一种用于检测黄曲霉毒素B1的侧流免疫分析试剂盒及方法

生物素/链霉亲和素@量子点探针和侧流免疫分析试纸条，所述侧流免疫分析试纸条的硝酸纤维素膜上设置有t线和c线，所述t线上涂有afb1-bsa抗原，所述c线上涂有生物素标记的牛血清蛋白。
7.进一步地，所述纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针由纳米抗体-生物素与链霉亲和素@量子点通过生物素和链霉亲和素的定向偶联策略结合生成；所述纳米抗体-生物素的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述链霉亲和素@量子点由链霉亲和素修饰到cooh-qds上获得。
8.进一步地，所述链霉亲和素@量子点的制备方法包括以下步骤：将cooh-qds加入到硼酸缓冲液中，再加入edc和nhs，37℃垂直培养60分钟，加入链霉亲和素，25℃涡旋60分钟，加入2-巯基乙醇孵育30分钟，离心取沉淀，获得链霉亲和素@量子点。
9.进一步地，所述离心取沉淀后还包括以硼酸盐缓冲液洗涤沉淀的步骤，洗涤2次。
10.进一步地，所述cooh-qds的发射波长为585nm。
11.进一步地，所述afb1-bsa抗原的浓度为0.6mg
·
ml-1
。
12.本发明还提供一种检测黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：
13.(1)将纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针与黄曲霉毒素b1分子溶液在室温防光条件下振动孵育10分钟，然后加入到侧流免疫分析试纸条的样品垫中，室温下反应15分钟，当t线和c线的荧光强度稳定后，读取t线和c线的灰度结果；
14.(2)根据t线和c线的灰度结果，建立标准曲线；
15.(3)采用步骤(1)相同的方法结合步骤(2)所得标准曲线，获取待测样品中黄曲霉毒素b1的含量。
16.进一步地，在步骤(1)中，所述黄曲霉毒素b1分子溶液的浓度为1
×
10
0-1
×
10
10
ng
·
ml-1
。
17.进一步地，在步骤(1)中，当t线和c线的荧光强度稳定后，用智能手机在435纳米的激发波长下进行拍照记录，读取t线和c线的灰度结果。
18.本发明还提供所述的试剂盒在检测食品中黄曲霉毒素b1中的应用。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.1、本发明首次基于生物素-链霉亲和素定向偶联策略开发了一种纳米抗体lfia试纸条，定向偶联策略可以克服随机修饰导致纳米抗体活性降低的缺陷，极大地保留纳米抗体的活性；生物素-链霉亲和素系统的组装高度灵活，并可通过不同的链霉亲和素@纳米材料发展为不同种类的试纸条；与传统的基于mab的lfia相比，本发明的纳米抗体lfia试纸条在不同检测环境下表现出更高的稳定性和耐受性。
21.2、本发明提供了一种利用智能手机摄影进行afb1检测的快速无仪器现场分析lfia(nq&sc-lfia)。利用智能手机摄影作为灰度读数，具有快速、准确、稳定、无仪器的现场分析等特点，经过优化，afb1的检测限(lod)为0.106ng
·
ml-1
，ic
50
为0.86ng
·
ml-1
。同时在检测时不与其他结构类似物发生交叉反应，特异性高；且具有长期稳定的特点，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。具有广泛推广空间，极具市场前景。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所
需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明方法的检测原理示意图；
24.图2为nb81c-avi融合蛋白的sds-page；
25.图3为nb81c纳米抗体中cdr区域的结构，该模型由在线软件swiss-model获得；
26.图4为nb81c的ramachandran分析；
27.图5为nb81c与afb1的分子对接(a)和分子对接结果分析(b)；
28.图6为nb81c的敏感性曲线；
29.图7为nb81c与抗afb1的mab在75℃下孵育不同时间(a)，不同ph值的pbs缓冲液(b)、不同浓度的甲醇(c)以及不同浓度的nacl(d)作为稀释试剂时的结合活性；
30.图8为绿色荧光(a)、橙色荧光(b)和红色荧光(c)的qds的tem结果；
31.图9为单独的cooh-qds、sa、sa@qds、nb-avi以及nb-avi/sa@qds的zeta电位；
32.图10为单独的cooh-qds、sa@qds以及nb-avi/sa@qds的dls结果；
