黄篮状菌菌株TF-04在小麦增产和/或抗病中的应用的制作方法

黄篮状菌菌株tf-04在小麦增产和/或抗病中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及黄篮状菌菌株tf-04在小麦增产和/或抗病中的应用。


背景技术：

2.我国是农业大国，也是人口大国，因而小麦的需求量在逐年增加。农业用地的减少和小麦作物的严重病害使得小麦收成存在较大问题。过去我们大量使用化肥农药使小麦增产。但土壤中的n、p以及k的利用率极低，造成了大量的浪费以及严重污染等问题，对人类健康形成威胁。因此，利用自然筛选的微生物来解决小麦生长问题，减少使用化肥农药进而解决土壤化肥农药污染的问题刻不容缓。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供一种黄篮状菌菌株tf-04在小麦种植中的应用。
4.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
5.本发明提供了黄篮状菌菌株tf-04在小麦种植中的应用，所述应用包括以下(1)～(3)中的一种或两种以上：
6.(1)小麦促生；
7.(2)小麦增产；
8.(3)提高小麦抗病能力。
9.优选的，所述小麦促生包括以下(1)～(5)中的任一种或两种以上：
10.(1)促进小麦植株矮壮；
11.(2)促进小麦叶生长；
12.(3)提高小麦光合作用；
13.(4)促进小麦对营养元素的吸收；
14.(5)增强小麦根系活力。
15.优选的，所述小麦抗病能力包括小麦抗叶锈病的能力。
16.本发明提供了一种小麦促生、增产和/或抗病的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液的制备方法，包括以下步骤：
17.将黄篮状菌菌株tf-04在培养基中进行培养，分离分生孢子，得到分生孢子悬浮液。
18.优选的，所述培养基包括pda培养基；所述培养的温度为24～30℃；所述培养的时间为7～10d；所述培养为暗培养。
19.优选的，所述分生孢子悬浮液中分生孢子的浓度为1
×
107cfu/ml～1
×
109cfu/ml。
20.本发明提供了一种小麦促生、增产和/或抗病的菌肥的制备方法，包括以下步骤：
21.将上述技术方案所述制备方法制备得到的分生孢子悬浮液进行固体发酵培养，得
到小麦促生、增产和/或抗病的菌肥。
22.优选的，所述固体发酵培养的培养基质包括麦麸和稻壳的混合物；所述麦麸和稻壳混合的质量比为(1～1.3)：(1～0.7)；所述培养基质的含水量为60％～70％。
23.优选的，所述固体发酵培养包括暗培养和光培养；
24.所述暗培养的温度为24～30℃；所述暗培养的时间为4～6d；
25.所述光培养的温度为24～30℃；所述光培养的时间为12～20d；所述光培养的光照时间为10h/d～14h/d。
26.本发明提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的菌肥的使用方法，包括以下步骤：
27.将菌肥进行拌种使用；进行拌种时，所述种子与菌肥的质量比为(2～20)g：0.75kg。
28.本发明的有益效果：
29.本发明提供了黄篮状菌菌株tf-04在在小麦种植中的应用，所述应用包括小麦促生、小麦增产和提高小麦抗病能力中的一种或两种以上。
30.本发明将黄篮状菌菌株tf-04应用于小麦种植中，能够达到小麦促生、增产和抗病的效果。通过实施例结果表明：将黄篮状菌菌株tf-04的分生孢子悬液和黄篮状菌菌株tf-04菌肥应用于小麦种植体系中，能够提高小麦种子萌发率，促进小麦植株矮壮；提高小麦叶的长度和宽度；提高小麦叶的叶绿素含量和光合作用速率；增加小麦叶中n和p的含量；增强小麦根系活力；和提高小麦的叶锈病抗性。本发明所述黄篮状菌菌株tf-04菌肥能够促进小麦增产，增加小麦千粒重。
31.生物保藏说明
32.本发明所述的黄篮状菌菌株tf-04，分类命名：黄篮状菌tf-04(talaromyces flavus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2021078，保藏日期2021年1月15日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为小麦种子恒温保湿培养3d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的生长状况图；
35.图2为小麦种子种植45d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的生长情况图；
36.图3为小麦种子种植45d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的和株高、鲜重统计结果图；
37.图4为小麦扬花期对照4-0组和试验4-3组小麦田间生长情况图；
38.图5为小麦扬花期对照4-0组、试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组小麦旗叶长和宽的统计结果图；
39.图6为小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦旗叶叶
绿素含量统计结果图；
40.图7为小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照组4-1小麦旗叶光合作用速率统计结果图；
41.图8为小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦旗叶中总氮和总磷的检测结果图；
42.图9为小麦根系活力测定中绘制的标准曲线；
43.图10为小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦根系活力统计结果图；
44.图11为对照4-0组叶锈病发病情况图；
45.图12为试验4-1组叶锈病发病情况图；
46.图13为试验4-2组叶锈病发病情况图；
47.图14为试验4-3组叶锈病发病情况图；
48.图15为叶锈病发病的病情指数结果图；
49.图16为小麦成熟期试验4-3组和对照4-0组的生长状况图；
