一种新型快速食药用菌菌丝PCR的方法与应用

一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法与应用
技术领域
1.本发明属于食药用菌基因工程与核酸检测领域，特别涉及一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法与应用。


背景技术：

2.pcr反应是鉴定食药用丝状真菌基因组成的关键技术，对于食药用丝状真菌的遗传背景分析鉴定、功能dna元件扩增至关重要。
3.随着丝状真菌代谢工程与合成生物学的发展，基于天然合成代谢网络的自上而下的菌株改造研究已成为热点。近年来，越来越多研究者开始尝试重编辑食药用真菌基因组、重新构建代谢通路，构建高产生物活性物质的细胞工厂。然而食药用丝状真菌结构成分复杂的细胞壁限制了对细胞的直接pcr反应。传统的基因组dna提取可利用十二烷基磺酸钠(sds)提取法(在文章edwards k,johnstone c,thompson c.a simple and rapid method for the preparation of plant genomic dnafor pcr analysis[j].nucleic acids res,1991,19(6):1349中公开)、十六烷基三乙基溴化铵(ctab)提取法(在文章stewart jr cn,via le.a rapid ctab dna isolation technique useful for rapd fingerprinting and other pcr applications[j].biotechniques,1993,14(5):748-750.中公开)及其衍生的商业化基因组提取试剂盒产品。这些方法虽能得到较高纯度的基因组dna，但需样品质量较大，且操作步骤繁琐，难以快速完成大批量菌株样品的检测需求。由于pcr反应所需的样品模板量较少，常规的dna提取法获得的大量dna并不能得到充分利用。此外，目前常用的kod-fx酶快速直接pcr法虽然省去了提取核酸的复杂步骤，但是该法成本相对较高(每次反应成本为3元)，与市售高保真酶的使用成本接近，且阳性率小于60％。因此有必要获得一种快速的、成本更低的、准确率更高的、适用于食药用菌的dna提取和检测方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种核酸吸附工具，其可以快速提取食药用菌菌丝dna。
[0005]
本发明的另一目的在于提供一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法。
[0006]
本发明的又一目的在于提供上述方法的应用。
[0007]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008]
一种核酸吸附工具，通过以下方法制备：
[0009]
(1)将固体石蜡放在烧杯中进行水浴加热至融化，加入苏丹ⅲ染色剂，搅拌均匀；
[0010]
(2)将木棍一端伸入融化后的石蜡,取出木棍使石蜡自然凝固。
[0011]
所述的加入苏丹ⅲ染色剂优选为每50ml石蜡加入2滴染色剂。
[0012]
所述的木棍优选为长5～8cm、直径0.1～0.2cm的木棍，更优选为牙签。
[0013]
所述伸入融化后的石蜡优选伸入0.5～1.5cm，更优选伸入1cm。
[0014]
一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法，使用上述核酸吸附工具。
[0015]
上述方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)裂解菌丝细胞，用上述核酸吸附工具浸入菌丝裂解液中上下蘸取，以吸附dna，随后洗脱核酸吸附工具的石蜡端上的dna；
[0017]
(2)用pcr聚合酶反应体系洗脱dna，对目的片段进行pcr扩增。
[0018]
所述的食药用菌优选为蛹虫草、金针菇或灵芝。
[0019]
步骤(1)中所述的裂解菌丝细胞，具体步骤如下：
[0020]
向食药用菌菌丝加入裂解液并将其研磨均匀，加热裂解。
[0021]
所述的裂解液包括以下组分100mm tris-hcl(ph＝9.5)、1m kcl和10mm edta。
[0022]
所述的裂解液还包括水。
[0023]
所述的加热裂解优选在95℃金属浴中加热裂解至少5min；更优选为95℃金属浴中加热裂解5min。
[0024]
步骤(1)中所述的蘸取优选为蘸取4次。
[0025]
步骤(2)中所述的pcr聚合酶反应体系优选为taq premix聚合酶反应体系，更优选包括以下组分：引物f、引物r、taq premix和水。
[0026]
步骤(2)中所述的洗脱优选为洗脱10次。