33.图11为sa@qds以及nb-avi/sa@qds在激发和发射波长为525nm(a)、585nm(b)和605nm(c)下的荧光强度；
34.图12为发射波长525nm量子点不同浓度完全抗原优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
35.图13为发射波长585nm量子点不同浓度完全抗原优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
36.图14为发射波长605nm量子点不同浓度完全抗原优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
37.图15为试纸条上样缓冲液甲醇浓度优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
38.图16为试纸条上样缓冲液ph值优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
39.图17为试纸条上样缓冲液吐温浓度优化结果，其中a为柱状图，b为灰度分析图；
40.图18为δg与牛血清蛋白(bsa)中afb1浓度之间的线性关系；
41.图19为牛血清蛋白(bsa)中不同浓度afb1下出发的荧光视觉强度(a)和不同霉菌毒素触发的荧光视觉强度(b)；
42.图20为牛血清蛋白(bsa)中不同浓度afb1下出发的荧光视觉强度对应的灰度结果；
43.图21为基于纳米抗体和基于mab的试纸条在不同甲醇浓度(a)、不同nacl浓度(b)和不同温度(c)下的结合活性以及在50℃恒温箱中分别储存7天、15天和23天后的δg(d)。
具体实施方式
44.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
45.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
46.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
47.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
48.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
49.本发明首次基于生物素-链霉亲和素定向偶联策略开发了一种纳米抗体lfia试纸条，利用智能手机拍照现场检测黄曲霉毒素b1(afb1)，如图1所示。将afb1-bsa抗原喷洒在检测线(t)上，将生物素标记的牛血清蛋白(bsa)喷洒在nc膜的对照线(c)上，以取代传统的抗体并在c线上提供稳定的信号。制备了纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点(nb-avi/sa@qds)探针并在lfia试纸条上进行了评估，nb-avi/sa@qds探针显示了令人满意的荧光线，表明基于生物素标签和链霉亲和素@量子点的定向偶联策略将值得称赞地保留纳米抗体的活性。然后，利用智能手机拍照基于nb-avi/sa@qds的lfia试纸条(nq&sc-lfia)进行了afb1的检测，并显示出令人满意的性能。然后，在不同的环境下对基于纳米抗体和mab的试纸条进行了比较，发现纳米抗体条带显示出较高的甲醇耐受性、较好的离子浓度耐受性和较宽的温度适应性。
50.实施例1抗黄曲霉毒素b1纳米抗体的制备
51.1.制备方法
52.根据前期成功构建的骆驼源性抗afb1免疫纳米抗体库，通过噬菌体淘筛，从中筛选出高灵敏度、高稳定性的抗afb1纳米抗体，命名为nb81c(nb)，具体方法参照申请号为202210890250.1的专利申请文件。
53.nanobody-avi(nb-avi，纳米抗体-生物素，对应nb81c-avi)是以nb为基础，添加avi标签蛋白，使其能够在大肠杆菌体内天然修饰上生物素。
54.nb81c-avi基因片段通过聚合酶链反应(pcr)扩增获得，扩增引物：见表1，扩增体系见表2，扩增反应条件为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，36个循环；72℃5min；4℃forever。
55.表1扩增引物
[0056][0057]
表2反应体系
[0058]
试剂体积(μl)nb81c基因片段1nanobody-avi-f1nanobody-avi-r12
×
q5high-fidelitymastermix25ddh2o22
[0059]
