适用于石油及高环多环芳烃污染修复的高效微生物菌剂材料及其与表面活性剂联合应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及适用于石油及高环多环芳烃污染修复的高效微生物菌剂材料及其与表面活性剂联合应用。


背景技术：

2.石油是指气态、液态和固态的烃类混合物，具有天然的产状。自工业革命开始以来，石油是社会进步和工业发展的血液。同时，对世界上多数国家而言，石油还是维系国家安全的重要战略资源。但是石油的开采、运输、储存以及提炼过程中不可避免会造成泄漏和溢出，从而造成环境污染。
3.目前，生物修复技术已被用于石油烃污染场地的修复。然而，由于石油烃污染物的疏水性和低水溶性，造成污染物在土壤中的生物可利用性较低，难以被生物利用，实现修复目标。通过添加表面活性剂可降低表面张力和界面张力，有助于吸附态石油烃污染物的解吸并改善非水相液体的溶解度，从而提高其水相迁移能力或微生物接触的效率。在土壤修复过程中，表面活性剂通常作为一种辅助手段，促进油污染物向水相迁移，而被广泛应用于石油污染土壤的修复。表面活性剂是天然或人工合成的由亲水和疏水两部分组成的两亲物质，包括非离子、阴离子、阳离子、两性、双子和生物表面活性剂等。增流和增溶是表面活性剂增强土壤和含水层中石油烃污染物去除效率的两种主要作用机制。增流作用是提高石油烃在多孔介质中的迁移能力增溶作用是表面活性剂增加石油烃的表观溶解度。失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(tween 80)简称乳化剂t-80，是一种常用的表面活性剂。由失水山梨醇单油酸酯与环氧乙烷聚合而成。主要用于石油、化工、塑料、机械、涂料、皮革、化妆品等工业。
4.目前关于penicillium pimiteouiense对污染物的降解研究较少，国内外也暂未有其对石油烃降解的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一株具有多环芳烃和/或石油烃降解功能的penicillium pimiteouiense ljd-7。该菌株于2021年08月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61904。
6.本研究报道菌株为penicillium pimiteouiense ljd-7，是从山东东营某石油污染场地土壤样品中分离并鉴定得到，关于该菌株对污染物的降解研究较少，国内外也暂未有其对苯并[a]芘(bap)和石油烃(tph)的降解的相关报道。本研究从山东东营某石油污染场地土壤样品中驯化和分离得到1株以bap作为碳源的菌株ljd-7，并对其进行菌种鉴定，生长特性研究。此外，将其制成菌剂，以探究ljd-7菌剂对bap和tph的降解特性，并配合表面活性剂使用，为石油污染土壤的生物修复提供参考。
[0007]
本发明的第二个目的是提供一种菌剂，包含上述的penicillium pimiteouiense ljd-7作为活性成分。
[0008]
优选的，所述的菌剂还包含能延长菌株活性时间的辅料，或其它菌剂可接受的辅料。
[0009]
本发明的第三个目的是提供一种组合物，包含上述的菌剂和表面活性剂。
[0010]
优选的，所述的表面活性剂为吐温80。
[0011]
本发明的第四个目的是提供上述的penicillium pimiteouiense ljd-7、上述的菌剂或上述的组合物在多环芳烃和/或石油烃污染环境的生物修复中的应用。
[0012]
优选的，所述的多环芳烃和/或石油烃污染环境包括多环芳烃和/或石油烃污染的土壤和水体。
[0013]
优选的，所述的多环芳烃为苯并[a]芘。
[0014]
本发明的第五个目的是提供一种降解多环芳烃和/或石油烃的方法，将上述的penicillium pimiteouiense ljd-7、上述的菌剂或上述的组合物施用于多环芳烃和/或石油烃污染的环境中，对多环芳烃和/或石油烃进行降解。
[0015]
优选的，所述的多环芳烃和/或石油烃污染的环境包括土壤和水体。
[0016]
本发明从山东东营某石油污染场地土壤样品中驯化和分离得到一株以bap为碳源的降解菌株ljd-7，根据菌株形态、生理特征、its基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为penicillium pimiteouiense ljd-7。ljd-7生长的最佳环境条件为：温度为33℃，ph值为5.0；该菌株的its基因测序分析结果显示与ljd-7最相近的菌株为penicillium pimiteouiense nrrl 25542(相似度为100％)。ljd-7能够利用bap作为碳源，在bap初始浓度为25mg
·
l-1
的无机盐培养液中培养14d后，降解率可达到73.9％。将其ljd-7制成菌剂后，对bap和tph的降解率分别为76.9％和74.9％，菌剂配合吐温80使用后对bap和tph的降解率分别为85.8％和80.5％。由此可见，菌株penicillium pimiteouiense ljd-7配合吐温80使用可对bap和tph具有较强的修复效果。因此，该菌剂在石油土壤的生物修复方面具有较好的应用潜力。
[0017]
penicillium pimiteouiense ljd-7，其于2021年08月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61904。
附图说明
[0018]
图1为菌株ljd-7在pda培养基上生长72h的正面(左)和反面(右)。
[0019]
图2为菌株ljd-7和其相关菌的基于its基因序列的系统发生关系；构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，比例尺0.005代表每个核苷酸的替换率。
[0020]
图3为菌株ljd-7在不同条件下的生长情况。
[0021]
图4为ljd-7菌剂以及该菌剂联合吐温80在含bap和tph的无机盐培养基中的降解效率(初始浓度分别为25mg
·
l-1
和500mg
·
l-1
)。
具体实施方式
[0022]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023]
实施例1：penicillium pimiteouiense ljd-7的分离和鉴定
[0024]
1、样品来源
[0025]
从山东东营某石油污染场地取得土壤样品，以高浓度bap为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的bap降菌。
[0026]
2、培养基
[0027]
2.1无机盐培养基
[0028]
无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养，纯菌以及菌剂条件下bap降解实验。该培养基配方见表1。其配制方法是将各成分加入到水中，搅拌混匀，灭菌制得。
[0029]
表1.无机盐培养基配方
[0030][0031][0032]
2.2营养培养基
[0033]
营养培养基用于真菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基ph均调节至6。其配制方法是将各成分加入到水中，搅拌混匀，灭菌制得。
[0034]
表2.potato-dextrose broth培养基(pda)成分
[0035][0036]
3、菌株的驯化、筛选和分离
[0037]
将采集的污染土壤中加入到富集培养基中，另加入硫酸链霉素和青霉素(终浓度均为100μg/ml)以抑制细菌生长，以浓度为25mg
·
l-1
的bap作为降解的底物，放置于28℃培养箱中避光震荡培养。利用以bap为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周
期。取体积分数10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜富集培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。
[0038]