50.图17为小麦成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的千粒重统计结果图；
51.图18为小麦成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的产量统计结果。
具体实施方式
52.本发明提供了黄篮状菌菌株tf-04在小麦麦种植中的应用，所述应用包括以下(1)～(3)中的一种或两种以上：
53.(1)小麦促生；
54.(2)小麦增产；
55.(3)提高小麦抗病能力。
56.在本发明中，所述黄篮状菌菌株tf-04同专利202110143650.1中所述的黄篮状菌菌株tf-04；所述黄篮状菌菌株tf-04的生物学信息和保藏信息，详见专利202110143650.1中的记载。本发明所述黄篮状菌菌株tf-04的保藏编号为cctcc no：m 2021078。本发明所述黄篮状菌菌株tf-04的保存方式优选包括将黄篮状菌菌株tf-04在pda斜面4℃保存或者将黄篮状菌菌株tf-04的分生孢子悬浮液在体积百分含量为20％的甘油水溶液中-80℃冻存。
57.在本发明中，所述黄篮状菌菌株tf-04能够对小麦产生促生作用。在本发明中，所述小麦促生优选包括以下(1)～(5)中的任一种或两种以上：
58.(1)促进小麦植株矮壮；
59.(2)促进小麦叶生长；
60.(3)提高小麦光合作用；
61.(4)促进小麦对营养元素的吸收；
62.(5)增强小麦根系活力。
63.在本发明中，所述小麦促生优选包括提高小麦种子萌发率。本发明采用黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液对小麦种子进行浸泡处理后，对小麦种子的萌发率无显著影响。
64.在本发明中，所述小麦促生优选包括促进小麦植株矮壮。本发明所述促进小麦植株矮壮优选包括降低小麦地上部株高和提高小麦地上部鲜重。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能显著降低小麦地上部株高和提高小麦地上部鲜重，使植株矮壮。本发明所述黄篮状菌菌株tf-04能够通过促进小麦植株矮壮，增强小麦的抗倒伏能力。
65.在本发明中，所述小麦促生优选包括促进小麦叶的生长。本发明所述促进小麦叶的生长优选包括提高小麦的叶面积；更优选包括提高小麦叶的长度和/或宽度。在本发明中，所述小麦叶优选包括小麦旗叶。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够显著提高小麦旗叶的叶面积，进一步可增强小麦的光和作用。
66.在本发明中，所述小麦促生优选包括提高小麦光合作用。本发明所述提高小麦光合作用优选包括提高小麦叶的叶绿素含量和/或提高小麦光合速率。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够显著提高田间扬花期小麦旗叶的叶绿素含量和光合速率。
67.在本发明中，所述小麦促生优选包括促进小麦对营养元素的吸收。在本发明中，所述营养元素优选包括n和p。在本发明中，所述黄篮状菌菌株tf-04能够显著提高小麦扬花期旗叶中的总n和总p含量。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够促进小麦对n和p的吸收，从而显著提高小麦叶中总n和总p的含量，进一步为叶绿素和光合产物的合成提供充足的营养元素。
68.在本发明中，所述小麦促生优选包括增强小麦根系活力。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够显著提高小麦田间扬花期的根系脱氢酶的活力。
69.本发明所述增产优选包括增加小麦千粒重。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够显著增加小麦的千粒重，增加小麦的产量。
70.本发明所述提高小麦抗病能力优选包括提高小麦对叶锈病的抗性。本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04能够显著减小小麦叶锈病的发病情况。
71.本发明提供了一种小麦促生、增产和/或抗病的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液的制备方法，包括以下步骤：
72.将黄篮状菌菌株tf-04在培养基中进行培养，分离分生孢子，得到分生孢子悬浮液。
73.本发明将黄篮状菌菌株tf-04在培养基中进行培养。
74.在本发明中，所述培养基优选包括pda培养基。在本发明中，对pda培养基的来源和制备方法没有特殊限制。在本发明中，所述培养的温度优选为24℃～30℃，更优选为28℃；所述培养的时间优选为7～10d，更优选为9d；所述培养的方式优选为暗培养。
75.培养完成后，本发明分离分生孢子，得到分生孢子悬浮液。
76.本发明分离分生孢子优选包括洗下分生孢子和过滤。本发明洗下分生孢子优选采用无菌水进行，具体方法优选为：为在菌落表面添加无菌水，使用无菌的棉签轻轻摩擦菌落表面，洗下形成的分生孢子。洗下分生孢子后，本发明对分生孢子液进行过滤。本发明所述过滤优选采用3层无菌擦镜纸进行；过滤所得滤液即为黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬浮液。在本发明中，所述分生孢子悬浮液中分生孢子的浓度优选为1
×
107cfu/ml～1
×
109cfu/ml，更优选为1
×
108cfu/ml。
77.本发明提供了一种小麦促生、增产和/或抗病的菌肥的制备方法，包括以下步骤：
78.将上述技术方案所述制备方法制备得到的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬浮液进
行固体发酵培养，得到小麦促生、增产和/或抗病的菌肥。