将pcr扩增产物nb-avi基因片段连接到质粒载体pet-22b中，利用质粒周质中带有nb和nb-avi基因片段的pet-22b载体分别表达携带组氨酸标签(his-tag)的nb和nb-avi。大肠杆菌transb(de3)转化的阳性nb-pet-22b和nb-avi-pet-22b载体在16℃条件下用iptg(0.1mm)诱导12小时，以获得对抗afb1的nb-81c和nb-81c-avi。
[0060]
用镍-亲和层析柱(ni-nta)从周质提取物中纯化了nb和nb-avi。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)对nb和nb-avi的表达和纯化进行了分析。nb-avi融合蛋白的sds-page结果如图2所示，目的蛋白位于17kda左右，且条带单一，说明nb-avi纳米抗体成功制备。目的蛋白其氨基酸序列如seq id no.3-4所示。
[0061]
nb-81c氨基酸序列(seq id no.3)：
[0062]
vlaallqgvqaqvqlvdsgggsvqaggslrlscvasgytlsnycmgwfrqvs gkeregvagiwtgggsiwyadsvkgrftisqdkdkktlylqmnslkpedtavyyca aepwggpssscpgrpdeyrywgqgtqvtvsslehhhhhh。
[0063]
nb-81c-avi氨基酸序列(seq id no.4)：
[0064]
vlaallqgvqaqvqlvdsgggsvqaggslrlscvasgytlsnycmgwfrqvs gkeregvagiwtgggsiwyadsvkgrftisqdkdkktlylqmnslkpedtavyyca aepwggpssscpgrpdeyrywgqgtqvtvssglndifeaqkiewhelehhhhhh，加粗斜体为avi标签。
[0065]
将nb81c的氨基酸序列提交给swiss-model同源模型(https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模和构建三维结构(图3)，并使用gromacs的opls-aa/l力场进行优化。nb81c的ramachandran分析(图4)显示92.8％的氨基酸位于核心区，表明nb81c结构合理优化(nb81c的主要参数为qmean 0.77
±
0.07和gmqe0.68)。从pubchem有机小分子生物活性数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载afb1结构式，并使用autodock4.2.6成功完成afb1与nb81c的分子对接(图5的a)。分子对接结果显示，afb1位于由cdr2和cdr3区域构成的纳米抗体活性口袋中，相互作用分析显示，与trp113的pi-pit型；与gly114/gly115/ser117/ser118的常规氢键(图5的b)决定了其高特异性和亲和性。
[0066]
2.纳米抗体的生物活性
[0067]
间接竞争性酶联免疫吸附试验(icelisa)用于确定nb的敏感性，如图6所示，icelisa显示了以抗vhhigg-hrp为二抗的nb81c的敏感性，线性范围从0.286ng
·
ml-1
到4.150ng
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，lod为0.135ng
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，ic
50
为0.969ng
·
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。
[0068]
为了提高免疫测定方法的稳定性，以间接酶联免疫吸附试验(ielisa)验证了nb和抗afb1的mab在多种因素下的结合活性和耐受性，包括ph(2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0)；pbs稀释液的甲醇含量(0％，20％，40％，80％，100％，v/v)；nacl的浓度(0，100，200，500，1000mm的反应液)；nb和mab的热稳定性(75℃下0，5，10，20，30，40分钟)。结果如图7所示。
[0069]
抗体的热稳定性反映了其在极端温度条件下或反复多次冻融后保持活性的能力，
