检测微小隐孢子虫的双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒

检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.隐孢子虫(cryptosporidium)是呈世界性分布的重要机会致病性原虫，进入宿主体内后主要寄生于胃肠道上皮细胞的刷状边缘，导致不同程度的腹泻及肠道疾病。其引起疾病的临床症状严重程度与病程的长短与宿主的免疫功能及营养状况密切相关。在免疫功能正常的患者中，隐孢子虫病的病程短，一般持续约2～3周，并伴有恶心、呕吐、腹痛和体重减轻等症状；而在免疫功能低下的患者，如艾滋病患者或营养不良患者中，隐孢子虫的感染率极高，且病程长，引起长期及持续性水样腹泻并导致死亡。隐孢子虫病严重损害婴幼儿的生命健康，是造成儿童腹泻及死亡的重要原因。除引起人和动物临床症状外，隐孢子虫病还严重危害养殖业发展。目前因缺乏有效检测方法使得微小隐孢子虫的检出率比实际低，因此有必要开展相关研究，利于对隐孢子虫的有效检测，对该病做到早发现早预防，降低发病率，对人类健康及畜牧业发展都至关重要。
3.目前常用的隐孢子虫检测方法主要有病原学检测、免疫学检测以及分子学检测等，其中病原学检测的敏感性有限；分子学检测存在耗时、依赖昂贵试剂和仪器等缺点；免疫学方法中基于抗原捕获的酶联免疫吸附实验(elisa)因灵敏度高、方便快捷已广泛用于隐孢子虫的检测。该方法在检测粪便样本时，可通过检测粪便中隐孢子虫抗原物质来确定感染，较直接检测卵囊的elisa检测法(可能因卵囊难以附着于96孔板底部或粪便中卵囊量低易出现假阴性结果)以及pcr方法(检测不到卵囊的空卵囊壳)，具有较高的灵敏度。另外，利用双抗体建立的夹心elisa检测法，较使用单一抗体建立的直接或间接elisa方法，其特异性及灵敏度更高。因此，开发出特异性好、灵敏度高且价格低廉的免疫学检测试剂具有较好的应用价值，对隐孢子虫的监测和防控有重要意义。


技术实现要素：

4.为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒。
5.本发明的另一目的在于提供检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，包括抗微小隐孢子虫的单克隆抗体和兔源多克隆抗体；其中，
8.所述的单克隆抗体通过如下方法制备得到：利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用单克隆抗体制备技术经过融合、克隆、筛选，获得识别微小隐孢子虫胞内期所有阶段的单克隆抗体；
9.所述的兔源多克隆抗体通过如下方法制备得到：利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为
抗原免疫新西兰兔，获得针对微小隐孢子虫的兔源多克隆抗体。
10.优选的，所述的微小隐孢子虫全虫蛋白通过如下方法获得：取微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200r/min离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和pbs后进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液。
11.更优选的，所述的次氯酸钠溶液的浓度为1.3wt％。
12.更优选的，所述的蛋白酶抑制剂和pbs的体积比为1:200。
13.优选的，所述的单克隆抗体的亚类为igm，与微小隐孢子虫子孢子前半部及细胞内生命周期所有阶段反应。
14.优选的，所述的单克隆抗体通过如下方法制备得到：
15.(1)动物免疫：取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、28、35天分别进行第二至第四次免疫；第四次免疫后第7天，采集并分离血清，通过间接elisa方法检测血清的抗体效价，经检测，小鼠血清抗体效价达到十万后，使用全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合；
16.(2)细胞融合：将小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞置于融合瓶中，离心后弃上清，重悬细胞沉淀后沿管壁加入预热的50％ peg融合剂，缓慢加入无血清dmem培养基终止融合，静置后离心，使用hat培养基悬浮细胞沉淀，混合后加入含有饲养细胞的细胞培养板，置于恒温co2培养箱中培养；
17.(3)杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接elisa法及间接免疫荧光法同时筛选阳性融合细胞，并进行两轮亚克隆，筛选获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫胞内期所有阶段的杂交瘤细胞株；
18.(4)单克隆抗体制备：选择经产雌性balb/c小鼠腹腔注射降植烷，7天后腹腔内注射杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，采集的小鼠腹水经离心后取上清液保存，经纯化后即获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体。
