一种高地芽孢杆菌BacillusaltitudinisQ7的应用

一种高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7的应用
技术领域
1.本发明涉及一种高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7的应用，具体涉及一种高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7在生物合成环脂肽以及抑制病原菌方面的应用。


背景技术：

2.脂肽也被称为脂酰肽，是一类由氨基酸衍生的低分子量抗菌肽，同时也是重要的生物表面活性剂，脂肽主要通过微生物的非核糖体合成途径和聚酮杂合途径生物合成。天然脂肽的来源广泛，目前主要来源于微生物，其中又以细菌来源为主。随着研究的不断深入，脂肽已从许多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、革兰氏可变菌属以及多种真菌中分离发现。脂肽是一类结构中包含极性和非极性两部分的双亲分子，极性部分是环状肽，而非极性部分是具有不同长度和氧化程度的直链或支链脂肪酸。其独特的分子结构使脂肽不但具有抗菌功能，同时还是一种优良的表面活性剂。
3.脂肽的发现及研究最早可以追溯到上世纪七十年代后期。1968年，arima等人报道首次在bacillus subtilis菌株发酵液中发现了一种脂肽结晶表面活性剂，并命名为表面活性素。尽管已发现此类物质具有表面活性剂特性并且在医学或生物工程中具有应用潜力，但由于技术和认知限制，并未得到足够的重视。直到1980年，脂肽有可能被用来替代化学合成的表面活性剂来解决生态问题时，人们才逐渐增加对脂肽的关注。随着研究的不断深入，脂肽在环境修复、石油开采、生物医药、农业生产、食品加工等方面的应用潜力逐渐显露，如何借助现代生物技术对脂肽进行大规模工业化生产成为了脂肽研究领域的核心问题之一。
4.大量研究证实脂肽是通过非核糖体肽合成酶或杂合聚酮化合物合成酶途径合成的，它们本质上是包含多个结构域的大型蛋白质迭代功能单元(模块)。这些模块化蛋白质负责数百种生物活性化合物的生物合成，是可催化聚酮化或肽转化反应的巨型酶。而大多数已经发现的非核糖体肽合成酶存在于细菌门中，如变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和蓝细菌门。另外，还在多种菌门中发现能够合成非核糖体肽的遗传机制，包括异常球菌－栖热菌门、绿菌门、疣微菌门和芽单孢菌门。对非核糖体肽合成操纵子的生物信息学分析，可以揭示脂肽同系物在合成过程中的细节差异。综合现代生物技术，如同系物建模、序列比对、生物合成相结合的方法对非核糖体肽合成酶进行定向差异改造，从而实现合成产物的预测、合成途径精确可控、合成产率快速提高。
5.内生菌是定殖于植物组织细胞空间，对植物不产生任何不利或病理影响的微生物。内生菌可通过增强自身生长、适应性以及对非生物或生物胁迫的耐受性，促进次生代谢产物的积累，是一类积累代谢产物的重要生物反应器，具有大规模生产潜力。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于，克服现有的生物表面活性剂制备工艺组中存在的成本高、工艺复杂的缺陷，提供一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法。本发明提供一种高地芽
孢杆菌bacillus altitudinis q7在生物合成脂肽类生物表面活性剂中的应用，并提供了此生物表面活性剂在抑制病原菌方面的功效。
7.本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
8.本发明提供了一种高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7的应用，所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7菌种保藏号为cctcc no：m 20221567，保藏日期为2022年10月14日；所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7发酵物在抑制病原菌中的应用。
9.进一步地，上述技术方案中，所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7发酵物为环脂肽，所述环脂肽由赖氨酸溶酶、表面活性素、假因子ⅰ和假因子ⅱ组成。
10.进一步地，上述技术方案中，所述赖氨酸溶酶的肽链由谷氨酰胺(gln)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、天门冬氨酸(asp)和缬氨酸(val)构成；所述表面活性素的肽链部分由谷氨酸(glu)、亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)和天门冬氨酸(asp)构成；所述假因子ⅰ的肽链部分由甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、亮氨酸(leu)和缬氨酸(val)构成；所述假因子ⅱ的肽链部分由甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)和亮氨酸(leu)构成。
11.进一步地，上述技术方案中，所述病原菌包括细菌和真菌。
