min，弃上清。
98.(19)吸取2ml钙恢复液2入离心管中，重悬后静置10min，弃上清。
99.(20)吸取2ml钙恢复液3入离心管中，重悬后静置10min，弃上清。
100.(21)心肌细胞完成恢复钙离子。根据细胞沉淀的量，决定铺几个孔，6孔板每个孔需1ml pm，共聚焦皿每个孔需400μl pm，加入计算好的总pm至离心管中，重悬，得到提取好的心肌细胞悬液。将准备好的心肌细胞悬液，铺到laminin平板上。
101.(22)放入37℃恒温培养箱培养2h后，取出培养皿，将培养基更换成预热好的cm。
102.(23)完成分离成年小鼠原代心肌细胞的种植，准备进行其他各项试验。
103.1.3构建nmvms和amcms的缺血缺氧所致心肌细胞凋亡模型
104.选取新生乳鼠(出生后1-3天)提取nmvms或选取8周龄体重为18-25g雄性c57bl/6小鼠提取amcms，按照不同的氧气及培养基条件分为常氧组和缺血缺氧组。缺血缺氧组：将培养好的nmvms或amcms换上缺血缓冲液，并置于缺氧盒内(内含5％ co2、94％ n2及1％ o2混合气体)，在37℃缺氧专用培养箱中缺血缺氧处理12h(nmvms)或1h(amcms)。常氧组：将培养好的nmvms或amcms换上完全培养基，并置于常规的37℃细胞培养箱中。
105.缺血缓冲液的配制：118mmol/l氯化钠、24mmol/l碳酸氢钠、1.0mmol/l磷酸二氢钠、2.5mmol/l氯化钙、1.2mmol/l氯化镁、20mmol/l乳酸钠(国药集团化学试剂有限公司，30168018)、16mmol/l氯化钾and 10mmol/l 2-脱氧-d-葡萄糖(上海源叶生物科技有限公司，s11070)。超纯水定容至500ml，充分搅拌混匀后，盐酸调节ph至6.2，0.22μm滤器过滤后分装至50ml离心管中，4℃保存备用，1月内可用。
106.1.4检测缺血缺氧条件下nmvms或amcms中nudt12表达及nad
+
/nadh帽修饰水平
107.收集上述常氧组与缺血缺氧组nmvms或amcms，分别提取上述样本的总rna(trizol法)和蛋白，采用nad-capq检测缺血缺氧诱导的nmvms和常氧的nmvms中nad
+
/nadh帽总体修饰水平的改变。采用rt-qpcr及western blot检测缺血缺氧诱导的nmvms、amcms和常氧nmvms、amcms中nudt12的mrna和蛋白表达水平的改变。具体步骤参照以下：
108.1.4.1蛋白样品的制备
109.1.4.1.1细胞蛋白样品的制备：
110.(1)新鲜配制适量ripa裂解液，按ripa(细胞用ripa裂解液(中)，江苏碧云天生物技术有限公司，p0013c)、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(蛋白酶、磷酸酶、苯甲基磺酰氟三联装，上海威奥生物科技有限公司，wb0122)为100∶1∶1∶1的体积比配制。
111.(2)心肌细胞按相应条件处理好后，pbs清洗2遍，用200μl枪吸干净孔内残余液体，6孔板每孔加入120μl ripa细胞裂解液，6孔板置于冰上。
112.(3)细胞刮收集细胞，移入1.5ml ep管中并做好标记，ep管置于冰上。
113.(4)转步骤1.4.1.2(4)。
114.1.4.1.2组织蛋白样品的制备：
115.(1)新鲜配制适量ripa裂解液，按ripa(组织用ripa裂解液(强)，江苏碧云天生物技术有限公司，p0013b)、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、pmsf为100∶1∶1∶1的体积比例配制。
116.(2)取新鲜或-80℃冻存的组织置于1.5ml ep管(提前放入3颗钢研磨珠)中并做好
标记，每5mg组织加入120μl ripa裂解液，ep管置于冰上。研磨机提前预冷。
117.(3)将ep管放入组织研磨机中进行研磨：60hz，运行45s，暂停15s，次数15次。