19.更优选的，所述的步骤(1)中，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二至第四次免疫使用弗氏不完全佐剂。
20.更优选的，所述的步骤(1)中，首次免疫蛋白量为50μg/只，第二次至第四次免疫量为80μg/只。
21.更优选的，所述的步骤(2)中，离心的条件均为：转速1000r/min，时间5min。
22.更优选的，所述的步骤(2)中，小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞的比例为5:1。
23.更优选的，所述的步骤(2)中，预热的温度为42℃。
24.更优选的，所述的步骤(4)中，降植烷的注射量为0.5ml/只。
25.更优选的，所述的步骤(4)中，杂交瘤细胞的注射量1
×
106个/只。
26.优选的，所述的兔源多克隆抗体通过如下方法制备得到：
27.(1)动物免疫：取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对新西兰兔进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、21、28天分别进行第二至第四次免疫；第四次免疫后第7天耳缘静脉采血并分离血清，获得兔源多克隆抗体血清；
28.(2)多克隆抗体纯化：取proteina+g agarose装柱，tbs缓冲液平衡柱子，步骤(1)所得兔源多克隆抗体血清过0.45μm滤膜后加入层析柱中，颠倒混匀，而后tbs缓冲液漂洗，
洗脱下非特异杂蛋白，再用甘氨酸洗脱抗体，收集的抗体超滤浓缩，pbs缓冲液换液，获得所述的微小隐孢子虫兔源多克隆抗体。
29.更优选的，所述的步骤(1)中，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二至第四次免疫使用弗氏不完全佐剂。
30.更优选的，所述的步骤(1)中，首次免疫蛋白量为500μg/只，第二次至第四次免疫量为200μg/只。
31.更优选的，所述的步骤(2)中，耳缘静脉采血后，先置于37℃恒温培养1h，而后置于4℃过夜培养，最后于4℃下10000r/min，离心10min分离血清。
32.更优选的，所述的步骤(2)中，超滤浓缩的条件为：10k超滤管，转速5000g/min，离心30min。
33.更优选的，所述的步骤(2)中，甘氨酸的浓度为50mm，ph1.9。
34.优选的，所述双抗体夹心elisa试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭剂、洗涤液、酶标二抗、显色液和elisa终止液。
35.更优选的，所述的酶标二抗为hrp(辣根过氧化物酶)标记山羊抗小鼠igg。
36.更优选的，所述的显色液为tmb显色液。
37.更优选的，所述的包被液通过如下方法制备得到：0.848g碳酸钠和1.428g碳酸氢钠溶解于500ml蒸馏水，调节ph至9.6。
38.更优选的，所述的封闭剂为5％脱脂奶粉。
39.更优选的，所述的洗涤剂为pbst缓冲液。
40.检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法，应用上述检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒检测微小隐孢子虫，具体包括如下步骤：
41.(1)包被多抗：将所述的多克隆抗体用包被液进行1:1000稀释，每孔100μl加入elisa酶标板中，在4℃下包被过夜；
42.(2)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；
43.(3)封闭：加入5％脱脂奶粉，100μl/孔，在37℃下封闭2h；
44.(4)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；
45.(6)加入检测样本上清液：加入pbs缓冲液至粪便样本中，捣碎形成粪便悬液，静置20min后2000r/min，离心60s，将上清液加入到酶标板，100μl/孔，在37℃下孵育45min；
46.(7)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；
47.(8)单克隆抗体孵育：将所述的单克隆抗体用pbs进行1:800稀释后，加入到酶标板，100μl/孔，在37℃下孵育45min；
48.(9)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；
49.(10)酶标二抗孵育：将hrp标记山羊抗小鼠igg进行1:1000稀释后加入到酶标板，100μl/孔，在37℃下孵育30min；
50.(11)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，再用pbs缓冲液清洗1次，每
次5min，拍干孔内残留液体；
51.(12)显色：加入tmb显色液，50μl/孔，常温显色10min；
52.(13)终止反应：加入elisa终止液终止显色，50μl/孔；
53.(14)读数：酶标板置于酶标仪内检测od
450
值，读取并保存数据；
54.(15)判断：按p/n＝待检样品孔od
450
值/阴性样品孔od
450
值，计算p/n值，若p/n值》2.1，判为阳性，若p/n值《2.1，判为阴性。