12.进一步地，上述技术方案中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、八叠球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的一种或两种以上；所述真菌包括链格孢霉菌或灰葡萄孢霉菌中的一种或两种。
13.进一步地，上述技术方案中，所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7发酵物的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7菌种种子液发酵培养；
15.(2)发酵液脂肽粗提取；
16.(3)脂肽纯化。
17.进一步地，上述技术方案中，所述发酵培养的条件为：发酵温度31
±
3℃，通气量1.5～2l/min，搅拌转速200～300rpm，发酵ph 6.0～7.5，发酵时间68～75h。
18.进一步地，上述技术方案中，所述发酵液脂肽粗提取的方法包括：发酵液离心去除微生物细胞，用5.5～6.5mol/l盐酸溶液将无细胞滤液调至ph 1.5～2.3，静置于4
±
3℃中12～16h；离心回收沉淀；收集的沉淀用ph 1.9～2.2的酸化水清洗后风干，用无水甲醇从沉淀物中萃取生物表面活性剂，去除溶剂。
19.进一步地，上述技术方案中，所述脂肽纯化的方法包括：采用大孔树脂进行纯化。
20.本发明的有益效果是：本发明中bacillus altitudinis q7是分离于银杏叶的细菌，胁迫耐受性强，培养周期短。本发明利用bacillus altitudinis q7发酵制备脂肽类生物表面活性剂的成本较低，操作简单，生产周期短，具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
附图说明
21.图1为bacillus altitudinis q7脂肽的lc-ms图谱。a为lc-ms总离子流色谱图；b为保留时间为3.38分钟的离子峰图；c为保留时间为3.59分钟的离子峰图；d为保留时间为4.19分钟的离子峰图；e为保留时间为4.49分钟的离子峰图。
22.图2为脂肽中脂肪酸甲酯的总离子流色谱图(a)和氨基酸衍生物的总离子流色谱
图(b)。
23.图3为脂肪酸甲酯质谱图(a-c)和氨基酸硅烷衍生物质谱图(d-l)。
具体实施方式
24.下面具体实施例将对本发明的技术方案进行完整、详细地描述，但本发明不限于此。以下实施例仅作为示例说明本发明的技术方案，所以不以任何方式限制本发明。
25.实施例1
26.本发明所述高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7分离于银杏叶。
27.所述高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7革兰氏染色呈阴性，菌体形态呈杆状。平板培养菌落形态呈规则圆点，表面光滑，较透明。生理生化实验中，q7对淀粉和油脂的水解能力弱，石蕊牛乳颜色变暗，发酵液呈偏碱性，且不能使明胶液化。api 50ch实验结果onpg(+)、vp(-)、aescin(+)、salicin(-)、sucrose(+)、rhammnose(+)、citrate(-)、urease(-)、thiamine vinegar(-)、lactose(-)、aceculin(-)、hippurate hydrolysis(+)、maltose(-)、raffinose(+)、d-arabia sugar(+)、l-arabia sugar(+)trisaccharide iron(-)、inulin(+)melezitose(+)等。结合16s rrna鉴定及系统发育分析，所述银杏内生菌q7为高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7。
28.所述高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7的序列如seq id no.1所示。
29.所述高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)q7的菌种保藏号为cctcc no：m 20221567，保藏日期为2022年10月14日，分类命名为高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)，菌株名称为q7。
30.取保存于4℃菌种柜中的高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7进行活化处理，用接种环刮取一环菌落接种于盛放活化培养基(蛋白胨(10mg/ml)，牛肉膏(5mg/ml)，葡萄糖(5mg/ml)，氯化钠(5mg/ml)，ph为7.3)中。在28℃恒温摇床中160rpm活化24h；活化培养物以体积计2％的接种量接种于摇瓶中(摇瓶培养基为：蛋白胨(10g/l)，牛肉膏(5g/l)，葡萄糖(5g/l)，氯化钠(5g/l)，ph为7.2)预培养16h，在超净台中用灭菌的摇瓶培养基将种子液od
600
调整到0.8左右。将上述制得的种子液接种到发酵罐(发酵罐中培养基为：葡萄糖(10g/l)，大豆蛋白胨(10g/l)，牛肉膏(5g/l)，氯化钠(5g/l)，ph为7.0)中，接种量为体积计3％。调节发酵温度31℃，通气量1.5l/min，搅拌转速200rpm，发酵ph 6.6，发酵72h。
31.然后将上述发酵液以8000rpm离心15min，以去除微生物细胞。用6mol/l盐酸溶液将无细胞滤液调至ph 2.0，静置于4℃冰箱中过夜。在高速离心机中以12000rpm的转速离心20min以回收沉淀。收集的沉淀用ph为2.0的酸化水清洗两遍后风干。用无水甲醇从沉淀物中萃取生物表面活性剂(粗脂肽)，经旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干得到脂肽类生物表面活性剂。
