一种用于增强内源性代谢分子MALDI质谱成像的新型组织包埋剂的制作方法

一种用于增强内源性代谢分子maldi质谱成像的新型组织包埋剂
技术领域
1.本发明属于生物成像领域，具体涉及一种用于增强内源性代谢分子maldi质谱成像的新型组织包埋剂。


背景技术：

2.代谢物，尤其是低分子量(low molecular weight,low-mw)化合物(质荷比小于2000)，包括各类小分子(质荷比小于500)1及脂质2的分布和变化,与各种生物进程密切相关。此前研究表明，低分子量化合物的研究在医学、植物科学、微生物学等诸多领域中有着重要作用
3,4
。尽管低分子量化合物的研究在目前受到了广泛关注，并取得了重大成果，但其生物学功能仍待进一步探究。近年来，质谱成像(mass spectrometry imaging,msi)，尤其是基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(matrix-assisted laser desorption/ionization msi,maldi-msi)已被开发并广泛应用于医学诊断、植物科学、药理研究等领域
5,6
中低分子量化合物的检测7。得益于maldi-msi无需标记、高分辨率、高通量等诸多特性，该技术已成为最适于生物样品研究的成像技术之一，对研究内源性代谢物至关重要。因此，其成像质量正在引起越来越多的关注。
3.maldi-msi成像的质量主要取决于基质选择、仪器性能和样品制备三个方面。在过去的20年间，由于众多基质的开发,
8,9
基质的筛选与优化已经成为了一个相对成熟的领域。同时，生物领域的研究人员又难以主导仪器的开发进程。maldi-msi的发展和样品的日趋复杂化又对样品准备流程提出了更高的要求，特别是对于脆弱样品的保护及处理流程中化学微环境的维稳成为了亟待解决的问题。
4.为了获得用于组织原位成像的高质量切片，许多包埋策略被引入到了样品准备流程中，如福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedding,ffpe)、最佳切割温度化合物(optimal cutting temperature compound,oct)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,cmc)和明胶的使用等。这些包埋策略取得了一定的效果，但是在后续的研究当中也暴露了其应用于maldi-msi研究的局限性。以目前应用范围最广的ffpe来说，该包埋方法能够提供最便于储存和切片的样本，但无法应用于msi中小分子代谢物的研究
10
。oct包埋的样品，能够得到形态和结构高度完整的切片，但是由于其内含聚乙二醇和聚乙烯醇这类聚合物，会引起强烈的离子抑制效果。cmc也是目前常用的包埋剂，但支撑性能又相对较弱。明胶能够较好地维持样品切片的组织形态，又几乎不存在离子抑制效果，是一种较为优良的包埋剂。但是其包埋过程中温度的升高也许会导致分析物降解和其他问题
11
。因为单一包埋剂的局限性，这些包埋剂的混合使用也形成了一类新的包埋策略
12
。这些研究也已经取得了较好的成效，但是通常会导致时间、精力等各方面成本的上升
11
。由于目前包埋方法的局限性，适用于maldi-msi的新型包埋方法开发也在逐步推进并受到重视。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)的新用途。
6.本发明所提供的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)的新用途是其在制备组织包埋剂中的应用。
7.本发明的另一个目的是提供一种组织包埋剂。
8.本发明所提供的组织包埋剂，包括质量浓度为3.5％-5％的paag溶液。
9.优选的，所述paag溶液中paag的质量浓度为4％。
10.进一步的，所述组织包埋剂还包括n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺和过硫酸铵；所述组织包埋剂中n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺的质量浓度为0.0001％-0.0004％，过硫酸铵的质量浓度为0.2％-0.5％。
11.优选的，所述述组织包埋剂中n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺的质量浓度为0.0001％，过硫酸铵的质量浓度为0.2％。
12.进一步的，所述paag由丙烯酰胺(acrylamide,am)和甲叉双丙烯酰(bis-acrylamide,bis)按照质量比为20:1的比例制备而成。
