象草耐铝基因CpA0700515及其植株遗传转化方法与流程

象草耐铝基因cpa0700515及其植株遗传转化方法
【技术领域】
1.本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及象草耐铝基因cpa0700515及其植株遗传转化方法。


背景技术：

2.象草(cenchrus purpureus schumach)是禾本科蒺藜草属的多年生c4大型草本植物。20世纪40年代由引入我国后快速在江西、福建、湖南、台湾等地区广泛栽培种植，是一种高产优质的饲草和潜在能源草。经研究象草具备很好的耐热、耐旱性能，属于多年生牧草，是一种很好种植繁育的牧草，然而目前并没有关于象草在重金属胁迫下的任何研究，如果象草在重金属含量高的土壤中依然能够生存，将为改善重金属污染土壤提供一条新的思路。
3.目前，象草的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育﹑栽培技术﹑品质安全等传统育种领域，但是传统育种时间长、效率低，严重制约着象草的发展速度，为了解决上述问题，近年来陆续有象草分子生物学方面的研究报道，包括功能基因的克隆、基因组测序、基因家族的鉴定和转录组测序等等。而在三十多年前就已经报道了象草愈伤组织的诱导方案；在20世纪80年代也简历了象草悬浮细胞培养和原生质体的再生体系。在其他物种中已报道了通过基因工程方法提高植物的产量、营养品质和抗逆性等的研究，表明转基因、基因编辑等技术的运用需要高效、成熟的植物遗传转化体系作为前提。然而，目前对象草的遗传转化体系的研究较少，多数还是集中于研究个别基因的抗逆性、扩增表达等，并未建立一种可靠的遗传转化体系。
4.因此，有必要针对象草耐受重金属的相关调控基因进行研究，此外更重要的是，还要想办法提高象草分子育种的生产效率，研究出一种可靠并适用于象草的基于农杆菌介导法的遗传转化方法，不仅有效弥补现有象草遗传转化体系研究的不足，还对象草的快速育种及满足社会需求具有重要意义。


技术实现要素：

5.鉴于上述内容，有必要对象草耐受重金属的相关调控基因进行研究，此外更重要的是，还要想办法提高象草分子育种的生产效率，研究出一种可靠并适用于象草的基于农杆菌介导法的遗传转化方法，该研究不仅有效弥补现有象草遗传转化体系研究的不足，还对象草的快速育种及满足社会需求具有重要意义。
6.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.象草基因cpa0700515，所述基因cpa0700515的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
8.本发明还包括过表达载体，所述过表达载体上含有所述cpa0700515基因。
9.本发明还包括宿主细胞，所述宿主细胞包含所述的过表达载体。
10.本发明还包括所述象草耐铝基因cpa0700515在耐铝胁迫上的应用。
11.本发明还包括cpa0700515基因的象草植株遗传转化体系构建方法，所述方法包括如下步骤：
12.(1)将象草种子播种于培养基中，在培养箱中培养得到象草植株备用；将cpa0700515基因分别转入过表达载体质粒ph7fwg2-rr和rnai干扰载体质粒pk7gwiwg2(ⅱ)rr得到过表达重组载体ph7fwg2-cpa0700515和rnai干扰重组载体pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515备用；
13.(2)将含有ph7fwg2-cpa0700515和pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515载体的农杆菌gv3101摇菌后，收集菌体，用侵染液重悬菌体，然后再取步骤(1)象草植株的部分组织为外植体，将外植体与含cpa0700515基因的农杆菌gv3101混合后置于浸染液中浸染；
14.(3)将步骤(2)的侵染后的外植体吸干水分后，转到m2培养基中暗培养，将暗培养后的外植体转移到分别加入抗生素抗性的m2培养基中暗培养1周后，正常光照培养1周，之后转移到新的抗生素抗性的m2培养基中进行愈伤诱导；
15.(4)待透明的愈伤组织完全诱导出来后，转移到加入抗生素抗性的m3培养基中进行抗性继代培养；
16.(5)待愈伤组织块变白且硬化时转移到加入抗生素抗性的m4培养基继续发芽诱导；
17.(6)待有较多芽点出现后，转入分别加入抗生素抗性的m5培养基进行生根诱导；