32.然后使用x-5大孔树脂进行脂肽纯化。使用蠕动泵将10ml浓度为50mg/ml的粗脂肽无水甲醇溶液上样，去离子水平衡树脂柱至流出液无醇味，使用80％的乙醇水溶液以1ml/min的流速进行匀速洗脱，通过dbs-100自动收集器以每5min收集一管测试液的频率收集洗脱液，洗脱液经浓缩、冻干后保存于-20℃。
33.实施例2
34.使用设备为waters acquity h-class sqd2超高压液相色谱质谱联用仪。样品浓度为4mg/ml，液相系统的进样量为2μl，对脂肽样品进行液相分离使用的洗脱相为乙腈和水(体积比90：10)，柱温设定为35℃，洗脱时间为10min，使用acquity uplcr beh c18反相色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm)，流速设定为0.4ml/min。搭配dad检测器，检测波长设置为210nm。使用sqd2质谱仪进行电喷雾电离(esi)，在全扫描模式下分析电离组分的质量，扫描范围设定为50～1500m/z。得到纯化后的脂肽。
35.bacillus altitudinis q7脂肽通过lc-ms分析，可观察出样品主要出峰时间在2.94min之后；保留时间为3.38分钟、3.59分钟、4.19分钟和4.49分钟的假分子离子峰m/z为1035.3、1049.4、1063.2和1077.3，分别对应脂肪酸链含15个c的lichenysin a、脂肪酸链含16个c的surfactin、脂肪酸链含16个c的pseudofactin i和脂肪酸链含16个c的pseudofactin ii(图1)。图1中a为lc-ms总离子流色谱图；b为保留时间为3.38分钟的离子峰图；c为保留时间为3.59分钟的离子峰图；d为保留时间为4.19分钟的离子峰图；e为保留时间为4.49分钟的离子峰图。
36.实施例3
37.称取纯化后的脂肽50mg，转移至20ml安瓿瓶中，加入5.0ml浓度为6.0mol/l的盐酸溶液，使用酒精喷灯将瓶口熔烧密封，置于90℃烘箱中恒温水解24h。将水解液中加入15.0ml去离子水进行稀释，随即加入5.0ml无水乙醚萃取脂肪酸，连续萃取3次，将3次萃取的有机相合并，然后在通风橱内挥发乙醚，得到的提取物便是脂肽样品中的脂肪酸组分。
38.向无水乙醚提取物中加入5.0ml浓度为10％的硫酸/甲醇溶液，于烘箱中55℃恒温反应6h进行脂肪酸甲酯化处理，反应结束后并冷却至室温，加入15.0ml去离子水稀释，稀释液中加入3.0ml无水乙醚萃取，连续萃取3次，将有机相合并，挥发有机溶剂，得到脂肪酸甲酯，加入2.0ml甲醇超声溶解，转移至gc-ms进样瓶中，使用scion 456-gc-sq型气相色谱-质谱联用仪进行，气相色谱柱采用scion-5ms石英毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。使用高纯度氦气(99.999％)作为载气，进样口温度设定为250℃，流速1ml/min，不分流，采用自动进样方式，进样量1.0μl；柱温箱参数设定为：初温120℃，保持3min，然后以10℃/min的升温速率升至260℃，保持5min；质谱检测参数：溶剂延迟3min，采用全扫描正离子模式，扫描时间200ms，扫描范围m/z 45-500，离子源温度230℃，电离电压70ev。
39.酸解后的脂肽进行氨基酸分析。将酸水解后的反应液移入气相进样瓶中，吹干后放置于烘箱内105℃烘干2h，确保除尽水分，加入1.5ml乙腈，混匀后再加入1.0ml bstfa试剂，密封后置于60℃烘箱恒温20min进行硅烷化反应。反应结束后，使用自动进样器进样检测脂肽中的氨基酸组分。柱温箱参数设定为：初温60℃，保持3min，然后以10℃/min的升温速率升至250℃，保持5min。
40.为了验证脂肽混合物的组成成分，对脂肽水解液进行了gc-ms分析，脂肽与盐酸高温水解生成的游离氨基酸与bstfa试剂反应生成氨基酸硅烷衍生物，通过gc-ms检测得到氨基酸硅烷衍生物的总离子图谱(图2)。在10-20min范围内出现9个离子峰，分别命名为峰a～i。根据检测系统自带nist质谱图数据库检索结果，保留时间为10.9min(峰a)，11.8min(峰b)，12.3min(峰c)，13.1min(峰d)，13.3min(峰e)，14.4min(峰f)，15.3min(峰g)，16.2min(峰h)和17.1min(峰i)的9个离子峰分别对应异亮氨酸(ile)，缬氨酸(val)，亮氨酸(leu)，天门冬氨酸(asp)，甘氨酸(gly)，谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)，丝氨酸(ser)和苏氨酸
(thr)的硅烷化衍生物(图3)。
41.实施例4
42.采用纸片琼脂扩散法对实施例1得到的表面活性剂(粗脂肽)的抗菌活性进行初步评估，选择常见的致病细菌金黄色葡萄球菌、八叠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和致病真菌链格孢霉菌、灰葡萄孢霉菌作为病原菌。将粗脂肽溶解在0.01mol/l的pbs缓冲液中至浓度为200mg/l，将直径6mm的纸片浸泡在脂肽溶液中，然后放置于涂有100μl致病菌菌悬液的肉汤平板(细菌)或涂有100μl孢子悬液的pda平板(真菌)中，此外，阴性对照采用0.01mol/l的pbs缓冲液，阳性对照使用200mg/l的链霉素。最后，在放置纸片后，微生物平板在37℃培养24h。培养后，通过圆盘周围抑制区的直径来评估抑制活性，并进行三次重复。