55.进一步地，所述的检测样本为临床粪便。
56.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
57.(1)应用本发明试剂建立的双抗体夹心elisa检测方法及其试剂盒，可用于临床样本中微小隐孢子虫的检测及鉴定。
58.(2)特异性强：建立的双抗体夹心elisa检测方法与其他病原(安氏隐孢子虫、大肠杆菌、弓形虫、球虫)无交叉反应，只检测出微小隐孢子虫，特异性较强。
59.(3)灵敏度高：建立的双抗体夹心elisa检测方法及其试剂盒，能对卵囊数量较少的样本进行有效检测，确保制备的检测试剂具有较好的灵敏度。
60.(4)稳定性好：检测试剂可在-20℃保存12个月以上，具有很好的稳定性。
附图说明
61.图1为本发明实施例制备的单克隆抗体的子孢子及胞内期ifa定位的显微镜图。
62.图2为本发明实施例制备的多克隆抗体的灵敏度检测的显微镜图。
具体实施方式
63.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
64.实施例1：抗微小隐孢子虫单克隆抗体的制备
65.1、微小隐孢子虫全虫蛋白抗原的制备：取适量微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200r/min，离心3min，次氯酸钠溶液(浓度为1.3wt％)冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和pbs(体积比为1:200)，进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融3次后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液。使用nanodroptmone仪器检测全虫蛋白浓度。
66.2、动物免疫：选择3只6周龄的雌性balb/c小鼠，取微小隐孢子虫全虫蛋白溶液与等体积佐剂混合，乳化后每只小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、28、35天分别进行第二次至第四次免疫。首次免疫蛋白量为50μg/只，第二次至第四次免疫蛋白量为80μg/只。首免使用弗氏完全佐剂，二至四免使用弗氏不完全佐剂。第四次免疫后第7天，采集并分离血清，通过间接elisa方法检测血清的抗体效价，经检测，当血清抗体效价达到十万后，用不加佐剂的全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合。
67.3、细胞融合：将小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按5:1的比例置于融合瓶中，1000r/min离心5min后，弃上清，叩匀细胞沉淀后沿管壁加入1ml预热至42℃的50％peg融合剂，缓慢加入无血清dmem培养基终止融合，静置10min后1000r/min离心5min。使用hat培养基悬浮细胞沉淀，混合后按每孔100μl加入前一天制备的含有饲养细胞的96细胞培养板，置
于恒温co2培养箱中培养。
68.4、杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接elisa法及间接免疫荧光法筛选阳性融合细胞，经过筛选及两轮亚克隆后获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫子孢子前半部及细胞内生命周期所有阶段的的杂交瘤细胞株。
69.5、单克隆抗体制备：经产雌性balb/c小鼠腹腔注射降植烷，0.5ml/只，7天后腹腔内注射1
×
106个杂交瘤细胞，约7天左右待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，采集的小鼠腹水经10000g/min离心10min后取上清液保存于-20℃。
70.6、单克隆抗体纯化：单克隆抗体使用hitrap igm purification hp填料进行纯化：蛋白纯化仪的泵中充满去离子水，除去阻塞头并将层析柱连接到接头，使层析柱中充满去离子水，接着使用5倍柱体积的去离子水将层析柱中的乙醇除去，接着使用5倍柱体积的结合缓冲液平衡层析柱，流速为1ml/min；然后使用注射器将预处理过的单克隆抗体从上样口加入泵中，上样的流速控制在1ml/min，结束后使用15ml结合缓冲液冲洗柱子，直到吸收值达到基线或没有物质被洗脱出，流速为2ml/min。收集的单克隆抗体转移至10k超滤管内5000
×
g，离心30min进行抗体的浓缩，期间用高压后的pbs进行换液，浓缩后的抗体采用nanodrop
tm
one仪器测定其抗体浓度，并分装保存于-80℃冰箱。
71.7、单克隆抗体鉴定
72.(1)单抗的亚类鉴定：根据proteintech单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书进行确定，经确定7c4-e3单克隆抗体的亚类为igm。