18.(7)炼苗，将大小长势一致的再生苗移栽至营养土中，获得再生植株即完成象草遗传转化体系的构建。
19.进一步的，抗生素抗性培养基中的抗生素由体积百分比为1％的spe、1％的cef和1％的tim组成。
20.进一步的，所述步骤(2)的外植体为象草茎段。
21.进一步的，所述步骤(2)的用侵染液重悬菌体到od
600
值为0.4-0.6。
22.进一步的，所述步骤(3)的m2培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap。
23.进一步的，所述步骤(3)的m3培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap。
24.进一步的，所述步骤(3)的m4培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的6-bap和0.1mg/l的naa。
25.进一步的，所述步骤(1)的种子萌发培养基为m1培养基，该培养基的配方为2.215g/l的ms粉、0.1％的ppm和0.3％的植物凝胶。
26.进一步的，所述步骤(6)的m5含有2.215g/l的ms粉、0.1％的ppm、3％的蔗糖和0.3％植物凝胶。
27.本发明具有如下有益效果：
28.本发明通过研究分析获得cpa0700515基因，经验证，该基因能有效提高细胞的耐铝性，为今后开展耐铝植株的研究、选育提供至关重要的理论和实践基础，该基因属于mate家族，本发明为进一步研究mate家族的功能验证提供了技术支持。此外，申请人还将该基因成功转化到了象草植株中，通过对相关技术参数的优化，获得稳定的紫象草再生体系，构建了象草的cpa0700515基因遗传转化植株，该植株的成功构建和象草再生体系的建立不仅有
效弥补现有象草遗传转化体系研究的不足，还对象草的快速育种及满足社会需求具有重要意义。
【附图说明】
29.图1是铝胁迫下cpa0700515基因过表达酵母的细胞生长分析结果图；
30.图2是实施例中根癌农杆菌gv3101介导的象草转ph7fwg2-cpa0700515和pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515基因的植株侵染示意图；图中的a-i分别表示：(a)培养28d的无菌苗；(b)真空渗透转化外植体；(c)超声波处理；(d)转化后的外植体在愈伤诱导培养基上培养；(e)愈伤组织诱导；(f)继代培养；(g)不定芽分化；(h)生根培养；(i)炼苗；
31.图3为转ph7fwg2-cpa0700515和pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515基因阳性植株的琼脂糖凝胶电泳图。图中，a为rnai干扰株系阳性检测结果图；b为过表达株系阳性检测结果图；图中，p分别表示rnai干扰载体质粒pk7gwiwg2(ⅱ)rr和ph7为过表达载体质粒ph7fwg2-rr、wt为非转-cpa0700515基因的野生型植株、rnai干扰表示基因沉默植株、oe表示基因过表达植株；
32.图4为cpa0700515在阳性植株中的表达量对比图。图中，a为rnai干扰株系的qrt-pcr验证；b为过表达株系的qrt-pcr检测。
【具体实施方式】
33.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
34.实施例1：
35.象草耐铝基因cpa0700515，所述基因cpa0700515的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
36.实施例2：
37.实施例1基因cpa0700515的研究：
38.对基因cpa0700515进行克隆后，构建pyes2-cpa0700515载体并转入invsc1酿酒酵母细胞中，进行不同浓度的铝胁迫测试来评估转基因酵母细胞的耐铝性。未进行铝胁迫时，转空载酵母菌株和转基因酵母细胞均能够在培养基上正常生长，而随着铝胁迫浓度的提高，空载酵母细胞的生长受到抑制的现象越显著(具体如图1所示)。在相同稀释梯度下，转基因酵母菌株的生长状况优于空载酵母细胞。当铝胁迫处理液的浓度提高到5mol/l后，空载酵母菌株和转基因酵母细胞均不再生长。由此说明，过表达cpa0700515基因能够增强酵母细胞的耐铝性。
39.这表明基因cpa0700515可以提高细胞的耐铝性能。
40.实施例3：