与抗afb1的mab相比，nb81c表现出较高的热稳定性(图7的a)，因为nb81c在75℃孵育40分钟后可以保持71.4％的结合活性，而mab在75℃仅5分钟内几乎完全没有活性。如图7的b所示，nb81c对ph值的耐受性比mab好，nb81c在ph＝8时达到结合活性的最高峰，mab在ph＝6时达到结合活性的最高峰，但纳米抗体在酸性或碱性条件下表现出更高的活性。如图7的c所示，当甲醇浓度高于20％时，mab的结合活性明显下降(95.9-26.8％)，但在甲醇浓度高达100％时，nb81c的结合活性仍保持在63.4％。基于对有机溶剂和酸/碱具有高耐受性的抗体的免疫测定为应用提供了额外的优势，如节省样品预处理时间和避免因多次样品稀释而产生的误差。由于食品或饲料分析经常伴随着高盐条件，所以检查了纳米抗体和mab的耐盐性，如图7的d所示，当nacl浓度小于500mm时，nb81c几乎不受影响(从100到91.2％)，mab结合活性有小幅下降(从100到77.9％)，但当nacl浓度达到1000mm时，nb81c的耐受性略差。简而言之，nb81c在免疫测定应用中表现出更大的潜力。
[0070]
实施例2试纸条的制备
[0071]
在硝酸纤维素膜(nc膜)上设置一条测试线(t线)和一条对照线(c线)，用biodotxyz3050绘图仪(irvine,ca)以1μl
·
min-1
的分配率在t线上涂上不同浓度的afb1-bsa(0.3,0.6,0.9mg
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ml-1
)，在c线上涂上avi-bsa(1.0mg
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)。将条带组装起来，nc膜的任何一端分别与塑料背板上的样品垫和吸收垫部分重叠。用cts300(中国上海)自动切纸机将条带切成3.5毫米宽，并用干燥剂保存在4℃。
[0072]
实施例3sa@qds的制备以及nb-avi/sa@qds探针的表征
[0073]
通过edc/nhs法将链霉亲和素(sa)修饰到cooh-qds上，0.16nmol的cooh-qds(20μl；8μm)被稀释在80μl的硼酸缓冲液(0.05m，ph7.4)，然后加入77.6μl的edc(10.0mg
·
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)和28.7μl的nhs(10.0mg
·
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)以使羧基在荧光qds上具有活性。混合物在恒温培养垂直混合器上培养(37℃，60分钟)，加入100μl16μmsa，涡旋60分钟(25℃)。为了中止反应，加入1.2μl2-巯基乙醇并孵育30分钟。随后在4℃下以12000rpm离心5分钟，用500μl硼酸盐缓冲液洗涤沉淀物，重复两次。sa@qds的沉淀物重悬于200μl的重悬液(0.05％nan3在硼酸盐缓冲液中，v/v)，使用前在4℃下保存。
[0074]
通过透射电子显微镜(tem)分别对不同粒径量子点进行表征，观察其形貌；采用zeta电位对cooh-qds、sa/qds、nb-avi、nb-avi-sa/qds进行表征，验证nb是否修饰到量子点微球上；采用动态光散射(dls)对cooh-qds、sa/qds、nb-avi-sa/qds进行表征，验证其修饰前后粒径变化。表征结果显示在图8-11中，三种qds的tem结果如图8所示，图8中的a为绿色荧光的qds(em525nm)；图8的b为橙色荧光的qds(em585nm)；图8的c为红色荧光的qds(em605nm)。在zeta电位表征中，与单独的cooh-qds相比(-8.92mv)，sa@qds在修饰了带负电荷的sa(-17.57mv)后，显示出明显的电荷变化(-16.43mv)，证实了sa@qds的成功制备(图9)。此外，上述结论也被dls结果所证实，它表明在修饰前后，颗粒大小有明显的变化(图10)。另一个方面，nb-avi和sa@qds的结合产物在zeta电位和dls结果上与独立的两个相比显示出明显的变化。修饰对qds的激发和发射波长的影响可以忽略不计(图11)。因此，基于nb81c的探针被制备为nb-avi/sa@qds。
[0075]
实施例4nq&sc-lfia的优化以及nq&sc-lfia的敏感度和特异性实验
[0076]
nq&sc-lfia建立了竞争性反应，nb-avi/sa@qds探针和afb1小分子溶液在防光ep管中室温下振动孵育10分钟。然后将ep管中的反应液加入到试纸的样品垫中，在室温下运
行15分钟。nb-avi/sa@qds探针与afb1反应形成免疫复合物，afb1浓度越高，形成的免疫复合物越多，因此只有较少的探针被t线捕获，这时的荧光强度较低。然后，c线的avi-bsa捕获了剩余的探针。当t线和c线的荧光强度稳定后，用智能手机在435纳米的激发波长下进行拍照记录。建立了一个基于智能手机的灰度读出系统，具有快速、方便、灵敏和无仪器的特点，根据视觉可视效果定性分析和灰度值定量分析两种信号读出进行比较。用智能手机拍照得到t线和c线灰度结果(g
t
和gc)，nq&sc-lfia的结果显示g
t0
和g
c0
，表示afb1的浓度是0ng