43.通过测定抑菌圈直径测定粗脂肽对5种细菌和2种真菌的抑制活性(表1)。bacillus altitudinis q7产生的脂肽对常见致病微生物具有广谱抗菌性，对细菌表现出一定的抑制作用，但显著低于对真菌的抑制能力。与阳性对照链霉素相比，脂肽对细菌的抑制作用偏弱。在本研究使用的两种常见农作物病原真菌中，链格孢霉菌对bacillus altitudinis q7脂肽更加敏感。在200mg/l的浓度下，抑菌圈直径为43.2
±
0.35mm。总的来说，bacillus altitudinis q7产生的脂肽对真菌的抑制活性明显优于链霉素，且对链格孢霉菌具有极佳的抗菌活性，可作为生物防治剂应用于农业生产，具有较强的应用潜力。
44.表1b.altitudinis q7脂肽的抗菌活性
[0045][0046]
表1中，不同字母表示差异显著性(p＜0.05，duncan检验)，表中数值为3次重复平均值(n＝3).
[0047]
以上实施例对本发明进行了详细的说明。对于任何熟悉本专业的普通技术人员来说，在不脱离本发明的，在不脱离本发明技术方案内容的情况下，可以对本发明的实施例进行些许修改，或替换为等同效应的实施例实施本发明。但这些修饰凡是未脱离本发明的技术原理，均应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7的应用，其特征在于，所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7菌种保藏号为cctcc no：m 20221567，保藏日期为2022年10月14日；所述高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7发酵物在抑制病原菌中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高地芽孢杆菌bacillusaltitudinis q7发酵物为环脂肽，所述环脂肽由赖氨酸溶酶、表面活性素、假因子ⅰ和假因子ⅱ组成。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述赖氨酸溶酶的肽链由谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸和缬氨酸构成；所述表面活性素的肽链部分由谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸和天门冬氨酸构成；所述假因子ⅰ的肽链部分由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸构成；所述假因子ⅱ的肽链部分由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和亮氨酸构成。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括细菌和真菌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、八叠球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的一种或两种以上；所述真菌包括链格孢霉菌或灰葡萄孢霉菌中的一种或两种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高地芽孢杆菌bacillusaltitudinis q7发酵物的制备方法，包括如下步骤：(1)高地芽孢杆菌bacillus altitudinis q7菌种种子液发酵培养；(2)发酵液脂肽粗提取；(3)脂肽纯化。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的条件为：发酵温度31
±
2℃，通气量1.5～2l/min，搅拌转速200～300rpm，发酵ph 6.3～7.0，发酵时间70～75h。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵液脂肽粗提取的方法包括：发酵液离心去除微生物细胞，用5.8～6.4mol/l盐酸溶液将无细胞滤液调至ph 1.9～2.2，静置于4
±
2℃中12～16h；离心回收沉淀；收集的沉淀用ph为1.9～2.2的酸化水清洗后风干，用无水甲醇从沉淀物中萃取生物表面活性剂，去除溶剂。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脂肽纯化的方法包括：采用大孔树脂进行纯化。

技术总结
本发明公开了一种高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis Q7的应用。所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis Q7发酵物在抑制病原菌中的应用。所述的发酵物的制备方法包括下列步骤：(1)高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis Q7菌种种子液的制备；(2)发酵培养；(3)发酵液脂肽粗提取；(4)脂肽纯化。本发明的制备方法成本较低，操作简单，生产周期短。制备得到的环脂肽类生物表面活性剂对多种病原细菌具有抑制作用。用。


技术研发人员：叶淑红 李子龙 杨丰瑞 王静
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/10/6