一种植物乳杆菌P9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用的制作方法

一种植物乳杆菌p9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用
技术领域
1.本发明涉及肠道微生物技术领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌p9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用。


背景技术：

2.慢性腹泻是最常见的功能性胃肠疾病之一，定义为至少四周内每日超过三次排便或稀便。目前治疗腹泻的常规药物中存在一些有胃肠道副作用，如便秘、恶心、呕吐、腹胀和腹泻等。因此，探索治疗慢性腹泻的新方法尤其具有挑战性。已有研究发现肠道菌群与慢性腹泻密切相关，益生菌可以通过改善慢性腹泻患者的排便次数、排便困难程度从而缓解腹泻。然而，益生菌缓解慢性腹泻的研究中仍然缺少特异性菌株，可以有效缓解慢性腹泻的益生菌极为有限。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌p9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用，从而为缓解腹泻或治疗腹泻提供技术支持。
5.本发明是这样实现的：本发明提供了一种植物乳杆菌p9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用。
6.植物乳杆菌p9是华润江中制药集团有限公司联合内蒙古农业大学，从自然发酵酸粥中分离出来的具有自主知识产权的菌株。菌株信息参照专利cn113558244a公开的植物乳杆菌p9。植物乳杆菌p9的保藏号为cgmcc no .16662，保藏时间为2018年6月22日。
7.发明人联合使用宏基因组和代谢组学技术研究腹泻症状与肠道微生物群和粪便代谢产物之间的关系，发现连续摄入植物乳杆菌p9 28天后，慢性腹泻患者的腹泻严重程度显著改善，患者的粪便性状也得到了显著缓解，表明p9对于慢性腹泻具有治疗作用。具有缓解慢性腹泻的治疗效果，植物乳杆菌p9可以用于制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品。
8.腹泻包括急性腹泻和慢性腹泻，而急性腹泻可能由于（细菌、病毒或寄生虫）感染、（食物中毒、贵金属中毒、农药）中毒、（泻药、胆碱能药物、洋地黄类药物）药物或（溃疡性结肠炎急性发作、急性坏死性肠炎、食物过敏）其他疾病所致。而慢性腹泻的病因比急性更复杂，肠黏膜本身病变、小肠内细菌繁殖过多、肠道运输功能缺陷、消化能力不足、肠运动紊乱以及某些内分泌疾病和肠道外肿瘤均有可能导致慢性腹泻的发生。治疗难度远高于慢性腹泻，也是肠道领域的治疗难题。
9.在本发明应用较佳的实施方式中，药物或保健食品用于：调节肠道菌群，增加选自植物乳杆菌（lactiplantibacillus plantarum）、产scfas相关菌、
acutalibacteraceaesp000431775、lachnospira rogosae_a、oscillospiraceaesp900543625、嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）和gastranaerophilaceaesp000437435中的至少一种物种的含量。
10.发明人发现，植物乳杆菌p9可以通过调节肠道菌群，增加有益菌，尤其是在连续摄入植物乳杆菌p928天后，使得肠道中植物乳杆菌（lactiplantibacillus plantarum）、产scfas相关菌、acutalibacteraceaesp000431775、lachnospira rogosae_a、颤螺菌属（oscillospiraceae）、嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）和gastranaerophilaceaesp000437435的含量显著增加。上述菌种可能是p9改善腹泻相关的关键菌种。
11.毛螺菌属（lachnospira）存在于大多数健康人的肠道里，可能是一种潜在的有益菌，参与多种碳水化合物的代谢，发酵导致乙酸和丁酸的产生为宿主提供能量的主要来源。
12.在本发明应用较佳的实施方式中，产scfas相关菌包括不限于ruminococcus_afaecicola、木假单胞菌（paraprevotella xylaniphila）和butyricicoccus_a sp002395695中的至少一种。
13.在本发明应用较佳的实施方式中，药物或保健食品用于：调节肠道菌群，降低选自细枝真杆菌、归属颤螺菌科、归属粪球菌属、归属普氏栖粪杆菌、butyricimonas virosa、schaedlerellasp900066545和lachnospiraceaesp中的至少一种物种的含量。连续摄入植物乳杆菌p9 28天后，细枝真杆菌、归属颤螺菌科、归属粪球菌属、归属普氏栖粪杆菌、butyricimonas virosa、schaedlerellasp900066545和lachnospiraceaesp的含量显著减少，提示这些菌种可能在植物乳杆菌p9缓解腹泻中发挥重要作用。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，细枝真杆菌包括不限于eubacterium_iramulus_a和eubacterium_iramulus中的至少一种。