73.(2)单抗的细胞内生命周期定位鉴定：卵囊在4℃条件下，13200r/min，离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min后感染hct-8细胞，在培养12h、24h、36h及48h后取出，根据间接ifa的步骤，依次进行固定、透化、抗体孵育等步骤，结束后置于荧光显微镜下观察，确定单抗识别的细胞内生命周期阶段。结果如图1所示，单克隆抗体识别微小隐孢子虫子孢子前半部以及细胞内生命周期所有阶段，包括滋养体、成熟裂殖体、不成熟裂殖体、雌配子和雄配子。
74.实施例2：微小隐孢子虫兔源多克隆抗体的制备
75.1、动物免疫：2月龄新西兰兔适应性饲养3天后，使用微小隐孢子虫全虫蛋白溶液与等量佐剂乳化后免疫新西兰兔(背部皮下多点注射免疫)。首次免疫后第14、21、28天分别进行第二至第四次免疫。首次免疫蛋白量为500μg/只，第二次至第四次免疫蛋白量为200μg/只。弗氏完全佐剂用于首次免疫，弗氏不完全佐剂用于第二次至第四次免疫。在第四次免疫后7天，采集并分离血清，置于37℃恒温培养箱1h，取出后置于4℃冰箱过夜后4℃条件下，10,000r/min，离心10min分离血清，上清液为兔源多克隆抗体血清。
76.2、多克隆抗体纯化
77.取proteina+g agarose装柱，20ml tbs缓冲液平衡柱子，多克隆抗体过0.45μm滤膜后加入层析柱中，使其与protein a+g agarose混合，4℃层析柜中颠倒混匀30min，使其充分挂柱。而后在多抗流穿柱子后，使用20ml tbs缓冲液漂洗，洗脱下非特异杂蛋白，再用6ml 50mm甘氨酸(ph：1.9)洗脱抗体。收集的抗体于10k超滤管内5000g/min，离心30min进行浓缩，并用pbs给纯化后的抗体进行换液，测定浓度并分装保存于-80℃冰箱。
78.3、多克隆抗体灵敏度检测
79.将纯化后的微小隐孢子虫多克隆抗体进行灵敏度研究，根据间接免疫荧光检测法
的步骤进行。将抗体稀释至1:1000、1:5000、1:10000、1:15000、1:20000六个浓度梯度后对样品孔进行孵育，接着分别与anti-rabbit igg(h+l)alexa fluor 488荧光二抗及dapi染液1:1000孵育后清洗封片，并使用荧光显微镜观察。结果如图2所示，该抗体在1：20000稀释时，仍能够识别出微小隐孢子虫子孢子，说明该抗体效价较高，可用于后续实验。
80.实施例3：双抗夹心elisa检测方法的建立
81.1、捕获抗体和检测抗体最佳稀释度的确定
82.使用制备的多克隆抗体作为捕获抗体，同时使用与虫体生命周期所有阶段反应的单克隆抗体作为检测抗体，用于检测微小隐孢子虫裂殖子在生长发育过程中分泌于宿主粪便中的抗原蛋白。通过采用方阵滴定法确定多克隆抗体和单克隆抗体的最佳工作浓度，由表1可知，捕获抗体与检测抗体在各稀释倍数下其p/n值均大于2.1，说明该方法成功建立。同时根据p/n值确定捕获抗体的最适浓度为1:1000，检测抗体的最适浓度为1:800，在该抗体浓度下，其p/n值最高为8.3，最终确定这两个浓度为抗体的最佳工作浓度。
83.表1.多克隆抗体和单克隆抗体最佳浓度的确定
84.[0085][0086]
注：p为阳性粪便od
450
值；n为阴性粪便od
450
值；p/n为两者比值；阳性的判定标准为p/n值大于或等于2.1。
[0087]
2、最佳封闭剂的选择
[0088]
根据表2，用包被液将多克隆抗体进行4℃过夜包被后，选择5％脱脂奶粉进行封闭时p/n值最高，由此可确定最佳封闭剂为5％脱脂奶粉。
[0089]
表2.最佳封闭剂的选择
[0090][0091][0092]
3、粪便最佳孵育时间的确定
[0093]
确定最佳封闭剂后，小鼠粪便样本捣碎溶于pbs缓冲液中，静置20min后2000r/min，离心60s，取上清液依次加入样品孔内进行孵育，根据表3，孵育时间为45min时p/n值最高，由此可确定粪便上清液的最佳孵育时间为45min。
[0094]
表3.粪便上清最佳孵育时间的确定
[0095][0096]
4、单克隆抗体最佳孵育时间的确定
[0097]
确定了粪便上清最佳孵育时间后，根据表4，单抗的孵育时间为45min时p/n值最高，由此可确定单克隆抗体的最佳孵育时间为45min。
[0098]
表4.单克隆抗体最佳孵育时间的确定
[0099][0100]
5、酶标二抗孵育最佳时间的确定
[0101]
根据优化好的条件进行多抗包被、封闭、抗原和单抗孵育后，根据表5，酶标二抗的孵育时间为45min时p/n值最高，由此可确定酶标二抗的最佳作用时间为45min。
[0102]
表5.酶标二抗孵育最佳时间的确定
[0103][0104][0105]
实施例4：阴阳性判定标准的确定
[0106]
用已建立的双抗夹心elisa检测方法对20份经pcr检测为微小隐孢子虫阴性的粪便样本进行检测，记录od
450
值，并计算出平均值(x)及标准方差(sd)，根据公式：阴阳性临界
值＝x+3sd，为避免出现假阳性结果，在临界值基础上加减一个标准差作为可疑区间，并重新检测。经检测结果确定，此实验临界值为0.5，即当待测样品的od
450
≥0.5时，判定为阳性；当待测样品的od
450
≦0.3时，判定为阴性；介于两者之间，判为疑似阳性，需对样本进行重新检测。
[0107]
实施例5：特异性实验
[0108]
采用建立的夹心elisa检测法，对大肠杆菌粪便上清液、弓形虫上清液、球虫粪便上清液、安氏隐孢子虫粪便上清液进行检测，同时设置阴性对照(经pcr检测为微小隐孢子虫阴性的粪便样本)，根据表6，除微小隐孢子虫阳性粪便od
450
值大于0.5外，其余病原及阴性样本的检测od
450