118.(4)冰上裂解45min，期间每5min振荡一次以加速细胞/组织裂解。
119.(5)4℃、12000rpm离心30min，小心吸取上清液至另一新的1.5ml ep管。
120.(6)使用bca蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司，p0010)测定蛋白浓度。
121.1.4.2western blotting详细流程
122.(1)洗洁精洗净玻璃板，dd水冲洗，置于架子上晾干。
123.(2)将洗净晾干的长短玻璃板对齐后放入架中，两侧夹子夹紧，dd水检测密封性。
124.(3)按上述方法配制下层胶，用吸管将配制好的下层胶沿玻璃板灌入(前快后慢)，直至液面距短玻璃板上沿1.8cm处停止。加满无水乙醇液封(吸管平放，要慢)。
125.(4)待下层胶凝固(乙醇和胶的交界处有明显折线)，约20min，倒去乙醇，滤纸吸干。
126.(5)按上述方法配制上层胶，用吸管将配制好的上层胶沿玻璃板灌入，直至液面距短玻璃板上沿2mm处停止，小心插入齿梳，一定要避免气泡的产生。
127.(6)将配制好的胶板放入电泳槽内，两手捏住梳子两端，均匀用力向上拔出梳子。
128.(7)向内、外槽中加满1
×
电泳液。解冻蛋白样品，漩涡振荡混匀，按预先计算好的体积上样，样本左侧上样孔加6μl marker，右侧加3μl marker(标记上样顺序)。
129.(8)接通电源，开始电泳：
①
恒压60v，40min；
②
恒压110v，60min，待溴酚蓝到达下层胶底部时停止电泳。取出电泳槽，回收电泳液，流水下冲洗电泳槽，洗去泡沫，取下玻璃板(若每块玻璃板内蛋白样品不同，一定要做好标记)。
130.(9)脸盆打冰，配制1
×
电转液，用甲醇浸泡pvdf膜。准备一个搪瓷盘，倒入电转液，将转膜夹(含海绵垫和滤纸)、镊子、剥胶铲及玻璃板放入其中。用剥胶铲轻轻撬开玻璃板，分离出凝胶，将凝胶平铺在转膜夹上，随后将激活的pvdf膜覆盖在凝胶上，轻轻用剥胶铲赶走膜与凝胶之间的所有气泡。
131.(10)合上夹子，夹子放入电转槽(电转槽在装满冰的脸盆内)中，注意顺序，要使转膜夹白色面对电转槽红色面，转膜夹黑色面对电转槽黑色面。电转时会产生大量的热，在槽的空余面放入两个冰盒，槽内倒满预冷的电转液。
132.(11)接通电源，开始电转：恒流0.3a，80min(具体转膜时间需根据目的蛋白分子量来决定)。注意观察此时电压，若是电压过高(》160v)，可能是盒盖与电转槽接触不良，若是电压过低，低于90v，可能是电转液重复使用过多，此时需更换新鲜配制的1
×
电转液。初始电压最好在110-120v之间。
133.(12)转膜结束后，回收电转液，取出pvdf膜，在膜的正面做好标记(裁剪去膜的一角)，tbst清洗一遍，5min，弃tbst，倒入5％ bsa封闭液盖住膜面，室温下摇床上摇动封闭1h，回收bsa(可重复用3次)，tbst清洗1遍，5min。
134.(13)配制一抗，用一抗稀释液配制，绝大部分抗体都是按1∶1000稀释。一抗抗体信息：
①
hrp标记的β-actin优质内参，山东康成生物工程有限公司，kc-5a08，1∶4000tbst稀释。
②
nudt12 polyclonal antibody，武汉三鹰生物技术有限公司，17487-1-ap，1∶1000一抗稀释液(江苏碧云天生物技术有限公司，p0023a-500ml)稀释。
③
bax antibody，美国cst
公司，2772s，1∶1000一抗稀释液稀释。
④
bcl2 polyclonal antibody，武汉三鹰生物技术有限公司，26593-1-ap，1∶1000一抗稀释液稀释。
⑤
caspase 3/p17/p19 polyclonal antibody，武汉三鹰生物技术有限公司，19677-1-ap，1∶1000一抗稀释液稀释。
135.(14)根据目的蛋白分子量的大小裁剪条带(条带尽量宽一点，一张膜最多裁3个不同分子量的蛋白)，将裁剪好的条带放入相应的一抗溶液中，4℃摇床孵育过夜。