·
ml-1
。g
t/c
/g
t0/c0
的比值(δg)，用于nq&sc-lfia的优化和afb1的定量检测。结果可以用肉眼进行定性检测。对于定量检测，通过灰度比较分析t线和c线的照片。通过将δg与afb1浓度的共同对数(10-5-2.5-1.25-0.625-0.15625-0.078125-0)作图建立标准曲线。通过在5ng
·
ml-1
的浓度下测试4种结构类似物和4种功能类似物，研究了nq&sc-lfia的特异性。
[0077]
1.nq&sc-lfia的优化
[0078]
优化是提高试纸条分析性能的关键。在本试纸条中，nq&sc-lfia的分析性能通过t线上的afb1-bsa浓度(0.3,0.6,0.9mg
·
ml-1
)，三种不同发射波长的qds(em,525nm,585nm,605nm)，afb1分子稀释缓冲液的甲醇含量(10％,30％,50％,70％,v/v)，上样缓冲液(ph＝2.0,4.0,6.0,8.0,10.0；tween-20的浓度，0.1％,0.25％,0.5％,1.0％,2.0％,v/v)体现。
[0079]
nb-avi的用量和比例一直被认为是与探针耦合的关键因素，纯化的nb-avi(20μg
·
ml-1
)的浓度由bca蛋白定量法确定，每个检测体系的最终nb-avi剂量被确定为10ng。在2ng
·
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afb1分子作为对照的情况下，研究了qds和t线中afb1-bsa浓度的影响。t线中afb1-bsa的浓度为0.3,0.6,0.9mg
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；三种qds的发射波长分别为525nm(图12)，585nm(图13)，605nm(图14)。在0.6mg
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afb1-bsa和585nmqds下，计算出δg为0.462，这个读数相对较低且稳定，这意味着nq&sc-lfia在这些条件下表现出最好的灵敏度(图13)，因此，在此基础上进一步研究。虽然δg(0.423)在0.3mg
·
ml-1
afb1-bsa时最低，但从肉眼进行的定性测验来看，视觉效果不好，因此后优化条件为0.6mg
·
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afb1-bsa和585nmqds。
[0080]
上样缓冲液的组成和浓度也是影响δg的关键因素。本发明还研究了afb1分子溶液的甲醇浓度的影响。图15显示，当pbs中的甲醇浓度为30％(v/v)时，δg在2ng
·
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afb1分子条件下达到最低值，并保持相对稳定。当pbs中的甲醇浓度为70％(v/v)时，仍然表现出稳定的分析性能。然后使用不同ph值的缓冲液(ph值＝2.0，4.0，6.0，8.0，10.0)来提高1ng
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afb1分子条件下的分析性能。正如图16中所示，δg随ph值(2.0-6.0)降低，直到ph值达到6.0，并随ph值(6.0-10.0)增加。随后在1ng
·
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afb1分子条件下，也分析了一系列浓度的tween-20(0.1％、0.25％、0.5％、1.0％和2.0％，v/v)的缓冲液，图17显示，在低浓度的tween-20下，t线的可见荧光强度和灰度值较高，但nq&sc-lfia的灵敏度没有明显提高；相反，在1.0％的tween-20下达到最佳分析性能。综上所述，通过探索优化分析条件，成功开发了一种简便易行、灵敏度高的afb1的nq&sc-lfia。
[0081]
2.nq&sc-lfia的敏感度和特异性实验
[0082]
定量检测结果表明，nq&sc-lfia在最佳条件下能够敏感地分析afb1。通过肉眼定性分析和定量灰度对比检测，对不同浓度的afb1进行了分析。上样缓冲液被优化为1％蔗糖+0.5％bsa+1％peg4000+1％tween-20在pb缓冲液(0.05m，ph＝6)中的混合物。图18显示了δg与afb1浓度之间的关系，本发明的方法对afb1的检测具有良好的线性，从0.195ng
·
ml-1
到4.370ng
·
ml-1
，lod为0.106ng
·
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，ic