值均小于0.5，说明该方法特异性检测出微小隐孢子虫，与其他病原均无交叉反应，特异性较好。
[0109]
表6.特异性检测
[0110][0111]
实施例6：灵敏度实验
[0112]
采用优化后的夹心elisa方法检测含有不同数量卵囊的小鼠粪便样本(每克粪便中含有103～107个卵囊)，确定该方法的灵敏度。根据表7，opg为103及以上的微小隐孢子虫粪便样本经检测其od
450
值均大于0.5，鉴定为微小隐孢子虫阳性。说明该方法能对微小隐孢子虫卵囊量较低的粪便样本进行有效检测，灵敏度较高，可应用于临床样本的检测。
[0113]
表7.灵敏度检测
[0114][0115][0116]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：包含抗微小隐孢子虫的单克隆抗体和兔源多克隆抗体；其中，所述的单克隆抗体通过如下方法制备得到：利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用单克隆抗体制备技术经过融合、克隆、筛选，获得识别微小隐孢子虫胞内期所有阶段的单克隆抗体；所述的兔源多克隆抗体通过如下方法制备得到：利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原免疫新西兰兔，获得针对微小隐孢子虫的兔源多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的微小隐孢子虫全虫蛋白通过如下方法获得：取微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200r/min离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和pbs后进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液。3.根据权利要求2所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的次氯酸钠溶液的浓度为1.3wt％；所述的蛋白酶抑制剂和pbs的体积比为1:200。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的单克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)动物免疫：取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、28、35天分别进行第二至第四次免疫；第四次免疫后第7天，采集并分离血清，通过间接elisa方法检测血清的抗体效价，在小鼠血清抗体效价达到十万后，使用全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合；(2)细胞融合：将小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞置于融合瓶中，离心后弃上清，重悬细胞沉淀后沿管壁加入预热的50％peg融合剂，缓慢加入无血清dmem培养基终止融合，静置后离心，使用hat培养基悬浮细胞沉淀，混合后加入含有饲养细胞的细胞培养板，置于恒温co2培养箱中培养；(3)杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接elisa法及间接免疫荧光法同时筛选阳性融合细胞，并进行两轮亚克隆，筛选获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫子孢子胞内期所有阶段的杂交瘤细胞株；(4)单克隆抗体制备：选择经产雌性balb/c小鼠腹腔注射降植烷，7天后腹腔内注射杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，采集的小鼠腹水经离心后取上清液保存，经纯化后即获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的步骤(1)中，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二至第四次免疫使用弗氏不完全佐剂；所述的步骤(1)中，首次免疫蛋白量为50μg/只，第二次至第四次免疫量为80μg/只；所述的步骤(2)中，离心的条件均为：转速1000r/min，时间5min；所述的步骤(2)中，小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞的比例为5:1；所述的步骤(2)中，预热的温度为42℃；
所述的步骤(4)中，降植烷的注射量为0.5ml/只；所述的步骤(4)中，杂交瘤细胞的注射量1
×