15.在本发明应用较佳的实施方式中，归属颤螺菌科的菌包括不限于oscillospiraceaesp000765235和oscillospiraceaesp900757695中的至少一种。
16.在本发明应用较佳的实施方式中，归属粪球菌属的菌包括不限于coprococcus_acatus、coprococcussp900066115和coprococcussp000154245中的至少一种；在一种可选的实施方式中，归属普氏栖粪杆菌包括不限于faecalibacteriumsp900539945、faecalibacteriumsp900539885和faecalibacterium prausnitzii_j中的至少一种。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，药物或保健食品用于：调节肠道内功能性代谢产物；功能性代谢产物选自：生物活性代谢物、scfas和其他代谢物，其他代谢物选自粪便代谢物，其包括咖啡酸（caffeic acid）、牛磺酸（taurine）、3-羟基戊酸（3-hydroxypentanoic acid）、十六烷酸（hexacosanoic acid）和二十六酸（cerotic acid）中的至少一种。
18.发明人发现，连续摄入植物乳杆菌p9 28天后，部分肠道内的功能性代谢产物发生显著变化，特别是scfas的含量变化，可以增强肠道免疫功能和抗炎作用，从而达到缓解腹泻的效果。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，生物活性代谢物包括不限于胆酸盐（cholate）、鹅去氧胆酸盐（chenodeoxycholate）、肉毒碱（c2.carnitine、c16.carnitine）、胆固醇（cholesterol）、肌酸（creatine）、胆红素（bilirubin）、乙酸苯酯（phenylacetate）、脱氧胆
酸（deoxycholic acid）、壬二酸盐（azelate）和谷氨酸（glutamate）中的至少一种。
20.在一种可选的实施方式中，药物或保健食品用于：调节胆酸盐（cholate）、鹅去氧胆酸盐（chenodeoxycholate）、肉毒碱（c2.carnitine、c16.carnitine）、胆固醇（cholesterol）、肌酸（creatine）和胆红素（bilirubin）的含量升高；在一种可选的实施方式中，药物或保健食品用于：调节乙酸苯酯（phenylacetate）、脱氧胆酸（deoxycholic acid）、壬二酸盐（azelate）和谷氨酸（glutamate）的含量降低；在一种可选的实施方式中，药物或保健食品用于调节其他代谢物的含量升高；在一种可选的实施方式中，scfas选自乙酸和丁酸，药物或保健食品用于调节乙酸和丁酸的含量升高。
21.保健食品包括不限于饮品、含片、固体饮料、咀嚼片、胶囊、颗粒剂和滴剂。
22.本发明具有以下有益效果：本发明发现植物乳杆菌p9具有缓解慢性腹泻的治疗效果，通过调节肠道菌群，增加有益菌，调节肠内某些功能性代谢产物，特别是scfas，增强肠道免疫功能和抗炎作用，从而达到缓解慢性腹泻的效果。与现有的植物乳杆菌atcc8014相比，植物乳杆菌p9具有更优的改善慢性腹泻的效果。因此，植物乳杆菌p9具有制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品的应用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
24.图1为试验流程图；图2为p9对慢性腹泻患者腹泻症状的影响的实验结果图；图3为p9对慢性腹泻患者情绪的影响的实验结果图；图4为各组受试者的肠道菌群shannon指数和simpson指数统计结果图；图5为受试者肠道菌群pcoa分析图；图6为p9组和安慰剂组在第28天时预测的差异潜在活性代谢产物展示图；图7为不同时间点p9组和安慰剂组的pls-da分析图；图8为p9组和安慰剂组的差异代谢物分析结果图；图9为p9干预28天后患者粪便中scfas的浓度图。
具体实施方式
25.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
26.除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、
微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols inmolecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
29.实施例1发明人使用宏基因组和代谢组学技术研究腹泻症状与肠道微生物群和粪便代谢产物之间的关系，探究植物乳杆菌p9缓解腹泻的可能机制。研究技术路线图参照图1所示，具体包括：（1）结合排便日记卡计算受试者腹泻严重程度、大便形态、排便次数和排便紧迫感，结合情绪量表计算患者情绪评分。
30.（2）使用 illumina novaseq 6000 平台对粪便样本肠道菌群进行宏基因组测序，研究摄入 p9 后受试者肠道菌群结构和组成的变化。