79.本发明所述固体发酵培养的培养基质优选包括麦麸和稻壳的混合物。在本发明中，所述麦麸和稻壳混合的质量比为(1～1.3)：(1～0.7)，更优选为1:1；所述培养基质的含水量为60％～70％，更优选为65％。本发明对麦麸和稻壳的来源没有特殊限制，采用本领域常规产品即可。得到固体发酵培养的培养基质后，本发明优选将培养基质进行灭菌。在本发明中，所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为2h。得到灭菌后的培养基质后，本发明优选将黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬浮液接种于培养基质中。在本发明中，所述接种的接种量优选为培养基质的质量的1％。本发明进行接种时分生孢子悬浮液中的分生孢子浓度优选为1
×
107cfu/ml。接种完成后，本发明进行培养。本发明所述培养优选包括暗培养和光培养，更优选为先进行暗培养，暗培养结束后，进行光培养。本发明所述暗培养的温度优选为24℃～30℃，更优选为28℃；所述暗培养的时间优选为4～6d，更优选为5d。本发明在暗培养阶段优选每天对培养基质进行摇匀；所述摇匀的次数优选为2次；所述摇匀优选在每天早上和晚上进行。本发明对摇匀的时间没有特殊限定，只要在相应的时间段均可。本发明所述光培养的温度为24℃～30℃，更优选为28℃；所述光培养的时间优选为12～20d，更优选为15d；所述光培养的光照时间优选为10h/d～14h/d，更优选为12h/d。固体发酵培养完成后，本发明优选将固体发酵产物打散拌匀，得到小麦促生、增产和/或抗病的菌肥。在本发明中，所述小麦促生、增产和/或抗病的菌肥的分生孢子含量优选为1
×
108～1
×
109cfu/g，更优选为1
×
109cfu/g。
80.本发明还提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的菌肥的使用方法，包括以下步骤：
81.将菌肥进行拌种使用；进行拌种时，所述种子与菌肥的质量比为(2～20)g：0.75kg。
82.本发明将小麦种子进行拌种前，优选对小麦种子进行表面消毒和吸水处理。本发明所述表面消毒的试剂优选包括84消毒液水溶液；所述84消毒液中次氯酸钠的质量百分含量优选为5％，84消毒液与水的体积比优选为1:19。本发明所述表面消毒的时间优选为6～10min，更优选为10min。表面消毒完成后，本发明优选将种子用水冲洗后进行吸水处理。本发明所述冲洗用水优选为无菌水；所述冲洗的次数优选为3次。本发明所述吸水处理优选将种子置于清水中进行吸水；所述吸水的时间优选为4～8h，更优选为6h。本发明进行拌种时，所述种子与菌肥的质量比为(2～20)g：0.75kg；更优选为10g：0.75kg。
83.本发明还提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的分生孢子悬浮液的使用方法，包括：使用分生孢子悬浮液浸泡种子。
84.本发明将小麦种子进行浸泡前，优选对小麦种子进行表面消毒和吸水处理。本发明所述表面消毒的试剂优选包括84消毒液水溶液；所述84消毒液中次氯酸钠的质量百分含量优选为5％，84消毒液与水的体积比优选为1:19。本发明所述表面消毒的时间优选为6～10min，更优选为10min。表面消毒完成后，本发明优选将种子用水冲洗后进行吸水处理。本发明所述冲洗用水优选为无菌水；所述冲洗的的次数优选为3次。种子冲洗完成后，本发明使用分生孢子悬浮液浸泡种子。本发明所述浸泡优选使液体刚好淹没种子；本发明所述浸泡的时间优选为12～24h，更优选为24h。
85.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详
细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
86.应用例中的结果分析使用excel和prism进行统计分析。
87.实施例1
88.黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液的制备方法，步骤如下：
89.pda培养基配制：每升培养基中添加马铃薯200g和葡萄糖20g。
90.制备得到pda培养基后，取黄篮状菌菌株tf-04接种于pda培养基中，进行暗培养，培养的温度为28℃，培养的时间为9d。
91.培养完成后，在菌落表面添加无菌水，使用无菌的棉签轻轻摩擦菌落表面，洗下形成的分生孢子，将分生孢子悬浮液通过3层无菌擦镜纸过滤后，获得黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液。获得分生孢子数为1
×
107cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液和分生孢子数为1
×
108cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液。
92.实施例2
93.一种小麦促生、增产和/或抗病的菌肥的制备方法，步骤如下：
94.固体发酵培养的培养基质的配制：将麦麸和稻壳按照质量比为1:1的比例混合后，调节混合体系的含水量为65％，121℃灭菌2h，得到固体发酵培养的培养基质。
95.将实施例1制备得到的1
×
107cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液按培养基质质量的1％进行接种，28℃暗培养5d，暗培养期间每天早晚各摇匀一次。
96.暗培养结束后，28℃光培养15d，光培养的光照时间为12h/d。光培养过程中不需要进行摇匀操作。
97.光培养完成后，将固体发酵产物打散拌匀，得到小麦促生、增产和/或抗病的菌肥。所述菌肥中分生孢子的数量为1
×
109cfu/g。
98.实施例3
99.使用实施例1制备得到的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液处理种子，作为小麦种子处理a，方法具体为：
100.利用84消毒液(84消毒液中次氯酸钠的质量百分含量为5％)与水体积比1：19的84消毒液水溶液对小麦种子进行表面消毒10min，无菌水冲洗3次。室温条件下将小麦种子浸泡在无菌水中作为对照3-0组；室温条件下将小麦种子浸泡在实施例1制备的1
×
107cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液中作为试验3-1组；室温条件下将小麦种子浸泡在实施例1制备的1
×
108cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液中作为试验3-2组。