41.基因cpa0700515的遗传转化法，本方法主要先研究紫象草的再生体系建立方法，然后通过优化反应条件，构建根癌农杆菌遗传转化体系，最终获得基因cpa0700515的遗传转化象草植株，具体方法如下：
42.一、紫象草的再生体系建立方法：
43.步骤s1：播种，取灭菌的紫象草(cenchrus purpureus schumachcv.purple)种子播种于种子萌发培养基m1中，置于光照培养箱中(28℃，光照时间为12h)培养，生长时间为四周；
44.其中，m1培养基配方为2.215g/lms粉+0.1％ppm(plant preservative mixture，植物广谱抗生素+0.3％植物凝胶(ph＝5.8)；
45.步骤s2：愈伤诱导，在无菌滤纸上用干净的手术刀切取播种所得紫象草的部分组织作为外植体接种于愈伤组织诱导培养基m2中，黑暗培养1周后，正常光照条件(25℃，16h/8h)培养一周，更换到新的m2培养基，每两周更换一次培养基，从而诱导获得愈伤组织；
46.其中，m2为0.54％ms粉、3％蔗糖、0.3％植物凝胶和不同含量的cuso4、2,4-d和6-bap(ph＝5.8)，其中，cuso4、2,4-d和6-bap的含量如下表1所示；
47.步骤s3：继代培养，将s2所得愈伤组织接种于新的继代培养基m3中培养4周以上，每两周更换一次培养基，直到透明状愈伤组织表面长出白色硬块；
48.其中，m3为0.54％ms粉、3％蔗糖、0.3％植物凝胶和不同含量的cuso4、2,4-d和6-bap(ph＝5.8)，其中，cuso4、2,4-d和6-bap的含量如下表2所示；
49.步骤s4：不定芽诱导，将s3所得白色坚硬状的愈伤组织接种于发芽培养基m4中继续培养，每两周更换一次培养基，直至获得不定芽；
50.其中，m4为0.54％ms粉、3％蔗糖、0.3％植物凝胶和不同含量的cuso4、6-bap和naa(ph＝5.8)，其中，cuso4、naa和6-bap的含量如下表4所示；
51.步骤s5：生根诱导，将s4中所得不定芽组织块接种于生根培养基m5中进行生根培养，每两周更换一次培养基，获得再生苗。
52.其中，m5为2.215g/lms粉+0.1％ppm+3％蔗糖+0.3％植物凝胶(ph＝5.8)。
53.步骤s6：炼苗，将在m5培养基中长势较好的再生苗移栽至营养土中，获得再生植株，建立紫象草再生体系。
54.表1不同外植体在不同m2培养基条件下的诱导率
[0055][0056]
表2不同外植体在不同m3培养基条件下的组织存活率
[0057][0058]
表3不同外植体在不同m4培养基条件下的发芽率
[0059][0060]
上述实验数据表明，以紫象草的叶片、茎段和根系为外植体，加入不同浓度的2,4-d和6-bap进行愈伤组织诱导，发现叶片无法诱导出愈伤组织，根系仅有一部分组织能够诱导出愈伤组织，但是愈伤组织无法长大，逐渐死亡，而茎段愈伤组织的诱导率最高，为94％(表1)。而在外植体完全诱导成愈伤组织之后，需转移到m3培养基进行继代培养，此时愈伤组织存活率为44％。培养4-6周后，愈伤组织会生成白色硬块，将其转移到发芽培养基m4中诱导发芽，培养周期4-6周，发芽率为19％，且每个愈伤组织可以分化出10个以上的不定芽，显著提升再生体系的诱导率。在本方案中还可以观察到，当外植体长度在0.5cm左右时，获得的愈伤组织块较大，并且能够提高了诱导出芽点的几率。
[0061]
综合上述实验结果，选择象草的茎段做为外植体。m2、m3、m4培养基的配方分别如下：
[0062]
m2培养基为0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap；
[0063]
m3培养基为0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap；
[0064]
m4培养基为0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的6-bap和0.1mg/l的naa。
[0065]
本实施例中，植物凝胶购买自sigmaaldrich。
[0066]
二、cpa0700515基因的重组质粒构建：
[0067]
根据cpa0700515基因的cds序列使用生物软件dnaman(version9)设计用于基因克隆和载体构建的特异性引物(表4)。以紫象草的cdna为模板，参照hsdna polymerase(r010a，takara，日本)说明书进行基因全长扩增。
[0068]
表4用于全长扩增及载体构建的引物
[0069]
引物编号引物序列(5
’‑3’
)cpa0700515-fatggaggaacaccagtca
