向听觉细胞递送DNA的方法、载体及制取方法和应用

向听觉细胞递送dna的方法、载体及制取方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种生物材料的递送方法，尤其是涉及一种向听觉细胞高效递送dna的方法，以及递送的载体和制取方法。


背景技术：

2.听觉是人体最重要的感觉器官之一，在人们工作和生活的各个方面都扮演着不可或缺的角色。先天性基因突变、遗传性缺陷、噪音环境以及老龄化等因素均会导致不同程度的听力损失，甚至完全丧失(ann intern med.2020dec1；173(11)：itc81-itc96)。听觉损失主要表现为负责机械信号转换为电信号的毛细胞，以及把电信号传递给大脑皮层的螺旋神经节细胞的损伤(int j mol sci.2021 may 26；22(11)：5647)。然而，哺乳动物毛细胞和螺旋神经节细胞损伤后无自主修复能力(adv exp med biol.2019；1130：1-16)。因此，听觉损失也就成为不可逆转的永久性损失。
3.近年来，随着基因编辑crispr-cas9技术和干细胞再生治疗的革命性进展，导入听觉突变基因和诱导新生鼠听觉毛细胞损伤后再生已成为可能(nature.2018jan 11；553(7687)：217-221)。目前，已报道的有效基因治疗载体仍然是以腺病毒载体为代表的病毒载体，注射途径以耳蜗内注射或半规管注射为主。腺病毒载体存在不可预测的毒副作用(j korean med sci.2021may 3；36(17)：e115)，且耳蜗内注射创伤性大，患者顺应性差等缺陷。以脂质体代表的非病毒载体是基因治疗另一可供选择的，安全性较高的载体类型(nat rev genet.2014aug；15(8)：541-55)。该载体的缺陷在于听觉细胞转染效率较低，难以实现目标基因敲除或高表达的需求。为进一步实现听力重建从基础研究到临床转化的飞跃，安全有效的基因治疗载体开发至关重要。
4.根据waston-crick碱基互补配对原则自组装形成的dna纳米结构(dna nanostructure)作为药物递送载体引起广泛关注。dna是一种携带生物遗传信息的线性聚合物。作为重要的遗传信息载体，是人类探寻生命密码的钥匙。dna纳米结构作为药物递送载体的优势表现为以下几方面(chem rev.2019may 22；119(10)：6459-6506)：1)dna纳米结构良好的生物相容性。作为体内编码遗传信息的天然分子，许多研究结果均证明了dna纳米结构相较于人工合成材料具有更好的生物相容性与生物可降解性；2)dna纳米结构可编程性。通过调控合成单链的碱基长度与碱基序列，dna纳米结构可以精准地设计成不同大小、不同形貌的纳米结构，这使得针对不同的细胞设计并筛选出最适合继续药物递送的dna纳米结构成为了可能。此外，修饰的小分子也可以精准的定位于dna纳米结构的不同位置，这将赋予了dna纳米结构靶向输送的性能；3)dna纳米结构易修饰。dna单体可以修饰不同的药物分子，dna纳米结构可以将不同的小分子通过各类亲和关系等修饰。
5.通过研究不同粒径大小与空间结构的dna纳米结构，如：dna正四面体(tdn)探索了dna纳米结构用于内耳药物递送的可行性(nanoscale 2022，14：8000-8011)。利用表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)与双链dna的非共价相互作用，制得了一种新型的内耳药物递送系统(egcg@tdn)。该递送系统不仅具有制备方法简单、生物相容性高、穿透圆窗膜效率快等
优势，还能够有效地对抗噪音引起的内耳脂质过氧化损伤，最终改善听力功能。
6.尽管tdns携带小分子化学药物egcg展现出逆转噪音性聋药理学活性。然而，作为基因载体，tdns在听觉细胞(如：hei-oc1细胞系)摄取效率远远达不到药效需求。cy5标记的tdn在肿瘤细胞系，人胚胎肾细胞系hek293和小鼠来源神经瘤母细胞n2a细胞摄取效率分别是听觉细胞系(如：hei-oc1细胞系)的细胞摄取效率的2.5和3倍。tdn修饰穿膜肽tat多肽后，其细胞摄取效率与未修饰多肽组相比，细胞摄取效率仍无显著性提高。然而，载体的细胞摄取效率则是发挥其药效的决定性因素(adv drug deliv rev.2019mar 15；143：68-96)。因此，提高tdns听觉细胞的细胞摄取效率的方法和策略至关重要。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的在于提供一种向听觉细胞递送dna的方法，以提高tdns的听觉细胞摄取效率。
8.本发明的另一个目的在于提供一种递送载体，用于向听觉细胞递送活性分子，利于改善听觉的治疗。
9.本发明的再一个目的在于提供一种方法以制取含有dna的载体，以利于对听觉细胞高效递送活性分子。
10.本发明的又一个目的在于提供一种载体在制备治疗听觉损失的药物中的应用。