101.进行浸泡时，使液体刚好淹没小麦种子。浸泡时间为24h，浸泡完成后小麦种子萌动，即可直接播种。
102.应用例1
103.1.种子萌发实验
104.将实施例3中对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组浸泡完成后的小麦种子置于含水蛭石中进行培养，蛭石中的含水量为70％，20℃恒温条件保湿培养3d。
105.其中，对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组中每个处理组设置三个平行重复，每个重复100粒小麦种子。统计每个平行重复中萌芽的种子数量，计算萌发率。
106.小麦种子恒温保湿培养3d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的生长状况图如图1所示。其中图1中的a为试验3-1组处理的小麦种子的萌发情况；图1中的b为试验3-2组
处理的小麦种子的萌发情况；图1中c为对照3-0组处理的小麦种子的萌发情况。对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组处理的种子恒温保湿培养3d后种子萌发率如表1所示。
107.表1对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组处理的种子恒温保湿培养3d后种子萌发率
108.组发芽率(％)试验3-1组65
±
2.00试验3-2组72
±
3.05对照3-0组68
±
2.96
109.由表1和图1可得，对照3-0组、试验3-1和试验3-2组组培养3d后小麦种子的萌发率之间没有显著的区别。表明高浓度tf-04孢子悬液处理对小麦种子能在一定程度上提高小麦种子的发芽率。
110.2.温室栽培实验
111.将实施例3中对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组浸泡完成后的小麦种子种植于基础培养土中，温室条件下进行栽培。
112.基础培养土配方为：按质量比为黄土：腐殖土：育苗基质＝1:1:1。
113.其中，对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组中每个处理组设置3个平行重复，每个重复20粒小麦种子，5粒种子/钵。
114.对小麦植株的生长情况进行观察，种植45d后，3个处理每重复随机挑选10株，用于测定小麦植株地上部株高和鲜重。
115.小麦种子种植45d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的生长情况图如图2所示。图2中ck对应的图为对照3-0组种植45d的生长情况；107对应的图为试验3-1组种植45d的生长情况；108对应的图为试验3-2组种植45d的生长情况。小麦种子种植45d对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组小麦的和株高、鲜重统计结果图如图3和表2所示。其中图3中的左图为对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组种植45d的小麦株高统计结果；右图为对照3-0组、试验3-1组和试验3-2组种植45d的小麦地上部鲜重统计结果。
116.表2温室条件下tf-04处理后小麦株高以及鲜重(45d)(平均值、标准差)
[0117][0118][0119]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异，“*”p≤0.05下的显著差异。
[0120]
由图2、图3以及表2可得，试验3-2组对小麦种子的处理能显著降低小麦植株地上部株高，相对于对照处理降低了2.827％；同时显著提高了地上部鲜重，相对于对照处理处理提高了13.18％；而试验3-1组对小麦种子的处理对小麦生长情况影响与对照相比无显著差异。表明温室条件下1
×
108cfu/ml的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液处理具有促进小麦植株矮壮的能力。
[0121]
实施例4
[0122]
使用实施例2制备得到的小麦促生、增产和/或抗病的菌肥处理种子，作为小麦种子处理b，方法具体为：
[0123]
利用84消毒液(84消毒液中次氯酸钠的质量百分含量为5％与水体积比1：19的84消毒液水溶液)对小麦种子进行表面消毒10min，无菌水冲洗3次。冲洗后，将表面消毒的小麦种子置于清水中吸水6h，然后以实施例2制备的小麦促生、增产和/或抗病的菌肥(固体培养物)对小麦种子进行拌种处理：
[0124]
将小麦种子与固体培养物按质量比为2g：0.75kg的比例进行拌种，作为试验4-1组；将小麦种子与固体培养物按质量比为10g：0.75kg的比例进行拌种，作为试验4-2组；小麦种子与固体培养物按质量比为20g：0.75kg的比例进行拌种，作为试验4-3组。以不进行拌种处理为对照4-0组。
[0125]
拌种后的小麦种子可直接播种。
[0126]
应用例2
[0127]
大田栽培
[0128]
将实施例4中试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组处理的小麦种子于2021年10月下旬在湖北省武汉市华中农业大学实验田，开展小区实验。每个处理设置5个小区，每个小区2
×
10m2，小区随机分布。正常田间栽培管理。
[0129]
1.小麦促生、增产和/或抗病的菌肥促进田间小麦生长的情况
[0130]
在小麦扬花期对2021年种植于湖北省武汉市华中农业大学基地的小麦植株的生长发育情况进行观察，小麦扬花期对照4-0组和试验4-3组小麦田间生长情况图如图4所示，其中ck为对照4-0组处理的小麦种子在扬花期的田间生长情况；tf-04菌株处理为试验4-3组处理的小麦种子在扬花期的田间生长情况。在小麦扬花期，采用五点取样的方法取小麦旗叶，每个取样点20片叶，测量旗叶长和旗叶宽。小麦扬花期对照4-0组、试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组小麦旗叶长和宽的统计结果图如图5和表3所示。对照4-0组、试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组的旗叶长统计结果如图5中的a所示。对照4-0组、试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组的旗叶宽统计结果如图5中的b所示。