31.（3）使用 ab trip6600 对粪便样品中的代谢物进行非靶向代谢组学检测，研究摄入 p9 后粪便中差异代谢物和代谢通路的变化。
32.所采用的试验材料具体如下：1.试验菌株植物乳杆菌p9是华润江中制药集团有限公司联合内蒙古农业大学，从自然发酵酸粥中分离出来的具有自主知识产权的菌株。本试验中p9的包装形式为菌粉条，每条菌粉含量2g，活菌数为1
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cfu/条。安慰剂为与p9菌粉外观、口感、包装一致，不含p9的样品，成分为麦芽糊精（60%）、柳橙粉（20%）、麦芽糖醇（20%），由华润江中制药集团有限责任公司提供。
33.2. 研究人群招募（1）研究对象发明人与南昌大学第一附属医院消化内科合作开展，拟招募年龄在18-65岁，6个月前出现腹泻症状，近3个月出现如纳入标准所述症状的腹泻人群。经研究者初步评估符合该规定的患者签署知情同意书，开展14天的筛选期，筛选期结束后结合日记卡和纳排标准，
确定最终可纳入的患者，进行随机分组，具体筛选标准如下。
34.（2） 纳排标准i）纳入标准入组前症状出现至少6个月，且近3个月症状符合以下标准：（1）至少25%的时间排便为松散粪或水样粪（根据bristol分型为5、6、7型）。（2）必须符合下列2个标准之一：a. 18岁＜年龄≤50岁，筛选期大便常规（包括潜血）检查报告正常或研究者认为无临床意义的异常结果，男女不限；b. 50岁＜年龄≤65岁，6个月内国内三级以上医院结肠镜检查报告正常或研究者认为无临床意义的异常结果，男女不限；（3）签署知情同意书。
35.ii）排除标准a.有结肠癌、乳糜泻及炎症性肠病史及家族史；b.曾经结肠肠镜检查确诊有肠道器质性疾病；c.近期备孕者（包括男性及女性），妊娠或哺乳期妇女；d.对样品或成分过敏；e.近2周内服用过抗生素、益生菌制剂；f.近1个月服用过抗焦虑、抗抑郁等精神类药物；g.需要长期服用改善腹泻药物；h.曾确诊为心肌/脑梗死、恶性肿瘤等研究者认为不适合入组的严重疾病；i.有重大精神疾患，难以控制自己行动，无法配合研究开展；j.不识字，无法理解知情同意，无法自行签署知情同意书。
36.iii）退出标准受试者主动要求退出；失访；因不良反应退出试验。
37.（3）随机分组及干预措施通过14天筛选期，符合入组条件的患者进行随机分组，采用计算机产生随机序列，研究者进入中央随机化系统，记录入组患者信息，获得登记号，后随机分配至p9组（pla）和安慰剂组（pro）中。p9组受试者每日餐后摄入1条p9菌粉（1
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cfu/条）；安慰剂组受试者每日摄入1条安慰剂。服样周期为28天，随访期14天。
38.（4）盲法本实施例使用双盲设计，研究者不能确定受试者服用的是何种样品，受试者不能确定自己服用的是何种样品。由于该种要求，试验样品与安慰剂对照样品采用相同的外包装盒，内包装袋。试验样品与安慰剂对照样品口味相同。研究者及受试者均无法知道样品的信息，力求做到双盲。盲底一式两份，分别由主要研究者和申办方保存。
39.（5）合并用药研究期间不可使用的治疗。a.禁用除本研究外的其他益生菌、益生元、添加益生菌的食物（如酸奶）；b.禁止服用抗焦虑、抗抑郁等精神类药物者；c.禁止服用其他改善肠道症状的样品。
40.建议研究期间不使用抗生素。
41.建议研究期间保持正常饮食习惯。
42.所有研究期间使用的与排便有关的药物均应在日记卡上记录，并予以说明。
43.3.试验材料与仪器（1）试验材料磁珠法粪便基因组dna提取试剂盒（dp712，天根生化科技（北京）有限公司）、nebnext
®
ultra
™ꢀ
dna library prep kit for illumina
®
文库制备试剂盒（e7370s/l，neb公司）、qubit
®
dsdna hs分析试剂盒（q32854，thermofisher），粪便微生物代谢保护液套
装（ls-r-p-015，广东南芯医疗科技有限公司），甲醇（a452-4，色谱纯，fisher chemical），乙腈（merck，色谱纯，1499230-935），乙酸铵（fluka，色谱纯，17836-50g），氨水（sigma，色谱纯，16748-250ml）。
44.（2）仪器设备illumina测序仪（novaseq6000，illumina）、超声波破碎仪（le220r-plus，covaris）、agilent 2100生物分析仪（g2939a，agilent）、电泳仪（dyy-6c，北京六一生物科技有限公司）、pcr扩增仪（t100，bio-rad）、离心机（st16r，thermo）、恒温水浴锅（xh-t，江苏金怡仪器科技有限公司）、涡旋振荡器（thermomixerc，thermo），超高压液相色谱仪（agilent 1290 infinity，安捷伦科技有限公司），高分辨飞行时间质谱仪（tripletof 6600+，ab sciex），冷冻离心机（h1850-r，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），混匀仪（be-2600，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），高通量组织研磨器（mb-96，浙江美壁仪器有限公司），真空浓缩仪（scientz-1ls，宁波新芝生物科技股份有限公司）。