136.(15)次日室温复温30min，回收一抗，tbst清洗3遍，每遍10min，需摇床。
137.(16)目的蛋白条带二抗孵育1h，需摇床，β-actin条带不孵育二抗，可直接显影。二抗抗体信息：hrp标记山羊抗兔igg(h+l)，上海威奥生物科技有限公司，wb0177，1∶4000tbst稀释。
138.(17)孵育完成后，回收二抗，tbst清洗3遍，每次10min，需摇床。
139.(18)显影并采集图像：将条带放入bio-rad成像系统中，滤纸吸干膜上液体，均匀滴加适量显影液，获取显影结果。利用image lab分析条带灰度值。
140.1.4.3rna的提取(trizol法)和纯化
141.1.4.3.1细胞rna提取：
142.(1)心肌细胞按相应条件处理好后，pbs清洗2遍，用200μl枪吸干净孔内残余液体，6孔板每孔加入1ml trizol(gibco,15596018)，吹打10余次即可收集细胞至1.5ml ep管中。
143.(2)转步骤1.4.3.2(3)。
144.1.4.3.2组织rna提取：
145.(1)取新鲜或-80℃冻存的组织置于1.5ml去酶ep管(提前放入3颗无酶的氧化锆研磨珠，珠子要用镊子夹，不要用手去拿)中并做好标记，每25mg(不足25mg按25mg计算)组织加入1ml trizol，ep管置于冰上。研磨机提前20min预冷。
146.(2)将ep管放入组织研磨机中进行研磨：60hz，运行45s，暂停15s，次数15次。
147.(3)室温静置裂解10min，期间振荡一次以加速细胞/组织裂解。离心机提前预冷。
148.(4)每个无酶ep管中加入200μl氯仿(trizol∶氯仿＝5∶1)，剧烈振荡30s至粉乳白色，室温放置15min，期间每隔3min振荡一次，便于氯仿对rna的充分萃取。4℃、12000rpm离心20min，离心后，可见样品分成三层：上层为水相，中间层和下层为有机相，rna在上层水相中。
149.(5)用200μl移液枪小心吸取上层水相转移至新的1.5ml去酶ep管中(不要吸取任何中间层物质，否则会出现dna污染)，每管约400-500μl左右，加入等体积异丙醇，上下缓慢颠倒ep管混匀震荡30s，室温静置10min，4℃、12000rpm离心10min。离心后管侧面和底部可见白色沉淀(离心时ep管盖尾朝外，保证各个ep管中沉淀都在同一位置，便于观察)。直接缓慢倒掉上层液，留下白色沉淀。
150.(6)沿管壁加入1ml 75％乙醇(无水乙醇﹢depc水配制)，上下缓慢颠倒ep管混匀震荡15s。4℃、12000rpm离心5min。离心后管侧面和底部可见白色沉淀(沉淀比前面要更明显)。直接缓慢倾倒掉上层液，留下白色沉淀。用10μl的移液枪吸取ep管底部及管侧壁剩余乙醇(动作缓慢，切勿吸取沉淀)，倒放ep管至滤纸上，晾干沉淀，10min左右(随时观察，可缩短晾干时长)。
151.(7)每管ep管中加入20μl depc水溶解rna，适度震荡，保证沉淀充分溶解。
152.(8)超微量紫外/可见分光光度计测量rna浓度(准备2μl移液枪、枪头、depc水)。
153.1.4.4rt-qpcr详细流程
154.(1)逆转录试剂盒(rr036a)购买于日本takara公司，反应体系为20μl。逆转录反应所需的样品总rna上样量为1000ng。
155.(2)逆转录pcr反应程序设置：37℃、15min
→
85℃、5s
→
4℃、静置。
156.(3)逆转录完成后，cdna样本中加入80μl depc水进行稀释，-20℃保存备用。
157.(4)按下述rt-qpcr反应体系配制pcr反应液：5μl sybr green(上海翌圣生物科技股份有限公司，11201es08)、0.5μl前/后引物(北京擎科生物科技有限公司)、1μl cdna、3μl depc水。
158.小鼠，β-actin前引物，seq id no.2：catggatgacgatatcgctg；
159.小鼠，β-actin后引物，seq id no.3：gtccttctgacccattccc；