cpa0700515-rtcactgccgaagaaacttpdonr-cpa0700515-fggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggaggaacaccagtcapdonr-cpa0700515-rggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcactgccgaagaaactt
[0070]
对pcr反应完毕的产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂凝胶浓度为1.5％，marker为dl2000(3427a，takara，日本)。电泳结束后，将所需的正确条带切割装入1.5ml离心管中，根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131-0100，生工，中国)说明书对目的片段进行回收，并使用nanodrop仪器对回收产物的浓度和质量进行测定。
[0071]
利用gatawaytm技术构建cpa0700515的表达载体，本实验所用到的过表达载体质粒为ph7fwg2-rr，rnai干扰载体质粒为pk7gwiwg2(ⅱ)rr，使用的酶为gatewaytmbp clonasetm(11789013，thermo，usa)酶混合物和gatewaytmlrclonasetm酶混合物(11791043，thermo，usa)。设计的入门载体pdonr-cpa0700515引物如表4所示。首先利用bp反应构建入门载体，反应体系如表5所示，25℃过夜，然后进行lr反应构建表达载体，反应体系如表6所示，25℃过夜。
[0072]
表5bp反应混合液体系
[0073]
成分体积(μl)gatewaytmbpclonasetm酶混合物0.2pdonr空载0.4cpa0700515胶回收产物0.4ddh2oto2
[0074]
表6lr反应混合液体系
[0075]
成分体积(μl)gatewaytmlrclonasetm酶混合物0.2表达载体空载0.4pdonr-cpa0700515质粒0.4ddh2oto2
[0076]
吸取上述表达载体构建的全部产物轻柔加入100μl的gv3101根癌农杆菌感受态中，冰浴10min后，转移到电击杯中，盖上盖子，在电转仪中电转，电转条件为2500v/2.5ms，然后迅速往电击杯中加入1mllb液体吸打混匀，转移到1.5ml无菌的离心管中，在28℃摇床中培养3h。之后吸取100μl菌液在添加了spe(壮观霉素)和gen(庆大霉素)抗性的lb固体板子上涂板，在28℃的培养箱中培养2d。长出单克隆后，进行划线和阳性检测，摇菌，待用。
[0077]
三、紫象草的遗传转化体系建立方法(具体如图2所示)：
[0078]
参考第一部分研究结果，构建cpa0700515基因的遗传转化方法，具体包括如下步骤：
[0079]
步骤一：播种，取灭菌的紫象草播种于种子萌发培养基m1中，置于光照培养箱中(28℃，光照时间为12h)培养，生长时间为四周；其中，m1培养基配方为2.215g/l的ms粉、0.1％的ppm和0.3％的植物凝胶。
[0080]
步骤二：浸染，浸染液采用m2液体培养基(m2液体培养基由质量百分数为0.54％的ms粉、质量百分数为3％的蔗糖、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap组成，ph＝5.8)，将含有ph7fwg2-cpa0700515或pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515载体(本载体具
体含有cpa0700515基因，参与植物柠檬酸转运活动)的农杆菌gv3101摇菌后，在3000rpm下离心15min，收集离心后的菌体，用侵染液重悬至溶液od
600
值为0.4-0.6；在无菌滤纸上用干净的手术刀切取播种所得紫象草茎段作为外植体，置于浸染液中浸染，在真空条件下，0.1mpa下抽真空10min，超声震荡10min，再重复抽真空10min。其中，侵染液配方为：0.54％的ms粉、3％的蔗糖、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap。
[0081]