45.实施例2本实施例探究p9对慢性腹泻患者腹泻症状和情绪的影响。
46.受试者基本信息如下：本试验自2020年11月至2021年5月共招募符合条件的慢性腹泻受试者189人，所有受试者均已签署知情同意书，且服样依从性均≥80%。试验期间，有19人脱落，因此，最终纳入受试者的数量为170名，其中p9组85人（男/女，43/42）；安慰剂组85人（男/女，40/45），两组之间的男女比例无统计学差异（p》0.05）。p9组和安慰剂组的平均年龄均为22岁，两组间的年龄构成无差异（p=0.25，表1）。两组的民族占比中，安慰剂组汉族有81人，占比95.30%；p9组汉族有82人，占比96.47%，两组的民族构成无差异（p=1）。此外，两组之间的药物过敏史、其他过敏史、合并疾病和合并用药均无显著性差异。
47.表1受试者信息试验方法如下1.腹泻症状调查所有入组受试者通过排便日记卡记录试验过程中每日排便次数、布里斯托大便类型和排便紧迫感等信息。
48.腹泻严重程度为主要结局指标，每个访视点的腹泻严重程度评分为回顾前一周的大便次数、大便稠度和排便紧迫感情况得分的加和，其他指标为次要结局指标，主要内容包括：（1）第0天、14天、28天和42天，计算腹泻严重程度评分相对基线的变化；（2）据日志卡计算，从第1天到第42天，计算每周平均排便次数；（3）据日志卡计算，从第1天到第42天，计算每周大便形态平均得分（根据bristol量表评分）相对基线的变化；大便形态得分标准为：根据布里斯托大便类型的1-7分型分别
对应“1-7”分进行转化。
49.（4）根据日志卡计算，从第1天到第42天，计算每周大便排便紧迫感平均得分相对基线的变化。0分表示正常控制，1分表示偶有排便紧迫感，2分表示频繁的排便紧迫感，突然需要上厕所的感觉，影响社会活动，3分表示便失禁。
50.p9对慢性腹泻患者排便情况的影响结果如下：在第0天时，p9组（pro）与安慰剂组（pla）之间的腹泻严重程度、排便次数、排便紧迫感和粪便性状得分均无显著性差异（p》0.05）。如图2所示，第28天时，与安慰剂组相比，p9组的腹泻严重程度显著降低20.6%（p=0.048）。同时，摄入p9 28天后，患者的粪便性状得分相比于安慰剂组显著降低（p≤0.05）。此外，排便次数和排便紧迫感在安慰剂组和p9组不同时间点干预过程中，均无显著性差异。总的来说，p9对于慢性腹泻患者的腹泻症状具有缓解作用。
51.2.情绪评分所有入组的受试者在试验周期的第0天、14天、28天和42天时，采用抑郁焦虑和压力量表（depressive anxiety and stress scale，dass-21）评价慢性腹泻患者的情绪情况相对基线的变化。
52.p9对慢性腹泻患者情绪的影响结果如下：dass-21通过21个条目考察患者的抑郁（depression）、焦虑（anxiety）和压力（stress）等负面情绪的体验程度。通过患者在第0天、14天、28天和42天的dass-21问卷调查表，发明人发现第0天时，p9组与安慰剂组患者的抑郁、焦虑和压力水平均无显著性差异（p》0.05，图3）。同时，在第14天、28天和42天时，p9组与安慰剂组的抑郁、焦虑和压力水平也没有呈现出明显差异（p》0.05，图3）。
53.3.安全性指标不良事件和严重不良事件的报告将在知情同意书签署时开始被记录。
54.实施例3本实施例探究p9对慢性腹泻患者肠道菌群的影响以及种水平各组患者肠道优势菌群分析。
55.实验方法如下：1.粪便样品采集与保存收集受试者第0天、28天和42天的粪便。受试者排便后，用含有粪便微生物基因组保护液的粪便采集器采集粪便约3g，将粪便与保护液充分混匀，贴上标签后置于-80 ℃冰箱保存。
56.2粪便微生物宏基因组dna提取在2ml无菌离心管中加入0.25g粪便样本，使用dp712-磁珠法粪便基因组dna提取试剂盒进行宏基因组dna提取，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和完整性，qubit
®ꢀ
dsdna hs分析试剂盒对dna进行定量，所有操作参照说明书的方法进行，并将质量合格的dna置于-20 ℃冰箱备用。
57.3.宏基因组建库及测序取样本的1μg基因组dna，使用nebnext
®ꢀ
ultra
™ꢀ
dna library prep kit for illumina
®
文库制备试剂盒进行文库的构建，用超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp
的片段，经过末端修复、加a尾、加测序接头、纯化以及pcr扩增等步骤完成整个文库的制备。文库构建完成后，使用qubit 2.0荧光仪进行初步定量，稀释文库至2 ng/
µ
l，随后使用agilent2100生物分析仪对文库的insertsize进行检测，检测合格后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度（》3nm）进行准确定量。库检合格后，将不同文库按照有效浓度和目标下机数据量的需求pooling后进行illuminanovaseq 6000测序。