13.更进一步的，所述质量浓度4％的paag(am:bis＝20:1，w/w)溶液的制备方法如下：将19.05g am和0.95g bis溶于超纯水中，并在室温下稀释至500ml，然后将储备溶液转移至棕色瓶中，在4℃下暗存，整个制备过程不需要加热。
14.本发明中，所述组织包埋剂用于基质辅助激光解吸电离质谱成像(maldi-msi)。
15.本发明中，所述组织为生物组织，包括一般生物组织和脆弱生物组织；
16.所述一般生物组织如肝脏组织，具体可为小鼠肝脏；
17.所述脆弱的生物组织如眼球，具体可为大西洋鲑鱼眼球。
18.本发明再一个目的是提供一种生物组织的包埋方法。
19.本发明所提供的生物组织的包埋方法，包括下述步骤：在合适的容器底部加入本发明上述的包埋剂，待包埋剂凝固后，将待切片组织放置在已凝固的所述包埋剂表面，并将所述包埋剂溶液沿壁倒入容器中，待包埋剂凝固后，进行快速冷冻。
20.所述快速冷冻的条件为-80℃冷冻或液氮速冻。
21.上述包埋方法得到的产品也属于本发明的保护内容。
22.进一步的，可将上述包埋得到的产品制备成用于组织原位成像的高质量切片，更进一步的为适用于maldi-msi的理想切片。
23.对于制备大西洋鲑鱼眼球的切片而言，其最小厚度仅为12μm。
24.本发明提供了一种基于聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)开发的适用于maldi-msi的新型包埋策略，能够为脆弱样品提供支持和保护，同时帮助稳定样品代谢组。作为一种水凝胶，ppag具有均质、稳定、不可生物降解以及生物相容的特性
13
，此前已被广泛应用于化学分析、生物医学研究和工业生产
14
。由于其优秀的理化性质，paag能够帮助我们获得适用于maldi-msi的理想切片。与其他包埋剂相比，paag不仅更有助于保持样品形态，而且保证了maldi-ms在组织中检测到的代谢物的电离效率，尤其对低分子量化合物(m/z《500)和脂质效果极佳。
25.聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)作为一种新型包埋剂，被成功应用
mercaptobenzothiazole,2-mbt)及4-乙基米氏酮(michler’s ethylketone,mek,4,4
’‑
bis(diethylamino)benzophenone)购自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。超纯水经由milli-q净水系统获取(millipore usa)。其他未提及的合适纯度的试剂及材料均购自merck(darmstadt,germany)。小鼠肝脏取自8周龄成年雄性sprague-dawley小鼠(super-b&k实验动物有限公司，中国上海)。眼球取自大西洋鲑鱼(salmo salar)(中国北京四道口水产批发市场)。通过将所有组织样品缓慢浸入液氮中，将其快速冷冻以避免损害。所有动物器官的使用均经过中央民族大学生命与环境科学学院道德伦理委员会批准。
38.paag溶液组成的优化：paag溶液的质量浓度分别为2％、4％、8％和12％(am:bis＝20:1，w/w)。将小鼠肝脏包埋在不同浓度的paag中，然后切片以评估不同浓度paag的维持效果。
39.包埋剂的准备：本研究使用四种包埋剂，包括质量浓度为4％paag、10％明胶、1％琼脂糖和oct。
40.500ml质量浓度4％paag(am:bis＝20:1，w/w)储备溶液的制备：将19.05g am和0.95g bis溶于超纯水中，并在室温下稀释至500ml，然后将储备溶液转移至棕色瓶中，在4℃下暗存。整个制备过程不需要加热。在用作包埋介质之前，将n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺和过硫酸铵分别以0.0001％和0.2％的最终浓度加入到paag溶液中。通过将固体加入50ml烧杯中并加入超纯水来制备明胶和琼脂。然后在标准微波炉中加热烧杯，持续搅拌，不能过沸，直到固体完全溶解。
41.样品制备：在添加组织之前，准备合适的容器并在底部加入包埋剂。待包埋剂凝固后，将待切片组织放置在所述凝固的包埋剂表面，并将对应包埋剂溶液沿壁倒入容器中。包埋剂凝固后，在-80℃进行快速冷冻。
42.paag在制备过程中无需加热；明胶和琼脂包埋过程中，应当严格控制包埋的温度，在加热融化后，将琼脂糖和包埋剂溶液进行冷却，保证其处于即将凝固的状态进行沿壁倒入操作，以维持较低的操作温度，尽可能减少样品中化合物的降解，1％琼脂的凝固点约为40℃，10％明胶的凝固点约为25℃。