106个/只。6.根据权利要求5所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的兔源多克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)动物免疫：取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后乳化后对新西兰兔进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、21、28天分别进行第二至第四次免疫；第四次免疫后第7天耳缘静脉采血并分离血清，获得兔源多克隆抗体血清；(2)多克隆抗体纯化：取proteina+g agarose装柱，tbs缓冲液平衡柱子，步骤(1)所得兔源多克隆抗体血清过0.45μm滤膜后加入层析柱中，颠倒混匀，而后tbs缓冲液漂洗，洗脱下非特异杂蛋白，再用甘氨酸洗脱抗体，收集的抗体超滤浓缩，pbs缓冲液换液，获得所述的微小隐孢子虫兔源多克隆抗体。7.根据权利要求6所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述的步骤(1)中，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二至第四次免疫使用弗氏不完全佐剂；所述的步骤(1)中，首次免疫蛋白量为500μg/只，第二次至第四次免疫量为200μg/只；所述的步骤(2)中，耳缘静脉采血后，先置于37℃恒温培养1h，后置于4℃过夜培养，最后于4℃下10000r/min，离心10min分离血清；所述的步骤(2)中，超滤浓缩的条件为：10k超滤管，转速5000g/min，离心30min；所述的步骤(2)中，甘氨酸的浓度为50mm，ph1.9。8.根据权利要求6所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于：所述双抗体夹心elisa试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭剂、洗涤液、酶标二抗、显色液和elisa终止液；所述的酶标二抗为hrp标记山羊抗小鼠igg；所述的显色液为tmb显色液；所述的包被液通过如下方法制备得到：0.848g碳酸钠和1.428g碳酸氢钠溶解于500ml蒸馏水，调节ph至9.6；所述的封闭剂为5％脱脂奶粉；所述的洗涤液为pbst缓冲液。9.检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法，其特征在于：应用权利要求8中所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa试剂盒检测微小隐孢子虫，包括如下步骤：(1)包被多抗：将所述的微小隐孢子虫兔源多克隆抗体使用包被液进行1:1000稀释，每孔100μl加入elisa酶标板中，在4℃下包被过夜；(2)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；(3)封闭：加入5％脱脂奶粉，100μl/孔，在37℃下封闭2h；(4)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；(6)加入检测样本上清液：加入pbs缓冲液至粪便样本中，捣碎形成粪便悬液，静置20min后2000r/min，离心60s，将上清液加入到酶标板，100μl/孔，在37℃下孵育45min；(7)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；(8)单克隆抗体孵育：将所述的单克隆抗体用pbs进行1:800稀释，加入到酶标板，100μ
l/孔，在37℃下孵育45min；(9)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干孔内残留液体；(10)酶标二抗孵育：将hrp标记山羊抗小鼠igg进行1:1000稀释后加入到酶标板，100μl/孔，在37℃下孵育30min；(11)洗涤酶标板：甩干孔内液体，pbst缓冲液洗涤3次，再用pbs缓冲液清洗1次，每次5min，拍干孔内残留液体；(12)显色：加入tmb显色液，50μl/孔，常温显色10min；(13)终止反应：加入elisa终止液终止显色，50μl/孔；(14)读数：酶标板置于酶标仪内检测od
450
值，读取并保存数据；(15)判断：按p/n＝待检样品孔od
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值/阴性样品孔od
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值，计算p/n值，若p/n值>2.1，判为阳性，若p/n值<2.1，判为阴性。10.根据权利要求9所述的检测微小隐孢子虫的双抗体夹心elisa检测方法，其特征在于：所述的检测样本为临床粪便。

技术总结
本发明公开了一种检测微小隐孢子虫的双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用单克隆抗体制备技术，经过融合、克隆、筛选制备获得识别微小隐孢子虫胞内期所有阶段的单克隆抗体，作为检测抗体；利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原免疫新西兰兔，获得针对微小隐孢子虫的多克隆抗体，作为捕获抗体，并通过最佳稀释度的确定、封闭剂的选择、最佳孵育时间的确定等系列优化，建立了可用于临床样本中微小隐孢子虫的检测及鉴定的双抗体夹心ELISA检测方法及其试剂盒。该方法及试剂盒特异性较强，具有较好的灵敏度。具有较好的灵敏度。具有较好的灵敏度。


技术研发人员：冯耀宇 孙连静 肖立华 李娜 郭亚琼
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/10/6