[0027]
上述方法在在基因检测中的应用。
[0028]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0029]
(1)本发明提供一种新的核酸吸附工具；通过使用该核酸吸附工具，可以快速地提取食药用菌菌丝dna；
[0030]
(2)本发明提供一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法，使用本发明的核酸吸附工具，通过该方法可以普适地、成本更低地、准确率更高地检测食药用菌中目的基因，具有良好的开发应用前景。
附图说明
[0031]
图1是实施例1的具体操作示意图。
[0032]
图2是实施例1～3对食药用菌菌丝中的目的基因进行提取检测的结果凝胶图；其中a是对蛹虫草cm-10菌株中ura3基因进行提取检测的结果凝胶图，b是对金针菇yx74单核化菌株中ura3基因进行提取检测的结果凝胶图，c是对灵芝ganoderma sinense菌株中alcohol oxidase基因进行提取检测的结果凝胶图，m为marker3，空白为空白对照。
[0033]
图3是实施例1和对比例1对蛹虫草cm-10菌株中ura3基因进行提取检测的结果凝胶图；其中a为实施例1的凝胶图，b为对比例1的凝胶图，m为marker3，空白为空白对照。
[0034]
图4是实施例1和对比例2～4分别使用不同的聚合酶对目的基因ura3进行扩增后的结果凝胶图；其中m为marker3，空白为空白对照。
[0035]
图5是实施例1和对比例5～9不同蘸取次数进行核酸提取检测的结果凝胶图；其中m为marker3，空白为空白对照。
[0036]
图6是实施例4、对比例13和对比例14对蛹虫草cm-10菌株中的ntrpc-pura基因(n＝1，4)进行提取检测的结果凝胶图；其中m为marker3，空白为空白对照。
[0037]
图7是实施例1和对比例15对蛹虫草菌株中的ura3基因进行提取检测的结果凝胶图；其中m为marker3，空白为空白对照。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0039]
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0040]
所需的仪器与材料：
[0041]
1、菌株
[0042]
蛹虫草cm-10菌株(购自山东省宁阳县海鑫生物有限公司)、金针菇yx74单核化菌株(购自北京吉蕈科技有限公司)、灵芝ganoderma sinense菌株(购自华中农业大学菌种厂)。
[0043]
2、仪器
[0044]
ose-y50组织研磨仪(天根生化科技有限公司)、1.5ml+0.5ml金属浴(杭州奥盛仪器有限公司)、etc811 pcr仪(北京东胜创新生物科技有限公司)、dyy-6c水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、universal hoodⅱ凝胶成像系统(bio-rad公司)、whatman no.1纤维素纸、石蜡、普通牙签、苏丹红ⅲ(源叶生物)、凝胶染料goodview(北京赛百胜基因技术有限公司)。
[0045]
3、酶制剂
[0046]2×
rapid taq master mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；kod-fx购自toyobo；phanta max super-fidelity dnapolymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；prime star max dnapolymerase购自takara。
[0047]
4、耗材的配制
[0048]
(1)快速裂解菌丝的裂解液配方：
[0049]
100mm tris-hcl(ph＝9.5)、1m kcl和10mm edta。
[0050]
(2)whatman no.1试纸法中的细胞裂解缓冲液配方：20mm tris-hcl[ph 8.0]、25mm nacl、2.5mm edta和0.05％ sds。
[0051]
(3)whatman no.1试纸法中的洗涤缓冲液配方：10mm tris-hcl(ph 8.0)和0.1％吐温-20。
[0052]
(4)石蜡棒的制备：
[0053]
1)将固体石蜡放在烧杯中进行水浴加热至融化，加入苏丹ⅲ染色剂(每50ml石蜡加入2滴染色剂),搅拌均匀；
[0054]
2)将牙签尖头端伸入石蜡1cm左右,1s后取出牙签使石蜡自然凝固,依照上述方法获得若干石蜡棒。
[0055]
(5)纤维素纸的准备：
[0056]
whatman no.1纤维素纸剪成44
×
2mm大小，留取4mm空白长度作为核酸结合区，其余部分用石蜡包埋作为手柄。