步骤三：在超净工作台中，用无菌滤纸吸干外植体水分后，转移到m2固体培养基(m2固体培养基由质量百分数为0.54％的ms粉、质量百分数为3％的蔗糖、质量百分数为0.3％的植物凝胶、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap组成，ph＝5.8；中暗培养3d。
[0082]
步骤四：将暗培养后的外植体转移到分别加入体积百分数为1％spe(壮观霉素)、体积百分数为1％cef(头孢霉素)和体积百分数为1％tim(特美汀)抗性的m2培养基中黑暗培养1周后，正常光照条件下(25℃，16h/8h)培养1周，转移到新的加入抗生素的m2固体培养基中进行愈伤诱导，正常光照条件下每两周更换一次培养基。其中，m2培养基成分如步骤三。
[0083]
步骤五：待透明的愈伤组织完全诱导出来后，转移到加入体积百分数为1％spe(壮观霉素)、体积百分数为1％cef(头孢霉素)和体积百分数为1％tim(特美汀)抗性的m3培养基中进行抗性继代培养，每两周更换一次培养基，大约为4-6周。其中，m3培养基由质量百分数为0.54％的ms粉、质量百分数为3％的蔗糖、质量百分数为0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap组成，ph＝5.8。
[0084]
步骤六：待愈伤组织块变白且硬化，少量组织出现芽点时，时转移到分别加入体积百分数为1％spe(壮观霉素)、体积百分数为1％cef(头孢霉素)和体积百分数为1％tim(特美汀)抗性的m4培养基继续发芽诱导，每两周更换一次培养基，大约为4-6周。其中，m4培养基由质量百分数为0.54％的ms粉、质量百分数为3％的蔗糖、质量百分数为0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的6-bap和0.1mg/l的naa组成，ph＝5.8。
[0085]
步骤七：待有较多芽点出现后，转入分别加入体积百分数为1％spe(壮观霉素)、体积百分数为1％cef(头孢霉素)和体积百分数为1％tim(特美汀)抗性的m5培养基进行生根诱导，每两周更换一次培养基。其中，m5培养基由2.215g/l的ms粉、质量百分数为0.1％的ppm、质量百分数为3％的蔗糖和质量百分数为0.3％的植物凝胶组成，ph＝5.8)。
[0086]
步骤八：炼苗，将大小长势一致的再生苗移栽至营养土中，获得再生植株，建立象草遗传转化体系。
[0087]
在不同od
600
值：0.3、0.4、0.6和1.0的条件下采用本方案构建载体pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515或ph7fwg2-cpa0700515的象草遗传转化体系，每个实验组均重复培养200株象草(分4组，每组50株)计算诱导率；最终发现：在菌液od
600
值为0.3和1.0的条件下未获得再生植株，而在od
600
值为0.4、0.6的条件下均能获得再生植株，最终的存活率如表7所示：
[0088]
表7不同菌液浓度转化条件下再生组织的存活率
[0089][0090]
从上表可见，当菌液od
600
值为0.4、0.6时均能获得转化的再生植株。说明，ph7fwg2-cpa0700515载体和/或pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515载体对象草进行遗传转化时，最佳的od
600
值为0.4-0.6。
[0091]
实施例3：
[0092]
对转化植株的验证：
[0093]
参照植物dna快速提取试剂盒(dp350，天根，中国)的说明书对获得的再生苗进行dna提取，利用表达载体上的特异性引物进行pcr检测，检测得到的目的条带如图3所示，从图3可以看出，重组载体均能导入象草植株中，此外，如图4所示，通过qrt-pcr检测转基因阳性苗中cpa0700515表达情况发现，与对照相比，cpa0700515基因在过表达株系中表达量较高，在rnai干扰株系中表达量较低。具体如表8所示：
[0094]
表8用于植物阳性检测的特异性引物
[0095][0096][0097]
综上所述，本技术通过优化反应条件构建了基因cpa0700515的象草植株遗传转化体系，经验证，该象草基因已成功转入象草植株中，此外本技术还利用酵母菌株对基因cpa0700515进行过表达验证，发现该基因过表达后，酵母菌株具有良好的耐铝性能，为今后耐铝基因的研究提供了新的思路，对于选育耐铝生物具有至关重要的理论和实践意义。
