一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法

一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法。


背景技术：

2.随着畜禽养殖业的快速、规模化发展，病原菌感染给养殖业发展造成的经济损失也日益上升。大肠杆菌是造成仔猪腹泻和死亡的重要病原菌之一，其致病能力与其毒力因子密切相关，如志贺毒素等。目前抗生素是常用于解决问题的手段之一，但是养猪生产中大量使用抗生素促进了细菌耐药性的增强以及毒力因子的传播，严重威胁仔猪肠道健康。
3.近年来，开发利用抗生素替代品成为行业研究的热点、焦点和难点。噬菌体是一种能够侵染细菌的微生物，对畜禽感染的致病菌具有杀灭作用，具有靶向性强、安全性高、无药残、杀菌更彻底和绿色环保的特点，可作为有效的抗生素替代品之一。但是噬菌体作为抗生素替代品的研究仍处于研究阶段，部分噬菌体本身可能会生产不利于动物养殖的毒素。
4.产志贺毒素大肠杆菌的致病性主要与其产生的2型志贺毒素(stx2)有关。编码stx2的基因位于大肠杆菌stx2原噬菌体基因组中。stx2原噬菌体的激活导致编码stx2基因的表达和stx2的形成与释放。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种筛选抑制微生物生产stx2能力的化合物的方法。基于reca基因的启动子构建双荧光素酶报告质粒，将其转导入微生物得到一种双荧光素酶报告系统，其可以准确筛选出对于stx2噬菌体激活有抑制效果的化合物。
6.第一方面，本发明提供一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法，包括：
7.将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；
8.检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力；
9.所述双荧光素酶报告质粒包括reca基因的启动子。
10.进一步地，所述reca基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。
11.进一步地，所述reca基因的启动子包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。
12.进一步地，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：
13.将所述reca基因的启动子构建至pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo质粒第5095bp的位置
14.进一步地，所述微生物为大肠杆菌。
15.进一步地，所述将双荧光素酶报告质粒转入微生物中包括：
16.通过离子转化法、电穿孔法、冷冻脉冲法、热激法或静电吸附法将所述双荧光素酶报告质粒包含的质粒转入所述微生物的感受态细胞中。
17.进一步地，所述荧光信号包括：萤火虫荧光素酶的荧光信号和海肾萤光素酶的荧光信号。
18.进一步地，所述根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力包括：
19.将所述萤火虫荧光素酶的荧光信号和所述海肾萤光素酶的荧光信号的比值和对照比值进行比对；根据比对结果判断所述待测样品对于stx2噬菌体激活的抑制能力；
20.所述对照比值为根据不包括所述reca基因的启动子的同种双荧光素酶报告质粒转入同种微生物中，检测荧光信号，并根据结果确定得到。
21.第二方面，本发明提供rreca基因的启动子的核酸作为抑制stx2噬菌体激活能力的标志物的应用。
22.本发明进一步提供所述的方法在检测化合物抑制stx2噬菌体激活的能力中的应用。
23.本发明进一步提供l-阿拉伯糖在抑制stx2噬菌体激活中的应用。
24.进一步地，所述微生物为大肠杆菌。
25.本发明具备如下有益效果：
26.本发明将reca基因的启动子构建至双荧光素酶表达质粒中，并进一步转入微生物中得到一种可以验证化合物对于微生物生产stx2能力的抑制功能的双荧光素酶报告系统。该双荧光素酶报告系统的荧光活性与stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，因此可以经由荧光信号的变化指示stx2噬菌体产量，进而就能够判断出化合物抑制stx2噬菌体激活的能力。本发明提供的双荧光素酶报告系统可以应用筛选可特异性抑制stx2噬菌体激活的功能性营养素，并且具备较优的准确率。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是本发明实施例1提供的preca(e.coli)-fluc-sv40-hrluc-neo质粒谱图。
29.图2是本发明实施例1提供的pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo空载质粒图谱。
30.图3是本发明实施例1提供的经过包含不同功能性糖的培养基培养的菌株的stx2噬菌体的产量示意图。
31.图4是本发明实施例1提供的经过包含不同功能性糖的培养基培养的菌株的相对荧光值结果示意图。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.本实施例提供一种双荧光素酶报告系统
35.1、菌株来源和生长条件