160.小鼠，nudt12前引物，seq id no.4：atcacttgtcaataaagcgaggc；
161.小鼠，nudt12后引物，seq id no.5：cttcccaccttttgcatttgc。
162.(5)上样，贴封板膜，离心pcr板以去除气泡，上机检测。
163.(6)rt-qpcr扩增程序设置(两步法)：95℃、5min(预变性)
→
95℃、10s(变性)
→
60℃、30s(退火/延伸)
→
95℃、5s
→
60℃、1min
→
95℃、0.1℃/s(熔融)。
164.(7)导出并分析数据，以β-actin做为管家基因进行标准化，2
‑△△
ct法分析目的基因的相对表达量(对照组和处理组均需3个生物学重复)。
165.1.4.5nad-capq详细流程
166.(1)用上述trizol法提取细胞/组织总rna至晾干沉淀。
167.(2)每管rna加入400μl溶液a(2m尿素+10mm tris-hcl溶液)，65℃孵育2min(去除残留nad
+
)。
168.(3)每管中加入350μl 8.57m乙酸铵溶液和750μl异丙醇(混匀后，乙酸铵终浓度为2m)，上下缓慢颠倒ep管混匀震荡30s，室温静置10min。4℃、12000rpm离心10min。直接缓慢倾倒掉上层液，留下白色沉淀。
169.(4)沿管壁加入1ml 75％乙醇(无水乙醇+depc水配制)，上下缓慢颠倒ep管混匀震荡15s。4℃、12000rpm离心5min。直接缓慢倾倒掉上层液，留下白色沉淀。用10μl的移液枪吸取ep管底部及管侧壁剩余乙醇(动作缓慢，切勿吸取沉淀)。倒放ep管至滤纸上，晾干沉淀，10min左右。
170.(5)每管ep管中加入25μl溶液b(20μm zncl2﹢10mm tris-hcl溶液)用以溶解rna，适度震荡，充分溶解(此时用25μl溶液b同时溶解相同处理条件下的2管6cm中的rna，将其合并为1管)。
171.(6)超微量紫外/可见分光光度计测量rna浓度。期待rna浓度》2800ng/μl。
172.(7)每管中吸出50μg rna，计算所需体积，移入新的200μl去酶ep管中，用depc水定容至18μl。
173.(8)每管加2μl核酸酶p1(sigma-aldrich,n8630-1vl)，充分混匀，得到20μl体系，37℃消化30min，以释放rna 5’末端全部连接的nad
+
/nadh帽。消化结束后将ep管置于冰上。
174.(9)消化结束后得到的游离nad
+
/nadh通过江苏碧云天生物技术有限公司生产的nad
+
/nadh检测试剂盒(s0175)进行检测。
175.1.5通过结扎c57bl/6小鼠冠状动脉左前降支诱导急性心肌梗死模型
176.选取8周龄体重为18-25g雄性c57bl/6小鼠。按照不同的手术条件将选取的小鼠平均分为假手术组和心肌梗死组。心肌梗死组：通过挤心脏法，6-0手术缝线结扎左前降支建立小鼠急性心肌梗死模型。假手术组：在相应位置穿6-0手术缝线而不进行结扎，其余处理与手术组相同。
177.1.6检测缺血所致心肌梗死标本中nudt12表达及nad
+
/nadh帽修饰水平
178.收集上述假手术组与心肌梗死造模术后1天、3天、7天梗死边缘区组织，分别提取上述样本的total rna和蛋白，采用nad-capq检测ami术后1天、3天、7天心梗交界区组织和假手术组中组织中nad
+
/nadh帽修饰水平的改变。采用rt-qpcr和western blot检测ami术后1天、3天、7天心梗交界区组织和假手术组中组织中nudt12的mrna和蛋白表达水平的改变。
179.1.7检测nudt12基因过表达对nmvms的功能影响
180.构建腺病毒(上海汉恒生物科技有限公司，gc20210916lch-ad01)过表达nudt12(seq id no.1)的nmvms作为实验组，同时采用腺病毒空载体感染的nmvms作为对照组，按前述方法使用缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡。直至缺血缺氧处理12h后检测nmvms内nad