[0057]
5、引物序列
[0058]
表1引物名称及序列
[0059][0060]
6、预配置反应体系
[0061]
表2各类聚合酶预配置反应体系
[0062][0063]
7、各聚合酶pcr程序
[0064]
表3聚合酶名称及反应条件
[0065][0066]
目标基因序列的长度如下：蛹虫草4trpc-pura基因长度为2976bp；蛹虫草1trpc-pura基因长度为1869bp；蛹虫草ura3基因长度为1143bp；金针菇ura3基因长度为902bp；灵芝alcohol oxidase基因长度为1530bp。
[0067]
实施例1
[0068]
使用蛹虫草cm-10菌株的菌丝作为实验样品，向收集好的蛹虫草菌丝加入快速裂解菌丝的裂解液(100mm tris-hcl(ph＝9.5)、1m kcl和10mm edta)，每1mm菌丝加入了10μl的裂解液并将其研磨均匀，放入95℃金属浴中加热裂解5min，以充分裂解菌丝细胞；再用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，以吸附核酸dna，随后将石蜡端在预配制好的taq premix聚合酶反应体系(参见表2taq premix相应预配置反应体系)中洗脱10次，以将核酸dna充分洗脱至pcr扩增体系；最后将样品置于pcr仪器中；以其ura3基因为目的基因，设计特异性引物cm10-ura3-f和cm10-ura3-r进行pcr扩增(pcr的反应条件参见表3taq premix相应反应条件)，具体操作流程如图1所示。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带。设置5组平行实验。
[0069]
实施例2
[0070]
实验步骤与实施例1相同，实验样品替换为灵芝ganoderma sinense菌株菌丝；并在pcr扩增中以灵芝ganoderma sinense菌株的alcohol oxidase基因为目的基因，设计特异性引物cat1-f和cat1-r进行扩增。
[0071]
实施例3
[0072]
实验步骤与实施例1相同，将实验样品替换为金针菇yx74单核化菌株菌丝；并在pcr扩增中以金针菇yx74单核化菌株的ura3基因为目的基因，设计特异性引物yx-ura3-f和yx-ura3-r进行扩增。
[0073]
对比例1
[0074]
实验步骤与实施例1相同，将核酸吸附工具石蜡棒替换为上述4(5)准备的纤维素纸。
[0075]
对比例2
[0076]
实验步骤与实施例1相同，将taq premix聚合酶替换为kod-fx聚合酶。
[0077]
对比例3
[0078]
实验步骤与实施例1相同，将taq premix聚合酶替换为phanta聚合酶。pcr扩增的反应体系和反应条件分别参见表2和表3中phanta相应的反应体系和反应条件。
[0079]
对比例4
[0080]
实验步骤与实施例1相同，将taq premix聚合酶替换为prime star聚合酶。pcr扩增的反应体系和反应条件分别参见表2和表3中prime star相应的反应体系和反应条件。
[0081]
对比例5
[0082]
实验步骤与实施例1相同，将用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，更改为用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取1次。
[0083]
对比例6
[0084]
实验步骤与实施例1相同，将用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，更改为用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取8次。
[0085]
对比例7
[0086]
实验步骤与实施例1相同，将用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，更改为用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取12次。
[0087]
对比例8
[0088]
实验步骤与实施例1相同，将用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，更改为用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取16次。
[0089]
对比例9
[0090]
实验步骤与实施例1相同，将用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，更改为用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取20次。