将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于原培养温度条件下培养，经过48h左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、菌丝等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对bap有高效降解性能的菌株ljd-7。挑取纯化后的单菌落到相应固体试管营养培养基中培养，用灭菌后的液体石蜡进行封存，放置于4℃长期保存。
[0039]
4、菌株鉴定
[0040]
根据菌株的形态特性、生理特性和菌丝对菌株进行初步鉴定。
[0041]
4.1形态特征
[0042]
ljd-7是一株从东营某石油污染场地取得土壤样品中分离出的真菌，经活化以后，在28℃有氧的条件下，pda平板上生长72h后，能形成直径为4.1mm灰白色、边上为不规则半圆、有少许白色绒毛状菌丝的菌落(图1)。该菌为专性好氧菌。
[0043]
4.2分子生物学特征
[0044]
分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取真菌菌的dna(实验使用的真菌基因组dna快速抽提试剂盒来自生工生物工程(上海)股份有限公司)。为了对真菌菌的分类学进行研究，通常需要扩增its基因以及构建系统发育树，扩增的基因为真核中编码rrna所组成部分中的一段dna，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定真菌。
[0045]
聚合酶链式反应(pcr)主要是用来扩增不同的基因片段，pcr需要不同的引物(its1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；its4:5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)，pcr扩增反应的体系：10
×
buffer 2.5μl，mg
2+
(25mmol/l)1.5μl，dntp(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，taq酶：0.25μl，dna组模板0.1μl，去离子水19.35μl。pcr扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸10min，反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂gelred配制成凝胶块，在凝胶块中加入pcr产物和包含各种长度片段的dna标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入tbe(tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定pcr产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
[0046]
将测序所得的真菌its基因序列上传到ncbi上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的its基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的its基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用mega 5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。
[0047]
通过its基因比对发现，该菌株与penicillium pimiteouiense nrrl 25542的基
因相似度为100％。由以上结果可得出本实验所分离的真菌ljd-7为penicillium pimiteouiense这个种。
[0048]
利用ljd-7的its基因序列(其序列如seq id no.1所示)和与其相似度较高的its基因序列制作系统发育树，从而获得ljd-7的its基因与其相似性较高的its基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。
[0049]
ljd-7的its基因序列如seq id no.1所示，具体为：
[0050]
cgaggtgaggggcctctgggtccacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttc
[0051]
ggcgggcccgccgcaaggccgccggggggcttccgtccccgggcccgcgcccgccga
[0052]
agacacctgtgaacgctgtatgaagattgcagtctgagcgaaaagctaaatttattaa
[0053]
aactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcga
[0054]
taagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgcc
[0055]
ccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggct
[0056]
tgtgtgttgggccctcgtcccccgggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgt
[0057]
ccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcctgc
[0058]
cgacaccatcaatcttttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataaggcggaggaa。
[0059]
以上结果表明，本发明所分离的菌株ljd-7为penicillium pimiteouiense这个种，将其命名为penicillium pimiteouiense ljd-7，于2021年08月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61904。
[0060]
实施例2：penicillium pimiteouiense ljd-7的生长条件
[0061]
1、生长温度的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基(配方见表2)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌株ljb-7接入到培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养7d，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，7d后将培养基倒入称重的离心管后5000rpm离心30min，倒掉上清液后，放入60℃烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试温度如下：18℃、23℃、28℃、33℃和38℃。
[0062]
2、生长ph的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基(配方见表2)，用如下缓冲体系调节培养液的ph，ph 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；ph 6.0-8.0，0.1mol/l naoh和0.1mol/l kh2po4；ph 9.0，0.1mol/l nahco3和0.1mol/lna2co3。将活化好的菌株ljb-7接入到培养基内，每个ph做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将培养基放入菌株生长最适温度下培养7d，每天都需观察真菌的生长情况，7d后将培养基倒入称重的离心管后5000rpm离心30min，倒掉上清液后，放入60℃烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试的ph如下：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。