[0131]
表3田间小麦旗叶长以及旗叶宽(平均值、标准差)
[0132]
处理旗叶长(cm)旗叶宽(cm)对照4-0组20.65
±
0.582.08
±
0.01试验4-1组21.00
±
0.302.12
±
0.01试验4-2组21.34
±
0.182.13
±
0.04试验4-3组22.14
±
0.25*2.21
±
0.09**
[0133]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异，“*”p≤0.05下的显著差异。
[0134]
由图4可得，与对照4-0组小麦相比，小麦促生、增产和/或抗病的菌肥20g处理组小麦叶片颜色更加浓绿，且旗叶更大弯而下垂，明显优于对照4-0组。
[0135]
由表3以及图5中的a和b可得，对扬花期的小麦旗叶长度、旗叶宽度等生理指标进行统计发现：相比于对照4-0组，试验组小麦旗叶长度和旗叶宽度明显大于对照4-0组，并随着孢子处理量的增多效果更佳。试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组小麦旗叶长相对于对照4-0组分别提高了1.7％、3.3％和7.2％，其中20g小麦促生、增产和/或抗病的菌肥处理组小
麦与对照4-0组相比存在显著差异(p≤0.05)。试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组小麦旗叶宽相对于对照4-0组分别提高了1.9％、2.4％和6.3％，其中20g小麦促生、增产和/或抗病的菌肥处理组小麦与对照4-0组相比存在显著差异(p≤0.01)。因此20g小麦促生、增产和/或抗病的菌肥处理组小麦旗叶面积显著大于对照4-0组，从而试验4-3组即20g小麦促生、增产和/或抗病的菌肥处理组可增强小麦光合作用。
[0136]
2.小麦促生、增产和/或抗病的菌肥对小麦光合作用的影响
[0137]
(1)对小麦扬花期旗叶中的叶绿素含量进行测定
[0138]
在小麦扬花期，采用五点取样的方法取小麦旗叶，每个取样点20片叶，冲洗擦净组织表面杂质，剪碎(去掉中脉)，混匀；称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，每份分别放入研钵中，进行后续操作。
[0139]
向研钵中加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml体积百分含量为95％乙醇水溶液，研成均浆，再加无水乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min；取滤纸1张，置漏斗中，用无水乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量无水乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；用滴管吸取无水乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀；把叶绿体色素提取液倒入直径1cm的比色杯内。以体积百分含量为95％乙醇水溶液为空白，使用分光光度计在470nm、665nm和649nm波长处测定吸光值。通过吸光值计算旗叶中叶绿素的含量。
[0140]
叶绿素含量的计算方法为：
[0141]
ca(mg/l)＝13.95a
665-6.8a
649
；
[0142]
cb(mg/l)＝24.96a
649-7.32a
665
；
[0143]cx.c
(mg/l)＝(1000a
470-2.05ca-114.8cb)/248；
[0144]ct
(mg/l)＝ca+cb+c
x.c
；
[0145]
式中：ca为叶绿素a；cb为叶绿素b；c
x.c
为类胡萝卜素；c
t
为色素含量；a
665
表示在665nm波长处测定得到的吸光值；a
649
表示在649nm波长处测定得到的吸光值；a
470
表示在470nm波长处测定得到的吸光值。
[0146]
叶绿素含量(mg/g)＝(c
t
×v×
n)/1000w。
[0147]
式中：c
t
为色素含量(mg/l)；v为提取液体积(ml)；n为稀释倍数；w为样品鲜质量(g)；1000即1l＝1000ml。
[0148]
对试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组中的旗叶叶绿素含量进行测定，对每一个取样进行3次检测。小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦旗叶叶绿素含量统计结果图如图6和表4所示。
[0149]
表4小麦叶片叶绿素和光合作用速率(平均值、标准差)
[0150]
处理叶绿素(mg/g)对照4-0组1.93
±
0.10试验4-1组2.10
±
0.06*试验4-2组2.27
±
0.02**试验4-3组2.38
±
0.05**
[0151]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异，“*”p≤
0.05下的显著差异。
[0152]
由表4和图6可得，试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组处理的小麦种子生长得到的小麦植株中叶绿素含量相对于对照4-0组小麦均有一定程度的提高，与对照4-0组相比，试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组的旗叶叶绿素含量分别提高了8.8％、17.7％、23.3％，均显著高于对照4-0组。说明旗叶中叶绿素含量的增加是对小麦促生作用的一种重要途径。
[0153]
(2)对小麦扬花期旗叶中光合作用速率进行测定
[0154]