+
/nadh帽修饰水平、线粒体形态结构、线粒体活性氧水平、线粒体膜电位、细胞内atp含量以及细胞凋亡水平。
181.1.7.1腺病毒载体的构建
182.构建步骤如下：(1)载体酶切；(2)获取目的片段；(3)目的片段nudt12与载体连接；(4)转化；(5)菌液pcr鉴定；(6)测序；(7)质粒抽提；(8)腺病毒载体重组。腺病毒载体的克隆位点为kpni(见图11)。
183.1.7.2腺病毒转染nmvms的具体实验步骤：
184.(1)将原代nmvms均匀种于6孔板或共聚焦皿中，待48h后观察心肌细胞的贴壁情况。分别收集6孔板或共聚焦皿2个孔的细胞并进行细胞计数，其余孔吸去培养基，pbs清洗2遍后，重新添加1ml或250μl新鲜培养基。
185.(2)取出病毒(ad-ctrl组和ad-nudt12过表达组)置于4℃冰箱慢慢融化，根据摸索的moi值(moi＝100)计算出每孔所需的病毒体积，按计算的量将病毒加入到nmvms中，摇晃混匀后放回培养箱内继续培养，6h后补足培养基至2ml或500μl。感染24h后，吸去含病毒的培养基，pbs清洗2遍，换上新鲜的完全培养基继续培养24h。收集细胞用于后续实验。
186.1.8检测心肌细胞内nad
+
/nadh帽修饰水平
187.缺氧12h后trizol收集nmvms，提取rna行rt-qpcr检测nudt12的表达水平。缺氧12h后trizol收集nmvms，提取rna行nad-capq检测细胞内nad
+
/nadh帽修饰的变化。
188.1.9检测心肌细胞线粒体形态结构
189.缺氧12h后细胞刮收集nmvms，电镜固定液固定后行常规812包埋剂包埋至切片。切片制作完成后透射电子显微镜观测线粒体形态结构。
190.1.10检测心肌细胞线粒体活性氧水平
191.nmvms缺氧12h后，避光加入mitosox指示剂工作液(thermo fisher,m36007)，37℃避光孵育30min后再加入hoechst活细胞染色液(江苏碧云天生物技术有限公司，c1028)，室温避光孵育10min后olympus倒置激光共聚焦显微镜观察线粒体活性氧的变化。
192.1.11检测心肌细胞线粒体膜电位
193.nmvms缺氧12h后，避光加入jc-1染色工作液(江苏碧云天生物技术有限公司，c2003s)，37℃避光孵育20min后，倒置荧光显微镜观察线粒体膜电位的变化。
194.1.12检测心肌细胞内atp含量
195.采用增强型atp检测试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司，s0027)检测细胞内atp。缺氧12h后细胞刮收集nmvms。atp检测裂解液裂解细胞后离心收集上清，加入atp检测工作液，利用多功能酶标仪中检测rlu值，绘制标准曲线线性方程，根据rlu值计算待测样品中atp的浓度，并用bca蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白的浓度，最终把atp的浓度换算成nmol/mg蛋白的形式。
196.1.13检测心肌细胞凋亡水平
197.nmvms缺氧12h后，4％多聚甲醛固定细胞，0.3％的triton x-100(上海威奥生物科技有限公司，wf0193)细胞破膜处理后，避光加入tunel检测液(江苏碧云天生物技术有限公司，c1090)，37℃避光孵育60min后滴加含dapi的抗荧光淬灭封片液(江苏碧云天生物技术有限公司，p0131)封片处理，olympus倒置激光共聚焦显微镜观察心肌细胞凋亡水平的变化。缺氧12h后细胞刮收集nmvms，提取蛋白行western blot检测凋亡相关蛋白水平的改变。
198.1.14检测nudt12基因过表达对心梗小鼠心功能影响