43.组织切片：组织切片在leica cm1860低温恒温切片机(leica microsystems，inc.wentzler，germany)中进行。冷冻小鼠肝脏和大西洋鲑鱼眼球在-20℃下分别制成12μm和20μm厚的切片。这些组织切片立即融裱在带氧化铟锡(indium tin oxide,ito)涂层的显微镜载玻片(bruker daltonics)导电侧。
44.基质喷涂：使用get(i)基质喷涂仪(华怡创生(北京)科技有限公司，中国北京)进行2-mbt和mek的基质喷涂。具体步骤及参数设置如下：用比例为：甲醇：水：甲酸(80:20:0.2，v/v/v)的溶液制备12mg/ml的2-mbt。用含1％nh3·
h2o的90％甲醇溶液制备浓度为12mg/ml的mek。将基质溶液喷涂在小鼠肝脏和大西洋鲑鱼眼球组织切片的表面上(喷涂5秒，干燥时间45秒)，循环十次，以预播种薄层基质。在通风橱中风干后，再将基质溶液均匀地喷涂在相同的组织切片上，重复50次。
45.maldi-ms。所有ms检测流程均在配备有固态smartbeam nd:yag紫外激光器(355nm，azura laser ag)的autoflex speed maldi time of fly(tof)/tof质谱仪(bruker daltonics，billerica，ma，usa)上进行。激光脉冲能量约为180mj，激光重复频率为2000hz。
46.对于代谢物原位检测和成像，分别在正离子模式和负离子模式下，以100至2000da的质量范围采集质谱信息。2-mbt和mek两种基质用于小鼠肝脏和大西洋鲑鱼眼球代谢物的原位检测和成像。为了获得maldi-ms profiling数据，累计激光扫描50次，每次扫描选择不同区域，每次扫描的激光为500shots，在正离子模式和负离子模式中分别累加。
47.对于maldi-msi，使用250μm激光光栅步长原位检测大西洋鲑鱼眼球组织切片中的代谢物，每次扫描(像素点)激光照射累计值为500shots。
48.数据分析：bruker flexanalysis 3.4软件被用于质谱profiling数据的初步观察和处理。处理后的质谱数据上传至metaboanalyst进行进一步的统计分析。离子信号成像图利用fleximaging 4.1软件(bruker)重构生成。借助lipid maps(https://www.lipidmaps.org/)和hmbd(https://hmdb.ca/)对代谢物的离子信号峰进行匹配鉴定，质量误差范围为
±
10ppm。在代谢物鉴定中考虑了[m+h]
+
、[m+na]
+
、[m+k]
+
和[m-h]-四种离子加合形式。
[0049]
苏木精和伊红(h&e)染色：根据先前研究的操作进行h&e染色，以获得标准的组织形态光学图像8。
[0050]
结果与讨论：
[0051]
paag包埋的可行性评估与优化。
[0052]
用maldi-ms检测paag背景信号和离子抑制情况以进行可行性评估。2-mbt和mek作为基质分别被用于正离子模式和负离子模式。喷涂基质后，检测到的paag离子信号与基质峰信号基本一致(图1)，证明在两种离子模式下，paag本身不存在能被检测到的信号。另外，包埋剂的硬度也与组织切片的成功与否密切相关。因此，我们评估了不同浓度的paag溶液凝固后的硬度，并选择了浓度为4％的paag以形成具有最适硬度的包埋块。
[0053]
组织形态维持效果评估。
[0054]
在初期实验中使用小鼠肝脏来进行形态维持效果评估。在这一阶段的评估当中，所有经过包埋的小鼠肝脏都能够制得比未包埋的肝脏更薄的切片。因此，大西洋鲑鱼眼球作为一种脆弱组织被选用于进一步的评估。鲑鱼眼球的形态维持效果在图2中进行展示。未包埋和冰包埋的眼球所得切片存在明显塌陷，原始结构难以维持。用琼脂处理的样品其切片存在一定程度的形变，但基本形状得以维持。明胶包埋眼球的切片显示出相对完整的结构，但存在一些褶皱现象。paag包埋处理的眼球则得到了形态结构完整，各组织分区清晰可见的理想切片。
[0055]
之后，我们继续评估不同切片厚度下各包埋剂的形态学维持效果。在确保切片形态完整的前提下，用明胶和琼脂包埋的眼球能够制得最小厚度为20μm的切片，而用oct和paag处理的切片的最小厚度分别为15μm和12μm(图3)。这些差异可能由两个原因造成：琼脂和明胶对组织的粘附性差，以及这两种包埋剂比paag或oct更硬，增加了切片难度。综上，我们总结了上述不同包埋剂的部分特性，汇总于表s1。
[0056]
表1.maldi-ms检测中paag包埋的特性，及其与四种常用包埋剂的比较
[0057][0058]
小鼠肝脏代谢分子的maldi-ms分析。