小麦旗叶光合作用速率使用便携式植物光合作用测量系统li-6800(li-cor，美国)在小麦扬花期晴朗天气进行测量。小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦旗叶光合作用速率统计结果图如图7和表5所示。
[0155]
表5小麦叶片叶绿素和光合作用速率(平均值、标准差)
[0156]
处理光合作用速率(μmol
·
co2·
m-2
·
s-1
)对照4-0组10.66
±
0.13试验4-1组10.95
±
0.25试验4-2组12.89
±
0.15**试验4-3组13.28
±
0.09**
[0157]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异，“*”p≤0.05下的显著差异。
[0158]
由图7和表5可得，试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组处理的小麦种子生长得到的小麦植株中光合速率相对于对照4-0组小麦均有一定程度的提高，与对照4-0组相比，试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组的光合速率分别提高2.71％、20.9％、24.6％，其中10g和20g处理组小麦与对照4-0组相比存在显著差异(p≤0.01)。说明旗叶中光合速率的提高可能是对小麦促生作用的一种重要途径。
[0159]
3.小麦样品中总氮和总磷的含量测定
[0160]
在小麦扬花期，采用五点取样的方法取小麦旗叶，每个取样点20片叶。小麦样品中的总氮和总磷的含量测定采用浓硫酸消解法，参考田斌年等(2022)的方法，具体步骤如下：
[0161]
(1)总氮标样及试剂制备
[0162]
2500mg/l总氮储备标样的制备：9.55g nh4cl，用体积比1％的h2so4水溶液定容至1l；
[0163]
tn针洗液：1ml brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)溶解于2l蒸馏水中，摇匀；
[0164]
试剂tna：20g h2o2、26.8g na2hpo4·
7h2o(七水磷酸氢二钠)和50g c4h4knao6·
4h2o(酒石酸钾钠)溶解于800ml蒸馏水中，完全溶解后将其定容至1000ml。使用前按质量百分含量0.1％的量添brij-35，摇匀；
[0165]
试剂tnb：150g的c7h5nao3(水杨酸钠)溶解于400ml的超纯水中，加入0.5mlbrij-35并用试剂水稀释定容至500ml，反转混匀5次。滤纸过滤后，储存于深棕色的玻璃试剂瓶中。该溶液需每周更新一次，且需提前一天配好；
[0166]
试剂tnc：0.2g c3o3n3cl2na(二氯异氰尿酸钠)溶于100ml超纯水中，加0.1ml针清洗液或者brij-35。现用现配；
[0167]
试剂tnd：0.4g的na2fe(cn)5no
·
2h2o(亚硝基铁氰化钠)溶解40ml的超纯水并定容至50ml。加0.05ml brij-35，反转混匀5次，转移并储存到深棕色的玻璃试剂瓶(每隔两天更
新一次)。
[0168]
(2)总磷标样及试剂制备
[0169]
500mgp/l储备标样的制备：精确称取2.193g kh2po4，用1％的h2so4定容至1000ml；上机测定标样系列的制备：标样系列根据实际分析范围手工或者自动配制，配制标样的过程中，稀释剂为1％的浓h2so4；
[0170]
tp针洗液：1ml质量百分含量为15％sds溶解于2000ml超纯水中，摇匀；
[0171]
试剂tpa：1ml质量百分含量为15％sds溶解于1000ml超纯水中，摇匀；
[0172]
试剂tpb2：6.4ml质量百分含量为98％的h2so4溶于70ml超纯水中，加入0.6g的(nh4)6mo7o
24
·
4h2o(四水钼酸铵)、质量百分含量为0.3％的c8h
18
k2o
15
sb2(酒石酸锑钾)5ml，溶解，用tpa定容至100ml(此试剂每隔两天重配)；
[0173]
试剂tpc：0.88g抗坏血酸溶于50ml超纯水中。现用现配。
[0174]
(3)待测液的制备
[0175]
在小麦扬花期，采用五点取样的方法取小麦旗叶，每个取样点20片叶，称取烘干后的扬花期小麦旗叶样品0.3～0.5g(精确至0.0001g)装入100ml消解管的底部，加质量百分含量为98％的h2so45ml，摇匀，预消解过夜(为缩短预消解时间，可在加h2so4水溶液前先加1ml超纯水)；消解：消解炉上先小火加热，待h2so4发白烟后再升高温度，当溶液呈均匀的棕黑色时结束。冷却至室温后加2ml 30％h2o2，376℃加热15min，取出冷却15min；再加2ml体积百分含量为30％h2o2，376℃消解15min，再取出冷却15min，最后加入1ml体积百分含量为30％h2o2，376℃消解90min；定容：取下冷却后，用双蒸水将消解液定容至100ml容量瓶；稀释5倍，使用全自动间断化学分析仪smart chem200(ams，意大利)进行测定。
[0176]
小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦旗叶中总氮和总磷的检测结果图如表6和图8所示。
[0177]
表6小麦扬花期旗叶n和p元素的含量(平均值、标准差)
[0178]
处理旗叶总氮(mg/g)旗叶总磷(mg/g)对照4-0组14.00
±
2.430.99
±
0.25试验4-1组14.40
±
1.871.05
±
0.13试验4-2组17.88
±
2.98**1.57
±
0.30**试验4-3组16.78
±
3.10**1.38
±
0.17**
[0179]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异。
[0180]
通过研究发现tf-04种子处理的小麦植株相比于未处理小麦旗叶的叶绿素含量明显升高，而影响叶绿素合成的因素很多，其中矿质元素中氮和镁作为叶绿素的主要成分，对叶绿素的影响显著。所以我们进一步对扬花期旗叶中与叶绿素的合成密切相关的大量元素n和p分别进行测定，测定结果由图8和表6可得，试验4-2组和试验4-3组处理组的小麦植株旗叶中总n和总p都显著高于对照4-0组小麦，试验4-2组和试验4-3组总n含量相对于对照4-0组分别提高了27.7％和19.9％；试验4-2组和试验4-3组总p含量相对于对照4-0组分别提高了58.6％和39.4％。表明旗叶中总n和总p含量的增加为叶绿素和光合产物的合成提供充足的营养元素。