199.通过小鼠尾静脉注射腺相关病毒载体(上海汉恒生物科技有限公司，hh20220319lch-aav01)，其中注射过表达nudt12(seq id no.1)的腺相关病毒载体的c57bl/6小鼠作为实验组，同时注射腺相关病毒空载体的c57bl/6小鼠作为对照组，按1.5方法结扎冠状动脉左前降支诱导急性心肌梗死模型。至心梗后3天检测心梗早期梗死边缘区心肌组织内nad
+
/nadh帽修饰水平、心梗早期心肌组织的凋亡水平以及心梗早期小鼠心功能变化，至心梗后28天检测心梗远期心肌组织的纤维化程度以及心梗远期小鼠心功能变化。
200.1.14.1腺相关病毒载体的构建
201.具体步骤：(1)载体酶切；(2)获取目的片段；(3)目的片段nudt12与载体连接；(4)转化；(5)菌液pcr鉴定；(6)测序；(7)质粒抽提。腺相关病毒的克隆位点为kpni(见图12)。
202.1.14.2腺相关病毒转染c57小鼠
203.具体实验步骤如下：
204.(1)病毒感染前穿好实验服，戴好手套、面罩及口罩，注意防护。
205.(2)取出病毒(aav-ctrl组和aav-nudt12过表达组)置于4℃冰箱慢慢融化，稀释好病毒，本实验以1
×
10
12
vg/ml的病毒滴度对小鼠进行尾静脉注射。
206.(3)取4周龄c57bl/6j雄鼠，将小鼠固定于小鼠尾静脉注射仪上，胰岛素针吸取100μl上述滴度的病毒液通过尾静脉注射入小鼠体内。
207.(4)4周后取材，收取心脏组织。采用rt-qpcr实验及western blot实验检测腺相关病毒介导的nudt12过表达情况。若过表达成功，采用上述同样方法构建nudt12心肌特异性过表达小鼠用于后续实验。
208.1.15检测心梗边缘区组织内nad+/nadh帽修饰水平
209.心梗术后3天收集心梗边缘区组织，提取rna行rt-qpcr检测nudt12的表达水平。心梗术后3天收集心梗边缘区组织，提取蛋白行western blot检测nudt12的表达水平。心梗术后3天收集心梗边缘区组织，提取rna行nad-capq检测nad
+
/nadh帽修饰的变化。
210.1.16检测心肌组织细胞凋亡水平
211.心梗术后3天收集心梗边缘区组织，提取蛋白行western blot检测凋亡相关蛋白水平的改变。
212.1.17检测心肌细胞机械性能变化
213.心梗术后3天，分离提取成年小鼠心肌细胞(amcms)，用ionoptix肌细胞收缩测量系统检测amcms的机械性能，一个心肌细胞只测定一条曲线，每只小鼠测定15条曲线；另外每条曲线至少包含5个连续的完整收缩和舒张波峰/波谷。数据分析统计，主要通过以下指标来评估amcms的机械性能：静息细胞长度、细胞最大收缩长度(ps)、细胞收缩时间(tps)、返回静息细胞长度的90％所需的时间(tr90)、细胞收缩/舒张的最大速度(
±
dl/dt)。
214.1.18检测心梗早期小鼠心功能变化
215.心梗术后3天，行小动物超声检测以评估心脏的几何结构和功能。获得胸骨旁长轴视图，同时记录心率(小鼠心率尽量稳定在450-550次/分)。得到心脏几何形状和功能指标：射血分数(ef)、缩短分数(fs)、舒张末期左室后壁厚度(lvpwd)、收缩末期左室后壁厚度(lvpws)、舒张末期室间隔厚度(ivsd)、收缩末期室间隔厚度(ivss)、左室舒张末期内径(lvidd)与左室收缩末期内径(lvids)。每个测量指标至少经过5个连续的心脏周期取平均值。
216.1.19心脏组织标本切片染色检测
217.心梗术后28天心脏取材，充分生理盐水灌洗后，4％多聚甲醛固定，行常规石蜡包埋及切片。切片制作完成后常规脱蜡水化，行he和masson染色观察心肌组织的纤维化程度。
218.1.19.1苏木精-伊红染色(he)具体步骤
219.(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min
→
二甲苯ⅱ15min(上述两步需摇床)
→
无水乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
80％乙醇5min
→
70％乙醇5min(无需摇床)
→