[0063]
结果如图3所示，在营养培养基中，ljd-7能够在18-38℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度33℃；该菌能够在4.0-9.0的ph条件下生长，最适生长ph为5.0。
[0064]
实施例3：bap和tph的降解实验
[0065]
1、菌剂的制备
[0066]
(1)将玉米与水按质量比1:5加热制成糊状后，按质量比150:100:10:1加入木屑
(过200目筛)，麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团。将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得直径为8mm的球状培养基质，灭菌烘干备用。
[0067]
(2)将培养好的ljd-7真菌制成菌丝含量为10g/l的菌液。
[0068]
(3)将菌液按体积比1:10加入到质量分数为3％的海藻酸钠溶液中，将上述球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入终浓度为质量分数4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理20min，得到丸状的包封真菌。
[0069]
(4)将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7d，待表面长满白色菌丝后即为ljd-7菌剂。
[0070]
2、根据实施例2的实验结果，确定菌株ljd-7的最佳生长条件为温度33℃，ph 5.0。ljd-7菌剂、添加质量分数0.1％吐温80的ljd-7菌剂在高浓度bap和tph中的降解实验均在这个条件下进行。将培养7d后的ljd-7菌剂和添加吐温80的ljd-7菌剂按质量比10％接种于含有初始浓度为25mg
·
l-1
的bap和500mg
·
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的tph的无机盐培养基中，振荡培养14天，每个处理3个重复。不添加菌剂的处理为对照处理。
[0071]
取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μl浓度为200mg/l的回收率指示剂(bap-d10)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2ml，加入少量正己烷(约5ml)，旋转蒸发至2ml，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm 3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15ml正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15ml，氮吹使其浓缩至约0.5ml，最后转移至1.5ml细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μl内标物六甲基苯，其浓度为200mg/l。(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中pahs含量。使用的色谱柱为安捷伦db 5-ms毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定pahs含量。采用安捷伦db 5-ms(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)毛细管色谱柱进行分离分析。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，bap定量用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用烘干称重法。
[0072]
石油烃(tph)则按照国标hj 894-2017的方法进行提取和分析。
[0073]
根据gc和gc-ms测定并分析得出ljd-7菌剂以及ljd-7菌剂联合吐温80均能够降解bap和tph，并且分别在含有25mg
·
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bap和500mg
·
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tph的无机盐培养液中培养14天后，降解率均可达到74％以上(图4)。其中ljd-7菌剂对bap和tph的降解率分别为76.9％和74.9％，ljd-7菌剂联合吐温80后，其降解率则为85.8％和80.5％。说明ljd-7菌剂是一种能降解bap和tph的强效菌，并且联合吐温80后，其降解效率进一步提升。
[0074]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.penicillium pimiteouiense ljd-7，保藏编号为：gdmcc no:61904。2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的penicillium pimiteouiense ljd-7作为活性成分。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂还包含能延长菌株活性时间的辅料，或其它菌剂可接受的辅料。4.一种组合物，其特征在于，包含权利要求2所述的菌剂和表面活性剂。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂为吐温80。6.权利要求1所述的penicillium pimiteouiense ljd-7、权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的组合物在多环芳烃和/或石油烃污染环境的生物修复中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃和/或石油烃污染环境包括多环芳烃和/或石油烃污染的土壤和水体。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃为苯并[a]芘。9.一种降解多环芳烃和/或石油烃的方法，其特征在于，将权利要求1所述的penicilliumpimiteouiense ljd-7、权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的组合物施用于多环芳烃和/或石油烃污染的环境中，对多环芳烃和/或石油烃进行降解。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的多环芳烃和/或石油烃污染的环境包括土壤和水体。

技术总结
本发明公开了适用于石油及高环多环芳烃污染修复的高效微生物菌剂材料及其与表面活性剂联合应用。该菌株为Penicillium pimiteouiense LJD-7，保藏号为GDMCC No:61904。实验证明：LJD-7能够利用BaP和TPH作为碳源，将LJD-7制成菌剂后，对BaP和TPH的降解率分别为76.9％和74.9％，菌剂配合吐温80使用后对BaP和TPH的降解率分别为85.8％和80.5％。由此可见，菌株LJD-7配合吐温80使用可对BaP和TPH具有较强的修复效果。因此，该菌剂在石油土壤的生物修复方面具有较好的应用潜力。壤的生物修复方面具有较好的应用潜力。壤的生物修复方面具有较好的应用潜力。


技术研发人员：李继兵 罗春玲 戴叶亮
受保护的技术使用者：中国科学院广州地球化学研究所
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/9/25