58.4.生物信息学处理本研究每份样品测序深度为10 gbp，测序数据经过质控、去宿主后得到clean data，使用megahit软件进行从头组装，将reads打断成k-mer后组装成contigs。使用metabat2、das tool和vamb软件选择大于2000 bp的contigs进行binning，后获得宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, mags）。使用bwa软件将reads 比对contigs，计算contigs深度。使用checkm软件对各mags的完整性和污染度进行评价。对高质量mags进行聚类，使用drep软件按95% 相似度聚类，识别出基本相同的基因组，并从每个重复组中选择种水平最佳基因组（species-level genome bins，sgbs）。通过kraken2软件和nr非冗余蛋白库对sgbs进行物种注释，使用diamond软件将sgbs与uniprot数据库进行比对后获取预测蛋白信息。每个sgbs的相对丰度通过coverm计算，使用参数
“‑
min-read-percent-identity 0.95
ꢀ‑
min-cover-fraction 0.4”进行，并由此得到物种丰度表。
59.接下来，应用一个从微生物群落分布预测群落代谢组的计算框架—melonnpan（model-based genomically informed high-dimensional predictor of microbial community metabolic profiles，基于模型的基因组信息高维微生物群落代谢谱预测器）筛选受试者肠道活性代谢产物。先使用seqtk随机提取每个样本250万个reads，再使用diamond blastx进行序列比对，参数设置为
“‑
query cover 90
ꢀ‑
id 50”。然后根据各基因的最佳值计算各样本的基因丰度。利用melonnpan-predict pipeline40将预测到的基因丰度转化为预测的活性代谢产物。
60.5.统计分析使用rstudio（v4.1.0）和adobe illustrator进行所有数据的统计分析和图形展示。使用非参数wilcoxon秩和检验分别对各个时间点p9组和安慰剂组的临床指标进行差异显著性检验，分类变量进行卡方检验。α多样性分析和主坐标分析（principal coordinates analysis, pcoa）使用r安装包“vegan”、“mixomics”和“ggpubr”进行可视化处理。采用bray curtis距离分析和置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, permanova）评估摄入p9后腹泻患者肠道菌群结构是否在不同时间或不同患者中存在显著性差异。差异分析均基于wilcoxon秩和检验和t检验进行。p》0.05表示差异不显著，p《0.05表示差异显著。
61.p9对慢性腹泻患者肠道菌群结构的影响结果参照图4所示，对170名慢性腹泻受试者摄入p9第0天、28天和42天的粪便微生物组进行宏基因组测序分析，平均每个样本测序深度为10 gbp，所有样本测序量均能满足后续分析。α多样性分析结果显示，相比于安慰剂组，摄入p9后患者肠道菌群shannon指数和simpson指数均未发生显著改变（p》0.05，图4）。
62.pcoa分析结果显示，第0天时p9组和安慰剂组的样本未明显分离，两组菌群结构未明显分开（图5）。第28天时，两组菌群结构呈现出显著性的分离趋势（图5，p《0.05）；第42天时，两组菌群结构依然呈现显著性分离趋势（图5，p《0.05），这些结果表明相比于安慰剂组，
摄入p9后患者肠道菌群结构发生显著改变。
63.种水平各组患者肠道优势菌群分析结果参照表2所示：在种水平，发明人进一步筛选了第0天在p9组和安慰剂组没有显著性差异而在其他时间点具有显著性差异的sgbs。结果发现，在第28天时，相比于安慰剂组，p9组共筛选出19个具有显著性差异的sgbs（表2）。其中，植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）、acutalibacteraceaesp000431775、木假单胞菌（paraprevotella xylaniphila）、lachnospira rogosae_a和ruminococcus_afaecicola的水平均显著升高（p《0.05），schaedlerellasp900066545、细枝真杆菌（eubacterium_iramulus_a、eubacterium_iramulus）、butyricimonas virosa、归属颤螺菌科的oscillospiraceaesp000765235、oscillospiraceaesp900757695以及归属粪球菌属的coprococcus_acatus、coprococcussp900066115、coprococcussp000154245等sgbs的水平均显著降低（p《0.05）。
64.在第42天时，相比于安慰剂组，在p9组共筛选出17个具有显著性差异的sgbs（表2）。其中，butyricicoccus_a sp002395695、oscillospiraceaesp900543625、嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）、gastranaerophilaceaesp000437435和paraprevotella xylaniphila的水平均显著升高（p《0.05），schaedlerellasp900066545、lachnospiraceaesp、butyricimonas virosa、归属普氏栖粪杆菌的faecalibacteriumsp900539945、faecalibacteriumsp900539885、faecalibacterium prausnitzii_j，以及归属粪球菌属的coprococcussp000154245和coprococcussp900066115等sgbs的水平均显著降低（p《0.05）。