[0091]
结果分析
[0092]
实施例1～3的结果如图2所示，使用常见的食药用丝状真菌如金针菇、灵芝作为样品，以金针菇中的ura3基因和灵芝的alcohol oxidase基因作为目的基因进行检测，结果显示金针菇和灵芝中的目的基因均能被检测出，而金针菇的检测效果比灵芝更好，其原因可能是灵芝菌丝的细胞壁比较厚(杨杭,卓虹伊,练心洁,刘凤,邹亮,郭晓恒,雨田.灵芝孢子细胞壁降解菌的筛选及鉴定[j].食品研究与开发,2018,39(12):164-171.)，需要延长加热时间使其充分裂解。本方法在丝状食药用真菌中的适用性是较好的。
[0093]
对比例1与实施例1的结果如图3所示，使用纤维素纸的组别检出率为0，因此石蜡对于食用菌菌丝来说是更为合适的dna吸附物。
[0094]
对比例2～4与实施例1的结果如图4显示：对比例4使用prime star的阳性率为40％，对比例2使用kod的阳性率为60％，实施例1使用taq premix和对比例3使用phanta的阳性率都是100％。taq premix聚合酶的价格远低于phanta，且pcr体系配制比另外三种都要更简单。本发明的检测方法选用更为经济、方便的taq premix聚合酶作为扩增酶同样可以得到理想的检测结果。
[0095]
对比例5～9与实施例1的结果如图5所示，根据琼脂糖凝胶条带的亮度可以得出用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中的蘸取次数为4次时效果最佳的。
[0096]
实施例4
[0097]
使用蛹虫草cm10::ntrpc-pura菌株(购自山东省宁阳县海鑫生物有限公司，n代表
串联的启动子数量，trpc是启动子，pura是要调控的基因)的菌丝作为实验样品，按1mm菌丝10μl菌丝裂解液的比例向收集好的蛹虫草菌丝加入裂解液并将其研磨均匀，放入95℃金属浴中加热裂解5min，以充分裂解菌丝细胞；再用石蜡棒的石蜡端浸入菌丝裂解液中上下蘸取4次，以吸附核酸dna，随后将石蜡端在预配制好的taq premix体系中洗脱10次，以将核酸dna充分洗脱至pcr扩增体系；最后将样品置于pcr仪器中；以菌株的1trpc-pura基因或4trpc-pura基因为目的基因设计特异性引物trpc-pura-f和trpc-pura-r进行pcr扩增。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带。设置5组平行实验。
[0098]
对比例13
[0099]
kod快速检测法：使用蛹虫草cm10::ntrpc-pura菌株的菌丝作为实验样品，向收集好的蛹虫草菌丝按上述比例加入菌丝裂解液并将其研磨均匀，放入95℃金属浴中加热裂解5min，再用移液枪吸取1μl该菌丝裂解液作为pcr反应体系的模板；以菌株的1trpc-pura基因或4trpc-pura基因为目的基因设计特异性引物trpc-pura-f和trpc-pura-r进行pcr扩增反应(pcr扩增的反应体系和反应条件分别参见表2和表3中kod-fx相应的反应体系和反应条件。)。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带。设置5组平行实验。
[0100]
对比例14
[0101]
whatman no.1试纸法(whatman no.1试纸法已在文献“zou y,mason m g,wang y,et al.nucleic acid purification from plants,animals and microbes in under 30seconds[j].plos biology,2017,15(11)”中公开)：使用蛹虫草cm10::ntrpc-pura菌株的菌丝作为实验样品，向收集好的蛹虫草菌丝中加入500μl细胞裂解缓冲液，2-3个玻璃珠，涡旋约8s，捏住whatman no.1试纸石蜡包埋区，将试纸的核酸结合区浸入菌丝裂解液中结合核酸，上下浸泡5-6次，将试纸的核酸结合区浸入提前分装好的含1.2ml洗涤缓冲液的1.5ml离心管中，上下浸泡5-6次，将试纸的核酸结合区直接浸入预配置的taq premix聚合酶反应体系，上下浸泡5-6次，使用taq premix聚合酶以菌株的1trpc-pura基因或4trpc-pura基因为目的基因设计特异性引物trpc-pura-f和trpc-pura-r进行pcr扩增反应。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带。设置5组平行实验。
[0102]
对比例15
[0103]