[0181]
4.小麦根系活力定量测定
[0182]
小麦根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑(ttc)法，具体步骤参考田斌年等
(2022)的方法。具体步骤如下：
[0183]
ttc标准曲线的制作：取0.4％ttc溶液(0.4g ttc/100ml pbs)0.2ml放入试管中，加9.8ml乙酸乙酯，再加少许na2s2o4粉末摇匀，则立即产生红色的ttf。此溶液中ttf浓度为80μg/ml。
[0184]
分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml和2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容，即得到含ttf 20μg、40μg、80μg、120μg和160μg的系列标准液，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，绘制的标准曲线如图9所示。
[0185]
在小麦扬花期，采用五点取样的方法取小麦根，每个取样点5蔸小麦，冲洗干净根表的土壤，称取扬花期小麦根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4％ttc溶液和磷酸缓冲液(ph＝7.0)各5ml，使根充分浸没在溶液内在37℃黑暗条件下1～2h，此后立即加入1m h2so42ml，以停止反应。(以反应前添加1m硫酸为对照)；将根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3～4ml，充分研磨，以抽提ttf。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测定波长485nm吸光度，并根据吸光值计算出ttc还原量。
[0186]
对试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组扬花期的小麦根系活力进行检测，小麦扬花期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组小麦根系活力统计结果图如图10和表7所示。
[0187]
通过室内温室实验和田间试验观察发现种子处理的小麦植株株高、旗叶长度、穗长以及旗叶中n和p的含量均有一定程度的提高，而植物中的n和p等矿质元素主要通过小麦根系吸收，所以进一步推测tf-04定植后可能通过小麦根系活力的增强而进一步促进对n和p元素的吸收，因此本发明对田间扬花期小麦根系活力进行了测定。
[0188]
表7小麦根系活力(平均值、标准差)
[0189]
处理根系活力(mg
·
g-1
·
h-1
)对照4-0组33.45
±
1.45试验4-1组33.86
±
0.71试验4-2组48.9
±
0.25**试验4-3组52.36
±
0.34**
[0190]
注：星号代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异。
[0191]
由表7和图10可得，试验4-2组和试验4-3组处理组的小麦植株根系活力显著高于对照4-0组，试验4-2组和试验4-3组相对于对照4-0组小麦根系活力分别提高了46.19％和56.52％，由此结果得出黄篮状菌菌株tf-04于小麦植株根系活力的增强可促进植株对水分和矿质元素的吸收进而促进小麦植株的生长。
[0192]
5.tf-04菌株对小麦叶锈病抗病性
[0193]
小麦叶锈病是中国小麦生产上分布广、传播快、危害严重的主要病害，阶段性在全国大范围流行，一般减产20％～30％，最严重时几乎颗粒无收造成严重损失。
[0194]
对小麦灌浆期叶锈病的调查于2022年5月5号进行。每块麦田采取5点取样法进行调查，每个样点调查25株，每株调查旗叶和倒二叶。对小麦灌浆期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组以及对照4-0组的叶锈病发生情况进行观察和统计。
[0195]
小麦叶锈病的分级标准参考小麦叶锈病测报调查规范(ny/t 617-2002)。病情分为以下8个级别：0：病斑面积占叶面积的比例1％；1：病斑面积占叶面积的比例5％；2：病斑面积占叶面积的比例10％；3：病斑面积占叶面积的比例20％；4：病斑面积占叶面积的比例40％；5：病斑面积占叶面积的比例60％；6：病斑面积占叶面积的比例80％；7：病斑面积占叶面积的比例100％。
[0196]
病情指数＝[∑(该病级叶片数
×
病级数)
÷
(调查总叶片数
×
8)]
×
100
[0197]
小麦叶锈病发生情况如图11～图14所示，其中图11为对照4-0组叶锈病发病情况；图12为试验4-1组叶锈病发病情况；图13为试验4-2组叶锈病发病情况；图14为试验4-3组叶锈病发病情况；小麦叶锈病统计结果如图15和表8所示。
[0198]
表8小麦叶锈病病情指数以及防效(平均值、标准差)
[0199]
处理病情指数防效对照4-0组56.15
±
4.12-试验4-1组52.93
±
4.50*5.73％试验4-2组29.89
±
2.57**46.8％试验4-3组30.82
±
1.69**45.1％
[0200]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异，“*”p≤0.05下的显著差异。
[0201]
由图11～图14可得，试验4-2组和试验4-3组能显著减小小麦叶锈病的发病情况。由图15和表8可得，试验4-2组和试验4-3组处理组小麦旗叶叶锈病的发病严重程度明显低于对照组小麦和试验4-1处理组小麦。试验4-2组和试验4-3组处理组小麦旗叶叶锈病的病情指数与对照组相比分别下降了46.8％和45.1％。以上结果说明，tf-04菌株定植生长会增强小麦植株对叶锈病的抗病性。
[0202]
6.对小麦千粒重和产量的影响
[0203]