65.有趣的是，摄入p9 28天和42天后，存在一些共有的sgbs，其中包含acutalibacteraceaesp000431775和paraprevotella xylaniphila的水平升高，schaedlerellasp900066545、coprococcussp900066115、coprococcussp000154245、catenibacteriumsp000437715和butyricimonas virosa的水平降低，提示这些菌种可能在p9缓解腹泻中发挥重要作用。
66.表2第28天和第42天时p9组和安慰剂组发生显著变化的sgbs
实施例4本实施例探究p9对慢性腹泻患者肠道代谢物的影响。
67.实验方法如下：1.粪便样品代谢组学前处理将粪便样品置于4 ℃解冻，后使用浓缩机对样本浓缩干燥；称取适量干燥后的样本于2 ml离心管，加入600
ꢀµ
l含2-氯苯丙氨酸（4 ppm）的甲醇溶液，混匀振荡30 s；将上述溶液加入100 mg玻璃珠，放入高通量组织研磨器，55 hz研磨60 s，室温超声10 min；12,000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清液经滤膜（0.22 μm）过滤，过滤完成后的液体置于进样瓶中，进行lc-ms检测。
68.2．代谢物检测（1）色谱分析采用agilent 1290 infinity lc超高效液相色谱系统进行测样。使用hilic色谱柱进行分离，柱温25 ℃，进样量2 μl，流动相组成为a相：水+25 mm乙酸铵+25 mm氨水，b相：乙腈。分析过程中样品均置于4 ℃自动进样器中，采用随机顺序进行样本的连续进样分析。样本进样队列中插入质控样品，用于监测和评价仪器的稳定性及实验数据的可靠性。
69.（2）质谱分析样品经uhplc分离后使用triple tof 6600+质谱仪进行质谱分析，采用电喷雾电离（esi）下正、负离子模式进行分别扫描。esi源设置参数如下：雾化气辅助加热气1（gas1）：60，辅助加热气2（gas2）：60，气帘气 （cur）：30 psi，离子源温度：600 ℃，喷雾电压（isvf）
±
5500 v（正负两种模式）；一级质荷比检测范围：60-1000 da，二级子离子质荷比检测范围：25-1000 da，一级质谱扫描累积时间：0.20 s/spectra, 二级质谱扫描累积时间0.05 s/spectra；二级质谱采用数据依赖型采集模式（ida）获得，并且采用峰强度值筛选模式，去簇电压（dp）：
±
60 v（正负两种模式），碰撞能量：35
±
15 ev，ida设置如下: 动态排除同位
素离子范围：4 da，每次扫描采集10个碎片图谱。
70.（3）粪便 scfas 含量测定取适量粪便样品于2 ml离心管中，加入50 μl磷酸（15%），再加 75 μg/ml 的内标（异己酸）溶液10 μl和乙醚140 μl匀浆1 min，于4 ℃ 12000 rpm离心。离心结束后，取200 μl上清液，用气相色谱仪测定scfas含量。色谱和质谱条件为：thermo trace 1300（thermo fisher scientific，usa）气相系统，色谱柱为agilent hp-innowax毛细管柱（30 m
ꢀ×ꢀ
0.25 mm id
ꢀ×ꢀ
0.25 μm）；分流进样，进样量1 μl，分流比10:1。进样口温度 250 ℃；离子源温度 300 ℃；传输线温度 250 ℃。程序升温起始温度90 ℃；然后以10 ℃/min 升温至120 ℃；再以5 ℃/min 升温至150 ℃；最后以25 ℃/min升温至250 ℃维持2 min。载气为氦气，载气流速1.0 ml/min。质谱条件为thermo isq 7000 质谱仪（thermo fisher scientific，usa），电子轰击电离（ei）源，sim扫描方式，电子能量 70 ev。
71.（4）代谢组学数据分析通过proteowizard软件包（v3.0.8789）中msconvert工具将原始质谱下机文件转换为mzxml文件格式。采用r xcms软件包进行峰检测、峰过滤和峰对齐处理得到物质定量列表，主要参数包括：bw=2，ppm=15，peakwidth=c（5, 30），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method='centwave'。采用公共数据库hmdb、massbank、lipidmaps、mzclound和kegg（kyoto encyclopedia of genes and genomes, 京都基因和基因组百科全书）及自建物质库进行物质的鉴定。基于质控样本的loess信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉质控样本中rsd》30%的物质。根据统计检验p值和变量投影重要度（variableimportancefortheprojection, vip）计算样品组间差异倍数，辅助关键差异代谢物的筛选。