50
为0.86ng
·
ml-1
，1.25ng
·
ml-1
可以用肉眼定性
分析(图19的a，灰度结果显示在图20)。此外，特异性也是nq&sc-lfia的一个关键分析性能，它被几种霉菌毒素(5ng
·
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)扰乱，包括黄曲霉毒素b2(afb2)。黄曲霉毒素g1(afg1)、黄曲霉毒素g2(afg2)、黄曲霉毒素m1(afm1)、伏马毒素b1(fb1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、玉米赤霉烯酮(zen)和单端孢霉烯-2(t2)。图19的b显示，与其他霉菌毒素触发的荧光视觉强度相比，afb1产生的信号强度几乎接近于背景信号。因此，与功能类似物fb1、don、zen、t2没有交叉反应，与afb1的结构类似物afb2、afg1、afg2、afm1交叉反应很低。
[0083]
实施例6稳定性实验
[0084]
nq&sc-lfia的稳定性是通过加速老化实验验证的。本发明采用基于arrhenius方程的加速老化实验来证明，阿伦尼乌斯方程是一个经验公式，表达了化学反应速率常数(k)对温度(t)的依赖性。eα表示表观活化能(≈19.5kcal/mol)，r是摩尔气体常数。总的趋势是，t增加，k也增加，这样就可以计算出温度和老化天数之间的关系。经计算，50℃下23天相当于室温(25℃)下一年的时间。将准备好的试纸条放在恒温箱(50℃)中分别7天、15天和23天，验证了其分析性能。所有的实验都进行了5次。基于纳米抗体和mab的试纸条在各种条件下进行了比较，包括甲醇的运行缓冲液浓度(10％，30％，50％，70％，v/v)，nacl的运行缓冲液浓度(0，100，200，500，800mm)，以及测试环境温度(4℃，16℃，32℃，40℃)。
[0085]
结果如图21所示，图21中的a显示，纳米抗体试纸条显示出很高的甲醇耐受性，当甲醇浓度高于30％时，基于mab的探针几乎不能固定在测试条的t线上，但基于nb的探针几乎不受影响。图21中的b显示，纳米抗体试纸条在100mm到500mm之间表现出更好的盐浓度耐受性，当nacl浓度高于500mm时，nb基探针的结合活性急剧下降，在800mm时表现出低于mab基探针的活性，这一现象与ielisa的结果一致。与mab条相比，基于纳米抗体的试纸条显示出更好的温度耐受性，从4℃到40℃，基于nb的探针几乎不受检测环境温度的影响，在低温下仍显示出良好的结合活性，但mab在这种条件下几乎没有发挥作用(图21中的c)。本发明还发现基于纳米抗体的探针可以在低温环境下正常工作，这说明基于纳米抗体的探针可以直接使用，而不需要预孵化到室温，这对基于纳米抗体的探针来说是必不可少的。上述结果表明，在样品基质复杂和测试环境条件不理想的情况下，基于纳米抗体的条带将有更好的应用潜力。最后，为了评估我们的试纸条的稳定性，在50℃的恒温箱中并分别储存7、15和23天后，结果如图21中的d所示，即使在50℃下保存23天，试纸条仍显示出完美的性能，根据arrhenius方程，这些试纸条可以在室温下保存一年，这些都表明基于纳米抗体的试纸条在实际应用中具有很大的潜力。
[0086]
实施例7nq&sc-lfia在实际样品中的实际应用
[0087]
为了证明我们的方法在真实样品中的分析性能，对燕麦中的afb1进行了定量检测。首先，必须消除基质效应，因为真实样品提取物的成分复杂，而且许多农作物样品中存在生物素，这可能会影响nq&sc-lfia的功效。生物素微溶于水和乙醇，不溶于其他有机溶剂，所以考虑使用纯甲醇。
[0088]
在阴性燕麦样品中添加多种浓度的afb1溶液，得到添加afb1的实际样品。首先分别将1g带有不同浓度afb1(20ng、10ng和5ng)的燕麦样品溶解在4ml甲醇中，将样品充分混合15分钟，将混合物以8000rpm离心10分钟。随后，收集上清液，用pbs稀释4倍，以12000rpm离心10分钟，收集提取物并用于研究，afb1在燕麦样品中的最终浓度分别为20、10、5μg
·
kg-1
，在提取物中的浓度分别为1.25、0.625、0.3125ng
·
ml-1
。三种afb1浓度的提取物以nq&
sc-lfia进行检测，5组重复实验，计算回收率，回收率＝测定afb1浓度/添加afb1浓度
×
100。结果如表3所示。
[0089]
表3
[0090][0091]
表3数据显示nq&sc-lfia在检测燕麦样品稀释液中的afb1实际应用中具有很好的效果，回收率在88.8％-116.7％之间。这表明，nq&sc-lfia作为一种高灵敏度的分析方法，在实际样品中分析afb1有很大的潜力。
[0092]