36.大肠杆菌o157:h7来源于中国农业大学谯仕谚教授实验室。细菌在营养肉汤(lb)(北京奥博兴生物技术有限公司，中国北京)培养基中生长，生长环境温度为37℃
37.2、大肠杆菌reca双荧光素酶报告质粒的构建
38.将本发明设计的reca基因启动子序列在pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo质粒中构建大肠杆菌reca基因双荧光素酶报告载体。该步骤可以通过本领域常规方法实现，例如人工合成reca基因启动子的片段，之后通过酶切连接等方式整合至pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo质粒中(构建后的质粒图谱如图1所示，其中reca基因启动子序列为图中的promoter(e.coli)，位置为5095bp-7095bp)。
39.3、大肠杆菌o157:h7电转感受态细胞的制备
40.挑取单菌落于5ml试管中，37℃培养8h，之后按1％-2％接种量转接50ml三角瓶，37℃250rpm培养至od
600
为0.3-0.5，置于冰上停止培养；菌液分装于50ml离心管中，4000rpm 4℃离心10min，弃上清；每个离心管加入10ml提前预冷的无菌水，轻轻弹动使沉淀悬浮，洗2次；每个离心管加入10ml提前预冷的10％甘油，轻轻弹动使沉淀悬浮，洗2次；每个离心管加入250ul 10％甘油，100ul分装；液氮速冻，-80℃保存。
41.4、reca双荧光素酶报告质粒电转入大肠杆菌感受态细胞
42.利用电转化的方法将空载质粒pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo(6856bp)(图2)和reca基因报告质粒preca(e.coli)-fluc-sv40-hrluc-neo(8842bp)(图1)分别转入大肠杆菌o157:h7感受态细胞。向制备好的感受态细胞中加入2μl质粒，轻轻混匀，冰上孵育1min，将混合物转移至一预冷的电转杯中，轻敲外壁使其沉至电转杯底部。电转条件为1.8kv、5s。电转结束后，立即将1ml的soc培养基加入电转混合物中，37℃复苏45min，菌液涂布于含有amp的lb固体平板，37℃静置培养过夜，次日挑选阳性菌落。
43.5、细菌培养
44.在添加不同功能性糖的lb培养基中培养经过步骤4处理的大肠杆菌o157:h7，其已含有reca双荧光素酶报告质粒，具体如下：
45.将约107cfu的大肠杆菌o157:h7重悬浮于100μl pbs中。随后，将细菌悬浮液接种到含有1％葡萄糖(solarbio，中国北京)、d-木糖(aladdin，中国上海)、l-阿拉伯糖(aladdin，中国上海)、甘露糖(aladdin，中国上海)、阿拉伯半乳聚糖(yuanyebiotech，中国上海)和木聚糖(aladdin，中国上海)的8ml lb液体培养基中。在37℃静置培养24小时后，将细菌样品在冰浴中冷却。于12,000℃离心沉淀细菌细胞，吸取培养上清液进行后续的萤火虫荧光素酶检测，和海参荧光素酶的检测。
46.6、萤火虫荧光素酶的检测
47.使用bac-lumi
tm
细菌萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天生物，北京)检测萤火虫荧光素酶的活性。使用前融解冻存的bac-lumi
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萤火虫荧光素酶检测试剂并平衡至室温。在黑色96孔板中每孔加入100μl表达萤火虫萤光素酶的菌液，混匀，同时设置不含萤火虫萤光素酶的细菌培养液孔作为阴性对照；96孔板每孔加入100μl bac-lumi
tm
细菌萤火虫萤光素酶检测试剂；使用多孔板震荡混合仪振荡混匀，室温(约25℃)孵育5分钟，使发光信号趋于稳定，利用多功能酶标仪进行化学发光检测。
48.7、海参荧光素酶的检测
49.首先用细菌蛋白制备裂解液(生工生物工程有限公司，上海)提取细菌蛋白。具体
地，4℃ 4,000rpm 15分钟离心细菌获得菌体沉淀，加入200μl细菌蛋白制备裂解液并反复吹打混匀，将细菌于4℃静置30分钟以破碎细胞壁；最后12,000 4℃离心20min收集含有细菌蛋白的上清液并在黑色96孔板中每孔加入100μl表达海参萤光素酶的菌液。使用renilla-lumi
tm
细菌萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂(碧云天生物，北京)测定萤火虫荧光素酶的活性。将dual-lumi
tm
ii海肾萤光素酶检测底物(100x)置于冰浴或冰盒上备用，按照1：100的比例混合适量的dual-lumi
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ii海肾萤光素酶检测底物(100x)和dual-lumi
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ii海肾萤光素酶检测缓冲液，配制成dual-lumi
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ii海肾萤光素酶检测试剂。在黑色96孔板中每孔加入100μl dual-lumi
tm
ii海肾萤光素酶检测试剂，室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。利用多功能酶标仪进行化学发光检测。
50.在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的rlu值除以海肾萤光素酶测定得到的rlu值。