72.3.统计分析使用rstudio（v4.1.0）和adobe illustrator进行所有数据的统计分析和图形展示。使用非参数wilcoxon秩和检验分别对各个时间点p9组和安慰剂组的临床指标进行差异显著性检验，分类变量进行卡方检验。α多样性分析和主坐标分析（principal coordinates analysis, pcoa）使用r安装包“vegan”、“mixomics”和“ggpubr”进行可视化处理。采用bray curtis距离分析和置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, permanova）评估摄入p9后腹泻患者肠道菌群结构是否在不同时间或不同患者中存在显著性差异。差异分析均基于wilcoxon秩和检验和t检验进行。p》0.05表示差异不显著，p《0.05表示差异显著。
73.p9对慢性腹泻患者肠道潜在生物活性代谢物的影响结果如下：通过melonnpan分析对慢性腹泻患者的肠道潜在生物活性代谢物进行鉴定，从p9组和安慰剂组共鉴定出了18个差异丰富的代谢物，第28天时，相比于安慰剂组，p9组的胆酸盐（cholate）、鹅去氧胆酸盐（chenodeoxycholate）、肉毒碱（c2.carnitine、c16.carnitine）、胆固醇（cholesterol）、肌酸（creatine）和胆红素（bilirubin）等代谢物的预测含量均显著升高（p《0.05，图6），而乙酸苯酯（phenylacetate）、脱氧胆酸（deoxycholic acid）、壬二酸盐（azelate）和谷氨酸（glutamate）等预测代谢物的含量均显著降低（p《0.05，图6）p9对慢性腹泻患者粪便代谢组的影响结果如下：对各组样本pls-da分析，建立第28天和第42天时p9组与安慰剂组的pls-da模型，
如图7所示，在第0天、28天和42天时，两组（安慰组和p9处理组）样本均未发生明显分离。
74.p9对慢性腹泻患者粪便代谢物的影响结果如下：基于pls-da模型（vip＞2.0和p＜0.05），分析p9组与安慰剂组之间代谢物组成的差异，在第28天和第42天共鉴定出21种代谢物，并且这些代谢物在基线时两组之间无显著差异。有趣的是，如图8所示，与安慰剂组相比，干预后p9组的咖啡酸（caffeic acid）、牛磺酸（taurine）、3-羟基戊酸（3-hydroxypentanoic acid）、十六烷酸（hexacosanoic acid）和二十六酸（cerotic acid）等代谢物的含量均显著增加（p＜0.05）。
75.此外，基于gc-ms技术检测患者粪便中scfas的含量。结果显示（图9），p9干预28天后，患者粪便中异戊酸、戊酸、丙酸和异丁酸的含量在p9组和安慰剂组中均没有显著变化（p＞0.05）。值得注意的是，相比于安慰剂组，p9干预后显著增加了患者粪便中乙酸和丁酸的浓度 (p＜0.05)。上述结果表明，p9干预伴随着患者肠道中某些功能性代谢物的改变，尤其是慢性腹泻患者粪便中的乙酸和丁酸的含量显著提升。
76.实施例5植物乳杆菌p9和植物乳杆菌atcc8014灌胃腹泻小鼠，对比疗效。
77.实验方法：分别使用植物乳杆菌p9活菌制剂和植物乳杆菌atcc8014活菌制剂对腹泻小鼠进行灌胃，灌胃剂量均为1
×
10
10
cfu/只，每日2次，400ul/次。观察小鼠粪便形状，腹泻次数和稀稠度。
78.实验结果显示：植物乳杆菌p9灌胃腹泻小鼠，7天后腹泻症状明显好转，小鼠的粪便从稀浆状逐渐变为颗粒状，腹泻次数明显减少，10d后粪便逐渐恢复正常状态。同时，植物乳杆菌atcc8014灌胃腹泻小鼠，7天后腹泻次数减少，但粪便性状改善效果不明显，多数依然处于稀便状态。因此，植物乳杆菌p9活菌制剂对腹泻小鼠的改善效果明显优于植物乳杆菌atcc8014活菌制剂。
79.综上，发明人通过宏基因组学和代谢组学测序技术对 p9 治疗慢性腹泻的潜在作用机制展开了一系列的研究，结果显示：（1）连续摄入 p9 28天后，相比于安慰剂组，慢性腹泻患者的腹泻严重程度显著改善，患者的粪便性状也得到了显著缓解，表明p9对于慢性腹泻具有治疗作用。（2）连续摄入p9 28天后，相比于安慰剂组，慢性腹泻患者肠道中的一些有益菌植物乳杆菌、产scfas相关菌（ruminococcus_afaecicola、paraprevotella xylaniphila、butyricicoccus_a sp002395695）等的含量显著增加，细枝真杆菌、归属颤螺菌科以及粪球菌属的一些物种的含量显著减少，上述这些菌种可能是p9改善腹泻相关的关键菌种。（3）连续摄入p9 28天后，相比于安慰剂组，慢性腹泻患者粪便中某些功能性的代谢产物，包括胆汁酸（鹅去氧胆酸、胆酸盐）、氨基酸（谷氨酸、牛磺酸）以及scfas（乙酸、丁酸）的含量发生显著变化。
80.综上所述，本研究支持p9缓解慢性腹泻的治疗效果，p9通过调节肠道菌群，增加有益菌，调节肠内某些功能性代谢产物，特别是scfas，增强肠道免疫功能和抗炎作用，从而达到缓解慢性腹泻的效果。