[0098]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.象草基因cpa0700515，其特征在于，所述基因cpa0700515的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。2.过表达载体，其特征在于，所述过表达载体上含有如权利要求1所述cpa0700515基因。3.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求2所述的过表达载体。4.根据权利要求1所述象草耐铝基因cpa0700515在耐铝胁迫上的应用。5.cpa0700515基因的象草植株遗传转化体系构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将象草种子播种于培养基中，在培养箱中培养得到象草植株备用；将cpa0700515基因分别转入过表达载体质粒ph7fwg2-rr和rnai干扰载体质粒pk7gwiwg2(ⅱ)rr得到过表达重组载体ph7fwg2-cpa0700515和rnai干扰重组载体pk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515备用；(2)将含有ph7fwg2-cpa0700515和pk7gwiwg2(ⅱ)rrpk7gwiwg2(ⅱ)rr-cpa0700515载体的农杆菌gv3101摇菌后，收集菌体，用侵染液重悬菌体，然后再取步骤(1)象草植株的部分组织为外植体，将外植体与含cpa0700515基因的农杆菌gv3101混合后置于浸染液中浸染；(3)将步骤(2)的侵染后的外植体吸干水分后，转到m2培养基中暗培养，将暗培养后的外植体转移到分别加入抗生素抗性的m2培养基中暗培养1周后，正常光照培养1周，之后转移到新的抗生素抗性的m2培养基中进行愈伤诱导；(4)待透明的愈伤组织完全诱导出来后，转移到加入抗生素抗性的m3培养基中进行抗性继代培养；(5)待愈伤组织块变白且硬化时转移到加入抗生素抗性的m4培养基继续发芽诱导；(6)待有较多芽点出现后，转入分别加入抗生素抗性的m5培养基进行生根诱导；(7)炼苗，将大小长势一致的再生苗移栽至营养土中，获得再生植株即完成象草遗传转化体系的构建。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的外植体为象草茎段。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的用侵染液重悬菌体到od
600
值为0.4-0.6。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的m2培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、7.82μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的m3培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的2,4-d和0.5mg/l的6-bap。10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的m4培养基含有0.54％的ms粉、3％的蔗糖、0.3％的植物凝胶、50μmol/l的cuso4、2mg/l的6-bap和0.1mg/l的naa。

技术总结
本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及象草耐铝基因CpA0700515及其植株遗传转化方法，本发明通过研究分析获得CpA0700515基因，经验证，该基因能有效提高细胞的耐铝性，为今后开展耐铝植株的研究、选育提供至关重要的理论和实践基础，该基因属于MATE家族，本发明为进一步研究MATE家族的功能验证提供了技术支持。此外，申请人还将该基因成功转化到了象草植株中，通过对相关技术参数的优化，获得稳定的紫象草再生体系，构建了象草的CpA0700515基因遗传转化植株，该植株的成功构建和象草再生体系的建立不仅有效弥补现有象草遗传转化体系研究的不足，还对象草的快速育种及满足社会需求具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。


技术研发人员：张吉宇 卢丽燕 闫启
受保护的技术使用者：权利要求书1页说明书8页序列表（电子公布）附图3页
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/10/6