[0059]
小鼠肝脏作为一种均质器官，被用于评估paag包埋对组织中代谢物检测的影响。选择冰、琼脂、明胶及oct与paag包埋进行比较，用maldi-tof ms原位检测大鼠肝组织连续切片中的代谢物以进行评估(图4)。如图所示，paag包埋的应用可显著提高组织中代谢物的检测性能(表2和3)。由于强烈的聚合物离子抑制效应，oct包埋处理的检测结果未予展示。我们的结果表明，paag在正离子和负离子模式下都为组织代谢物的检测提供了更好的性能。可能原因推测如下：paag包埋无需加热，一步到位的操作可以避免组织中代谢物在包埋过程中因温度升高发生的变化；另外，paag的三维多孔结构增加了比表面积，在包埋过程中可能吸附了部分无机盐和季铵盐，从而降低了这些盐类对分析物电离的竞争抑制作用。
[0060]
表2.未包埋、冰包埋、琼脂包埋、明胶包埋及paag包埋的小鼠肝组织切片的maldi-tof/tof ms正谱(2-mbt作为基质)检测到的代谢物离子信号比较。
[0061]
[0062]
[0063][0064]
a)检测到的代谢物离子信号数据为每组处理三次平行检测中获得的重复值
[0065]
表3.未包埋、冰包埋、琼脂包埋、明胶包埋及paag包埋的小鼠肝组织切片的maldi-tof/tof ms负离子模式(mek作为基质)检测到的代谢物离子信号比较。
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
a)检测到的代谢物离子信号数据为每组处理三次平行检测中的重复值
[0071]
大西洋鲑鱼眼球中代谢分子的maldi-ms分析。
[0072]
为了进一步评估paag包埋的优势，大西洋鲑鱼眼球作为脆弱组织，用冰、琼脂、明胶、oct、paag五种包埋剂处理后切片，进行代谢物的原位maldi-ms检测(图5-8和表4-5)。由于冰包埋的形态维持效果较差，无法用于后续实验，在此不予展示。如图表所示，paag包埋的大西洋鲑鱼眼球组织切片中检测到的代谢物离子信号数量显著增加，离子信号强度也高于其他包埋剂处理组(图5a-b和图6-8)。以正离子模式的结果为例，在paag处理的切片中检测到的代谢物离子信号数量明显多于其他组(表4)，且paag处理的切片中检测到代谢物平均离子信号强度分别比oct、琼脂和明胶处理组高681％、460％和288％(图5c)。在负离子检测模式下也呈现出类似情况(图5d)。实验结果表明，琼脂和明胶包埋过程中的温度上升可能会导致一些代谢物降解，这更突出了paag包埋无需要加热的优点。由于聚合物的干扰和离子抑制，oct将不会用于后续的maldi-msi分析。
[0073]
大西洋鲑鱼眼球中代谢分子的maldi-msi分析。
[0074]
为了确定paag是否可用于脆弱组织切片中代谢分子的maldi-msi检分析，大西洋鲑鱼眼球在用paag、明胶、琼脂包埋后进行切片，用于成像效果评估。如图9所示，大西洋鲑鱼眼球的解剖形态可以清楚地分为晶状体、玻璃体、视网膜和睫状体及巩膜软骨。与明胶和
琼脂包埋的眼球所制得的组织切片相比，经paag处理的切片在光学和h&e染色图像中显示出更完整的形态。图9还展示了用不同包埋剂处理的大西洋鲑鱼眼球组织切片中检测到的代谢物离子的maldi成像结果的比较，且我们通过mald-tof/tof ms/ms及lc-ms/ms对相关代谢分子进行了检测获得了cid离子碎片信息用于化合物鉴定。结果显示，m/z 239.00[maleylacetoacetic acid+k]
+
、m/z 830.54[pc(p-38:5)+k]
+
、m/z 351.22[prostaglandin-h]-和m/z 775.54[pg(36:1)-h]-四种离子仅在paag处理的组织切片中检测到,而在用琼脂和明胶处理的切片中未发现这些复合离子的分布。值得注意的是，在paag处理的切片中可以清楚地观察到这些代谢物的区域性分布。例如，m/z 239.00的maleylacetoacetic显示出了在巩膜软骨上的分布。pc(p-38:5)(m/z 830.54)和pg(36:1)(m/z 775.54)这两种脂质则主要分布于玻璃体当中。而化合物prostaglandin(m/z 351.22)在玻璃体，睫状肌和视网膜上均有分布。这些代谢产物在鲑鱼眼球中的确切生物学功能尚不清楚，但这些内源性化合物的异质分布应该与鲑鱼眼球的生理生化状态密切相关。尽管仍需要进行更多的研究来识别所有可检测的代谢物离子信号，但我们的结果清楚地证明，paag包埋可以为maldi-ms检测提供具有更好的代谢物检测和成像性能的理想组织切片，尤其是对于眼球等脆弱组织更是如此。
[0075]