通过对黄篮状菌菌株tf-04处理的小麦植株株高、旗叶长、宽的测定结果得出黄篮状菌菌株tf-04对小麦具有一定的促生作用，所以继续在2021年试验田种植的小麦成熟期对试验4-3组和对照4-0组的生长状况进行了观察同时对成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的千粒重和产量进行了统计。
[0204]
其中小麦成熟期试验4-3组和对照4-0组的生长状况图如图16所示，其中ck对应的图为小麦成熟期对照4-0组小麦生长状况图；20g对应的图为小麦成熟期试验4-3组小麦生长状况图；小麦成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的千粒重统计结果图如图17所示；小麦成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的产量统计结果图如图18所示。小麦成熟期试验4-1组、试验4-2组和试验4-3组及对照4-0组小麦的千粒重和产量统计结果详见表9。
[0205]
表9小麦千粒重以及产量(平均值、标准差)
[0206]
处理千粒重(g)产量(kg)对照4-0组43.91
±
0.345.78
±
0.22试验4-1组45.68
±
0.625.49
±
0.29试验4-2组46.95
±
0.44**6.14
±
0.53**试验4-3组48.09
±
0.22**6.28
±
0.04**
[0207]
注：*代表处理和对照之间的显著性差异，“**”表示p≤0.01下的显著差异。
[0208]
由图16可得，试验4-3组相对于对照4-0组生长的更好，抗倒伏能力显著提高，在对照4-0组发生倒伏的情况下，试验4-3组几乎没有发生倒伏现象。由图17、图18和表9可得，试验4-2组和试验4-3组处理组的小麦植株千粒重和产量显著增加，相对于对照4-0组，试验4-2组和试验4-3组的千粒重分别增加6.92％和9.52％；相对于对照4-0组，试验4-2组和试验4-3组的产量分别增加6.22％和8.65％。本发明提供的包括黄篮状菌菌株tf-04的小麦促生、增产和/或抗病的菌肥能显著提高小麦的千粒重和产量。
[0209]
综上，本发明提供的黄篮状菌菌株tf-04作为菌肥应用于小麦种植体系中，能够提高小麦的发芽率，促进小麦植株矮壮；提高小麦叶的长度和宽度；提高小麦叶的叶绿素含量和光合作用速率；增加小麦叶中n和p的含量；增强小麦根系活力；提高小麦的叶锈病抗性。进一步地，所述黄篮状菌菌株tf-04菌肥能够促进小麦增产，增加小麦千粒重。
[0210]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.黄篮状菌(talaromycesflavus)菌株tf-04在小麦种植中的应用，所述应用包括以下(1)～(3)中的一种或两种以上：(1)小麦促生；(2)小麦增产；(3)提高小麦抗病能力。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小麦促生包括以下(1)～(5)中的任一种或两种以上：(1)促进小麦植株矮壮；(2)促进小麦叶生长；(3)提高小麦光合作用；(4)促进小麦对营养元素的吸收；(5)增强小麦根系活力。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小麦抗病能力包括小麦抗叶锈病的能力。4.一种小麦促生、增产和/或抗病的黄篮状菌菌株tf-04分生孢子悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将黄篮状菌菌株tf-04在培养基中进行培养，分离分生孢子，得到分生孢子悬浮液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基包括pda培养基；所述培养的温度为24～30℃；所述培养的时间为7～10d；所述培养为暗培养。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述分生孢子悬浮液中分生孢子的浓度为1
×
107cfu/ml～1
×
109cfu/ml。7.一种小麦促生、增产和/或抗病的菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4～6任一项制备方法制备得到的分生孢子悬浮液进行固体发酵培养，得到小麦促生、增产和/或抗病的菌肥。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养的培养基质包括麦麸和稻壳的混合物；所述麦麸和稻壳混合的质量比为(1～1.3)：(1～0.7)；所述培养基质的含水量为60％～70％。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养包括暗培养和光培养；所述暗培养的温度为24～30℃；所述暗培养的时间为4～6d；所述光培养的温度为24～30℃；所述光培养的时间为12～20d；所述光培养的光照时间为10h/d～14h/d。10.一种权利要求7～9任一项所述制备方法制备得到的菌肥的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌肥进行拌种使用；进行拌种时，所述种子与菌肥的质量比为(2～20)g：0.75kg。

技术总结
本发明提供了黄篮状菌(Talaromycesflavus)菌株TF-04在小麦种植中的应用，属于微生物应用技术领域。本发明将黄篮状菌菌株TF-04应用于小麦种植中，能够达到小麦促生、增产和/或抗病的效果。将黄篮状菌菌株TF-04的分生孢子悬液和黄篮状菌菌株TF-04菌肥应用于小麦种植体系中，可促进小麦叶的生长，提高小麦的光合作用，促进小麦对营养元素的吸收，增强小麦的根系活力和提高小麦的叶锈病抗性，增加小麦的千粒重以及提高小麦产量。本发明提供的黄篮状菌菌株TF-04还具有促进小麦植株矮壮的能力，提高小麦抗倒伏能力。提高小麦抗倒伏能力。提高小麦抗倒伏能力。


技术研发人员：姜道宏 周文甫 付艳苹 林杨 谢甲涛 程家森 陈桃
受保护的技术使用者：湖北洪山实验室
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/9/20