自来水冲洗5min
→
pbs清洗3遍，每遍5min。
220.(2)苏木素染细胞核：将处理好的切片放入苏木素染液中浸泡5min，dd水洗去残余染液，分化液(1％的盐酸乙醇)分化数秒，自来水冲洗10min。
221.(3)伊红染细胞质：将冲洗好的切片移入伊红染液中，浸泡3min，自来水冲洗2min。
222.(4)梯度乙醇脱水：将切片依次移入95％乙醇ⅰ2min
→
95％乙醇ⅱ4min
→
无水乙醇ⅰ5min
→
无水乙醇ⅱ5min
→
二甲苯ⅰ10min
→
二甲苯ⅱ10min中脱水透明。
223.(5)封片：将脱水透明成功的切片从二甲苯溶液中拿出，稍晾干，中性树胶封片。
224.(6)leica正置光学显微镜镜检，图像采集分析。
225.1.19.2马松染色(masson)具体步骤
226.(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min
→
二甲苯ⅱ15min(上述两步需摇床)
→
无水乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
80％乙醇5min
→
70％乙醇5min(无需摇床)
→
自来水冲洗5min
→
pbs清洗3遍，每遍5min。
227.(2)将处理好的切片浸入媒染液中，室温条件下媒染过夜。次日流水冲洗10min。
228.(3)切片稍晾干，用免疫组化笔在每个载玻片的组织标本外围画一圈。
229.(4)滴加天青石蓝染色液(抗酸，使苏木素颜色不易褪去，加深细胞核的染色)，孵育3min后，dd水快速清洗2遍，每遍10s左右。
230.(5)切片稍晾干，滴加mayer苏木素染色液，孵育3min后，dd水快速清洗2遍。
231.(6)酸性分化液分化数秒，组织完全变红，自来水冲洗10min，随后dd水清洗切片。
232.(7)切片稍晾干，滴加丽春红品红染色液，孵育10min后，dd水快速清洗2遍。
233.(8)切片稍晾干，滴加磷钼酸溶液，孵育10min后，稍甩干切片，直接滴加苯胺蓝染色液，孵育5-20min(随着试剂存放时间的延长，可适时延长苯胺蓝浸染时间)。
234.(9)用弱酸溶液清洗切片以去除滴加的苯胺蓝，切片稍晾干，滴加弱酸溶液处理2min。
235.(10)梯度乙醇脱水：将处理好的切片依次移入95％乙醇2min
→
无水乙醇ⅰ2min
→
无水乙醇ⅱ2min
→
二甲苯ⅰ2min
→
二甲苯ⅱ2min中脱水透明。
236.(11)封片：将脱水透明成功的切片从二甲苯溶液中取出，稍晾干，中性树胶封片。
237.(12)leica正置光学显微镜镜检，图像采集分析。
238.1.20检测心梗远期小鼠心功能变化
239.心梗术后28天，行小动物超声检测以评估心脏的几何结构和功能。具体操作步骤同1.18。
240.2实验结果
241.以下各图中，*表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.05；**表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.01；***表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.001；****表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.0001。
242.如图1所示，通过nad-capq、rt-qpcr和western blot分别检测缺血缺氧诱导的nmvms或amcms中nad
+
/nadh帽修饰及nudt12的表达水平，发现在缺血缺氧诱导处理的心肌细胞中nad
+
/nadh帽的修饰发生了显著的上调，而nudt12的表达发生了显著的下调。
243.如图2所示，通过nad-capq、rt-qpcr和western blot分别检测冠状动脉左前降支结扎诱导的急性心肌梗死模型中缺血心肌组织内nad
+
/nadh帽修饰及nudt12的表达水平，发现在心梗术后3天nad