51.8、产2型志贺毒素噬菌体的定量分析方法
52.使用噬菌体dna快速提取试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)提取stx2噬菌体的dna。具体流程如下：
53.将含有stx2噬菌体的细菌培养液以12,000rpm离心10分钟。上清液通过0.22μm pvdf膜(millipore，美国)过滤。加入等体积的含ca
2+
和mg
2+
的hank平衡盐溶液(hbss)，然后在37℃下与dnase i和rnase a孵育30分钟，以消除细菌dna和rna。加入peg 8000至最终浓度为10％(w/v)，并在4℃下放置过夜。在4℃下以12,000rpm离心10分钟后，将噬菌体颗粒溶解在裂解缓冲液(4.5m异硫氰酸胍、44mm柠檬酸钠ph 7.0、0.88％沙科西、0.72％2-巯基乙醇)中，然后在70℃下用20％sds孵育10分钟，然后用冰浴孵育5分钟。向混合物中加入100微升杂质沉淀溶液。在14,800rpm、4℃离心10min后，收集含有噬菌体dna的上清液。用离心吸附柱法提取dna。分析克隆到质粒载体中的含有stx2基因的质粒的系列稀释液，以生成标准曲线并计算stx2噬菌体的绝对拷贝数。
54.9、结果
55.结果如图3-图4所示，图3结果显示转入了reca双荧光素酶报告系统的大肠杆菌o157:h7在含有木聚糖(xylan)的培养基中产生了更多的stx2噬菌体(p＜0.05)，而l-阿拉伯糖(arabinose)和阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)糖则减少了stx2噬菌体的产生(p＜0.05)；甘露糖(mannose)和木糖(d-xylsoe)处理对stx2噬菌体的产生没有影响。
56.图4结果显示l-阿拉伯糖(arabinose)和阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)的萤火虫荧光素酶/海参荧光素酶的比值最低，且均低于对照组，表明l-阿拉伯糖和阿拉伯半乳聚糖可有效降低大肠杆菌o157:h7荧光值的表达。木聚糖萤火虫荧光素酶/海参荧光素酶的比值显示为最高值。甘露糖(mannose)和木糖(d-xylsoe)处理对荧光素酶/海参荧光素酶的比值没有影响。
57.综上，本发明的reca双荧光素酶报告系统的荧光活性与stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，说明可利用本发明的reca双荧光素酶报告系统准确筛选可特异性抑制stx2噬菌体激活的功能性营养素。
58.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；
而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法，其特征在于，包括：将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力；所述双荧光素酶报告质粒包括reca基因的启动子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述reca基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述reca基因的启动子包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：将所述reca基因的启动子构建至pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo质粒第5095bp的位置。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光信号包括：萤火虫荧光素酶的荧光信号和海肾萤光素酶的荧光信号。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力包括：将所述萤火虫荧光素酶的荧光信号和所述海肾萤光素酶的荧光信号的比值和对照比值进行比对；根据比对结果判断所述待测样品对于stx2噬菌体激活的抑制能力；所述对照比值为根据不包括所述reca基因的启动子的同种双荧光素酶报告质粒转入同种微生物中，检测荧光信号，并根据结果确定得到。8.reca基因的启动子的核酸作为抑制stx2噬菌体激活能力的标志物的应用。9.权利要求1-8任一项所述的方法在检测化合物抑制stx2噬菌体激活的能力中的应用。10.l-阿拉伯糖在抑制stx2噬菌体激活中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法。包括：将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力；所述双荧光素酶报告质粒包括recA基因的启动子。本发明将recA基因的启动子整合至双荧光素酶报告质粒中，导入微生物中得到一种双荧光素酶报告系统，该报告系统的荧光信号变化和Stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，可以准确指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。


技术研发人员：王军军 胡杰 武祎凡 韩丹丹 康露渊 刘一思
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/5