81.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种植物乳杆菌p9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或保健食品用于：调节肠道菌群，增加植物乳杆菌（lactiplantibacillus plantarum）、产scfas相关菌、acutalibacteraceae sp000431775、lachnospira rogosae_a、oscillospiraceae sp900543625、嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）和gastranaerophilaceae sp000437435中的至少一种物种的含量。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产scfas相关菌选自ruminococcus_a faecicola、木假单胞菌（paraprevotella xylaniphila）和butyricicoccus_a sp002395695中的至少一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或保健食品用于：调节肠道菌群，降低细枝真杆菌、归属颤螺菌科、归属粪球菌属、归属普氏栖粪杆菌、butyricimonas virosa、schaedlerella sp900066545和lachnospiraceae sp中的至少一种物种的含量。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细枝真杆菌选自eubacterium_i ramulus_a和eubacterium_i ramulus中的至少一种。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述归属颤螺菌科的菌选自oscillospiraceae sp000765235和oscillospiraceae sp900757695中的至少一种。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述归属粪球菌属的菌选自coprococcus_a catus、coprococcus sp900066115和coprococcus sp000154245中的至少一种；优选地，所述归属普氏栖粪杆菌选自faecalibacterium sp900539945、faecalibacterium sp900539885和faecalibacterium prausnitzii_j中的至少一种。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或保健食品用于：调节肠道内功能性代谢产物；所述功能性代谢产物选自：生物活性代谢物、scfas和其他代谢物，所述其他代谢物包括咖啡酸（caffeic acid）、牛磺酸（taurine）、3-羟基戊酸（3-hydroxypentanoic acid）、十六烷酸（hexacosanoic acid）和二十六酸（cerotic acid）中的至少一种。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物活性代谢物选自胆酸盐（cholate）、鹅去氧胆酸盐（chenodeoxycholate）、肉毒碱（c2.carnitine、c16.carnitine）、胆固醇（cholesterol）、肌酸（creatine）、胆红素（bilirubin）、乙酸苯酯（phenylacetate）、脱氧胆酸（deoxycholic acid）、壬二酸盐（azelate）和谷氨酸（glutamate）中的至少一种；优选地，所述药物或保健食品用于：调节胆酸盐（cholate）、鹅去氧胆酸盐（chenodeoxycholate）、肉毒碱（c2.carnitine、c16.carnitine）、胆固醇（cholesterol）、肌酸（creatine）和胆红素（bilirubin）的含量升高；优选地，所述药物或保健食品用于：调节乙酸苯酯（phenylacetate）、脱氧胆酸（deoxycholic acid）、壬二酸盐（azelate）和谷氨酸（glutamate）的含量降低；优选地，所述药物或保健食品用于调节所述其他代谢物的含量升高；优选地，所述scfas选自乙酸和丁酸，所述药物或保健食品用于调节乙酸和丁酸的含量升高。10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于，所述保健食品选自饮品、含片、固体饮料、咀嚼片、胶囊、颗粒剂和滴剂。

技术总结
本发明公开了一种植物乳杆菌P9在制备缓解或治疗慢性腹泻药物或调节肠道菌群的保健食品中的应用，涉及肠道微生物技术领域。发明人发现植物乳杆菌P9具有缓解慢性腹泻的治疗效果，通过调节肠道菌群，增加有益菌，调节肠内某些功能性代谢产物，特别是SCFAs，增强肠道免疫功能和抗炎作用，从而达到缓解慢性腹泻的效果。与现有的植物乳杆菌ATCC8014相比，植物乳杆菌P9具有更优的改善慢性腹泻的效果。杆菌P9具有更优的改善慢性腹泻的效果。杆菌P9具有更优的改善慢性腹泻的效果。


技术研发人员：权利要求书1页说明书12页附图5页
受保护的技术使用者：江中药业股份有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/10/6