+
/nadh帽的修饰开始逐渐上调并维持在较高水平，而nudt12的表达在心梗术后3天开始逐渐下调并维持在较低水平。
244.如图3-5所示，过表达nudt12可以显著改善缺血缺氧12h对nmvms功能表型的抑制作用，如显著减轻nmvms线粒体微结构的损伤，显著减少nmvms线粒体mitosox的产生，显著升高线粒体膜电位，显著增加细胞atp的合成，显著增强nmvms的抗凋亡能力。
245.如图6-10所示，过表达nudt12可以显著改善缺血对心肌组织功能表型的抑制作用，如维持组织内心肌细胞的收缩，显著减少心梗早期心肌组织的凋亡及显著改善小鼠的心功能，显著减少心梗远期心肌组织的纤维化程度以及显著改善小鼠的心功能。
246.综上，通过过表达nudt12来干预缺血缺氧诱导的nmvms凋亡与缺血诱导的心肌梗死，可以得出nudt12过表达后，可显著改善缺血缺氧诱导的nmvms功能和缺血诱导的心肌梗死小鼠的心功能。因此本发明为临床上诊治缺血缺氧所致急性心肌梗死提供了新的靶点和策略。

技术特征：
1.nudt12基因在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用，其特征在于，所述的药物中包括过表达nudt12基因的载体。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的急性心肌梗死包括急性st段抬高型心肌梗死，急性非st段抬高型心肌梗死，缺血性心肌病或心力衰竭。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物用于增强心肌细胞的抗凋亡能力或改善心肌纤维化。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的载体为病毒载体，优选为腺病毒载体或腺相关病毒载体。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的病毒载体的插入序列为seq id no.1。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的腺病毒载体的克隆位点为kpni。7.一种用于治疗急性心肌梗死的药物，其特征在于，包括过表达nudt12基因的病毒载体。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的载体为腺病毒载体或腺相关病毒载体。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述的载体上的插入序列为seq id no.1，克隆位点为kpni。10.根据权利要求7-9任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及过表达Nudt12在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。本发明公开了核苷二磷酸连接部分X型基元12(Nudt12)在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。本发明通过建立新生小鼠心肌细胞缺血缺氧后致细胞凋亡模型和结扎小鼠冠状动脉左前降支后致急性心肌梗死模型，发现Nudt12过表达后，可显著减轻缺血缺氧条件下心肌细胞的氧化应激及凋亡水平，增加ATP的合成，增强心肌细胞的抗凋亡能力以及显著减少心梗后心肌纤维化及心肌梗死的面积，维持心肌细胞的收缩，改善心梗小鼠的心功能。本发明为临床上诊治急性心肌梗死所致心力衰竭提供了新的靶点和策略。肌梗死所致心力衰竭提供了新的靶点和策略。肌梗死所致心力衰竭提供了新的靶点和策略。


技术研发人员：赵永超 熊卫东 王艳 韩韦钰 邓熠 张巍 刘志江 赵然尊 葛均波 石蓓
受保护的技术使用者：遵义医科大学附属医院
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/9/20