kod快速检测法：使用蛹虫草cm-10菌株的菌丝作为实验样品，按1mm菌丝10μl菌丝裂解液的比例向收集好的蛹虫草菌丝加入菌丝裂解液并将其研磨均匀，放入95℃金属浴中加热裂解5min，再用移液枪吸取1μl该菌丝裂解液作为pcr反应体系的模板；以其ura3基因为目的基因，设计特异性引物cm10-ura3-f和cm10-ura3-r进行pcr扩增。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带。设置5组平行实验。
[0104]
结果分析
[0105]
实施例4、对比例13和对比例14的结果如图6所示，实施例4的方法的效果明显优于kod快速检测法和whatman no.1试纸法，whatmanno.1试纸法虽然也全部成功扩增，但条带亮度并不明显。
[0106]
检测时间与成本对比：计算实施例1与对比例15进行检测时单个样品的成本和所需的检测时间(以待测基因长度为1kb为例)，制成表格进行对比，结果如表4所示。
[0107]
表4实施例1与对比例15的单个检测时间与成本对比
[0108][0109]
实施例1和对比例15的结果如图7所示,以ura3为目的基因检测时，kod方法虽可以部分检出，但其阳性率约为70％，而本方法阳性率仍为100％。在成本上，本方法的单个反应成本为0.47元，kod法的单个反应成本为3元，节省了约84％的成本。在时间上，以检测1kb的基因为例，本方法的总耗时为36.5min，kod法总耗时为63min，节省了约42％的时间。在进行大量的样品筛选检测时或是检测的基因长度更长时，本方法所能节约的时间更多。
[0110]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种核酸吸附工具，其特征在于，通过以下方法制备：(1)将固体石蜡放在烧杯中进行水浴加热至融化，加入苏丹ⅲ染色剂，搅拌均匀；(2)将木棍一端伸入融化后的石蜡,取出木棍使石蜡自然凝固。2.一种新型快速食药用菌菌丝pcr的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的核酸吸附工具。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)裂解菌丝细胞，用上述核酸吸附工具浸入菌丝裂解液中上下蘸取，以吸附dna，随后洗脱核酸吸附工具的石蜡端上的dna；(2)用pcr聚合酶反应体系洗脱dna，对目的片段进行pcr扩增。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的裂解菌丝细胞，具体步骤如下：向食药用菌菌丝加入裂解液并将其研磨均匀，加热裂解。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的裂解液包括以下组分100mm ph＝9.5的tris-hcl、1m kcl和10mm edta；所述的加热裂解在95℃金属浴中加热裂解至少5min。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的蘸取优选为蘸取4次。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的pcr聚合酶反应体系为taq premix聚合酶反应体系。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的taq premix聚合酶反应体系包括以下组分：正向引物、反向引物、taq premix和水。9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的洗脱为洗脱10次。10.权利要求3～9所述的方法在基因检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新型快速食药用菌菌丝PCR的方法与应用。该方法通过加入裂解液将菌丝研磨均匀，通过高温裂解，使核酸释放，使用核酸吸附工具石蜡棒蘸取裂解液，以吸附DNA，随后洗脱核酸吸附工具的石蜡端上的DNA即可提取食药用菌菌丝的DNA。该方法提取DNA可在使用Taq Premix酶的PCR体系中进行PCR扩增以及通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有操作便捷、耗时短、成本低等优势，特别是在进行高通量筛选拟转化子时效率极高。此外，该方法普适性较好，能在多种食药用丝状真菌中很好地适用，有望为食药用丝状真菌基因工程的研究提供新的技术选择，具有良好的开发应用前景。具有良好的开发应用前景。具有良好的开发应用前景。


技术研发人员：魏韬 周越 吕梦迪 边宣颐 潘文川 张震东 郑倩望
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/9/22