综上所述，我们首次成功开发了基于纳米抗体的智能手机辅助侧流免疫分析试纸条(nq&sc-lfia)，实现了对afb1的高灵敏度和便捷性检测。avi/sa偶联策略解决了nb的活性受纳米材料随机修饰影响的缺陷。除了lfia操作简便、节省时间的优点外，还可以通过智能手机拍照进行数据分析，实现现场检测，无需仪器。同时，与mab相比，由于nb的热稳定性和对复杂分析环境的耐受性，保证了我们方法的稳定性和抗干扰能力。真实的样品分析也得到了验证，回收率在88.8％-116.7％之间，是实现现场检测的有效方法。同时，avi/sa耦合策略在其他纳米体应用中也具有广泛的应用前景。因此，本发明不仅为afb1监测提供了一个稳定、高效的现场检测仪器，而且为nb应用的发展起到了一定的推动作用。
[0093]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于检测黄曲霉毒素b1的侧流免疫分析试剂盒，其特征在于，包括：纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针和侧流免疫分析试纸条，所述侧流免疫分析试纸条的硝酸纤维素膜上设置有t线和c线，所述t线上涂有afb1-bsa抗原，所述c线上涂有生物素标记的牛血清蛋白。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针由纳米抗体-生物素与链霉亲和素@量子点通过生物素和链霉亲和素的定向偶联策略结合生成；所述纳米抗体-生物素的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述链霉亲和素@量子点由链霉亲和素修饰到cooh-qds上获得。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素@量子点的制备方法包括以下步骤：将cooh-qds加入到硼酸缓冲液中，再加入edc和nhs，37℃垂直培养60分钟，加入链霉亲和素，25℃涡旋60分钟，加入2-巯基乙醇孵育30分钟，离心取沉淀，获得链霉亲和素@量子点。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述离心取沉淀后还包括以硼酸盐缓冲液洗涤沉淀的步骤，洗涤2次。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述cooh-qds的发射波长为585nm。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述afb1-bsa抗原的浓度为0.6mg
·
ml-1
。7.一种检测黄曲霉毒素b1的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1中的纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针与黄曲霉毒素b1分子溶液在室温防光条件下振动孵育10分钟，然后加入到权利要求1中的侧流免疫分析试纸条的样品垫中，室温下反应15分钟，当t线和c线的荧光强度稳定后，读取t线和c线的灰度结果；(2)根据t线和c线的灰度结果，建立标准曲线；(3)采用步骤(1)相同的方法结合步骤(2)所得标准曲线，获取待测样品中黄曲霉毒素b1的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述黄曲霉毒素b1分子溶液的浓度为1
×
10
0-1
×
10
10
ng
·
ml-1
。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，当t线和c线的荧光强度稳定后，用智能手机在435纳米的激发波长下进行拍照记录，读取t线和c线的灰度结果。10.如权利要求1-6任一项所述的试剂盒在检测食品中黄曲霉毒素b1中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于检测黄曲霉毒素B1的侧流免疫分析试剂盒及方法，属于侧向免疫分析技术领域。该试剂盒包括纳米抗体-生物素/链霉亲和素@量子点探针和侧流免疫分析试纸条，所述侧流免疫分析试纸条的硝酸纤维素膜上设置有T线和C线，所述T线上涂有AFB1-BSA抗原，所述C线上涂有生物素标记的牛血清蛋白。本发明的定向偶联策略可以克服随机修饰导致纳米抗体活性降低的缺陷，极大地保留纳米抗体的活性。利用智能手机摄影作为灰度读数，具有快速、准确、稳定、无仪器的现场分析等特点，具有广泛推广空间，极具市场前景。极具市场前景。极具市场前景。


技术研发人员：孙铁强 王锋 王新阳 张予弦 虞立霞 姚站馨
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/10/6