总结：上述结果显示，在本项研究中，paag作为适用于maldi-msi的新型包埋剂，可以很好地保持切片的形态，并有助于增强有效的代谢物离子信号。此外，paag无需加热，一步成型的包埋方式相较于琼脂和明胶一类的常用包埋剂来说更为温和。同时，paag不存在背景信号，并且几乎没有离子抑制作用。与常用的包埋剂相比，paag可以在maldi-msi的正离子和负离子模式的检测中提供更多且强度更高的有效代谢物离子信号。总之，我们的研究成功证明了paag作为maldi-msi包埋剂的优势，扩展了maldi组织成像在生物样品，尤其是在脆弱样品中的应用。
[0076]
表4.oct包埋、琼脂包埋、明胶包埋及paag包埋的大西洋鲑鱼眼球组织切片的maldi-tof/tof ms正离子模式(2-mbt作为基质)检测到的代谢物离子信号比较。
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081][0082]
a)检测到的代谢物离子信号数据为每组处理三次平行检测中的重复值。
[0083]
表5.oct包埋、琼脂包埋、明胶包埋及paag包埋的大西洋鲑鱼眼球组织切片的maldi-tof/tof ms负离子模式(mek作为基质)检测到的代谢物离子信号比较。
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088][0089]
a)检测到的代谢物离子信号数据为每组处理三次平行检测中的重复值。
[0090]
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技术特征：
1.聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)在制备组织包埋剂中的应用。2.一种组织包埋剂，包括质量浓度为3.5％-5％的paag溶液。3.根据权利要求1所述的组织包埋剂，其特征在于：所述paag溶液中paag的质量浓度为4％。4.根据权利要求2或3所述的组织包埋剂，其特征在于：所述组织包埋剂还包括n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺和过硫酸铵；所述组织包埋剂中n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺的质量浓度为0.0001％-0.0004％，过硫酸铵的质量浓度为0.2％-0.5％；优选的，所述述组织包埋剂中n、n、n、n
’‑
四甲基乙二胺的质量浓度为0.0001％，过硫酸铵的质量浓度为0.2％。5.根据权利要求1所述的应用或权利要求2-4中任一项所述的组织包埋剂，其特征在于：所述paag由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰按照质量比为20:1的比例制备而成。6.根据权利1所述的应用或权利要求2-5中任一项所述的组织包埋剂，其特征在于：所述组织包埋剂用于基质辅助激光解吸电离质谱成像(maldi-msi)；所述组织为生物组织，包括一般生物组织和脆弱生物组织。7.一种生物组织的包埋方法，包括下述步骤：在合适的容器底部加入权利要求2-5中任一项所述的组织包埋剂，待所述包埋剂凝固后，将待包埋的生物组织放置在已凝固的所述包埋剂表面，并将所述包埋剂溶液沿壁倒入所述容器中，待包埋剂凝固后，进行快速冷冻。8.根据权利要求7所述的包埋方法，其特征在于：所述快速冷冻的条件为-80
o
c冷冻或液氮速冻。9.权利要求7或8所述方法制备得到的产品制备成用于组织原位成像的高质量切片。10.根据权利要求9所述的切片，其特征在于：所述切片为适用于maldi-msi的理想切片。

技术总结
本发明公开了一种用于增强内源性代谢分子MALDI质谱成像的新型组织包埋剂。本发明将聚丙烯酰胺凝胶作为包埋剂，被应用于为生物组织切片提供更有效的支持和保护作用，同时增强了MALDI-MSI中组织代谢物成像的效果。PPAG、琼脂、明胶、OC和冰被用于包埋小鼠肝脏和大西洋鲑鱼眼球。包埋后的组织随后进行切片并融裱在导电显微玻片上进行MALDI-MSI检测以评估包埋效果。结果显示，PAAG有着优于琼脂、明胶等常用包埋剂的特性，包括无需加热一步成型的操作流程、更好的形态维持效果，不存在低于m/z 2000的聚合物离子信号干扰以及更好的代谢物原位电离效果。证实了PAAG包埋作为应用于代谢物MALDI组织成像实践标准的潜力。MALDI组织成像实践标准的潜力。


技术研发人员：王晓东 杨晨钰 秦亮 陈路路
受保护的技术使用者：华怡创生（北京）科技有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/10/6