11.一种向听觉细胞递送dna的方法，tdn分散于胶原蛋白溶液中，而使tdn负载于胶原蛋白上，降低tdn的电位，以此提高听觉细胞对dna的摄取效率。
12.采用本发明的上述方法制得的颗粒，记为：tdn@gnp。经粒径检测分析仪(dls)测得的粒径为：313.5
±
4.2nm，与胶原蛋白颗粒相比，tdn@gnp颗粒未见显著区别。另测得的电位为18.9
±
1.2mv，与胶原蛋白颗粒测得27.9
±
0.9mv电位相比，tdn@gnp颗粒的电位显著下降。
13.将tdn@gnp与听觉细胞系hei-oc1共孵育后，细胞内摄取效率显著提高，并与孵育时间正相关，即随着与细胞系孵育时间的延长，细胞内摄取的tdn越多。因此，当tdn@gnp载以活性分子时，比如：egcg，细胞内活性分子浓度亦将显著提高，还显著抵抗了药物分子产生细胞毒性，产生了更强的抵抗细胞毒性的药效。
14.一种递送载体，其呈颗粒状，粒径为313.5
±
4.2nm，包括tdn和胶原蛋白，tdn负载于胶原蛋白上，载体的电位为18.9
±
1.2mv。
15.本发明的递送载体，tdn和胶原蛋白重量比小于1∶400，比如：1∶450～1∶500，尤其是：1∶460、1∶470、1∶480或1∶490。
16.将活性分子在于递送载体上，能显著提高向听觉细胞内递送活性分子的效率，提高药效的发挥。
17.本发明提供的递送载体制备方法如下：
18.先在碱性(如：ph8.6
±
0.5)的明胶溶液(如：1.25wt％)中加入tdn于40℃震荡孵育28分钟
±
5分钟，制得含tdn的明胶溶液；
19.然后，将含tdn的明胶溶液滴加入乳化剂(如：泊洛沙姆)浓度为7％的95％～97％乙醇或丙酮中，于31℃
±
3℃混匀，滴加过程中同时搅拌(如：800
±
20rpm)；
20.10分钟后，滴加2v/v％戊二醛240μl，室温搅拌10小时以上，搅拌速率如：300rpm；
21.最后，离心，取沉淀即得。
22.使用期间，可将离心得到的沉淀加水，于4℃水浴中超声吹打重悬。
23.在制备本发明的递送载体时，tdn和胶原蛋白重量比小于1∶400，比如：
24.在制备本发明的递送载体时，以明胶的重量计算所用戊二醛的体积，即每2.6mg明胶需使用1μl戊二醛。每100μl含tdn的明胶溶液在10秒～45秒内滴加完毕，速率如：2秒/10μl、3秒/10μl或4秒/10μl等。
25.在制备本发明的递送载体时，乳化剂如：泊洛沙姆407和泊洛沙姆188等，优先选择泊洛沙姆407。
26.将活性分子，比如：egcg载于本发明制得递送载体后，因听觉细胞对递送载体的摄取效率提高，使得活性分子的递送效率也显著提高，进而增强了逆转遗传性耳聋、噪音性聋和药物性聋等药理学活性，有利于改善听觉损失的治疗。
27.由此，将活性分子与本发明提供的递送载体相组合，而获得用于治疗听觉损失的制剂。根据给药和制剂的需要，通常还与其它辅料相混合，制成可出售的制剂。
28.这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。
29.在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：tweeen-80、pluronic和poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、ph调节剂和止痛剂等。
30.用于填充剂的辅料如：但不限于淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等。这些辅料单独或组合应用于本发明。
31.用于粘合剂的辅料如：但不限于乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等。这些辅料单独或组合应用于本发明。
32.用于崩解剂的辅料如：但不限于干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠等。这些辅料单独或组合应用于本发明。
33.用于润滑剂的辅料如：但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等。这些辅料单独或组合应用于本发明。
34.用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂等。
35.各种辅料与化合物制成有利于给药(drug delivery)的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。
36.一种组合物，其包括egcg和tdn@gnp，egcg载于tdn@gnp上，以及药用辅料。
37.另一种组合物，用于抵抗活性分子的细胞毒性，包括egcg和tdn@gnp，egcg载于tdn@gnp上。
38.本发明上述提供的递送载体及其组合物作为内耳的药物递送系统，在制取治疗内耳疾病药物中的应用。
附图说明
39.图1为明胶纳米粒(gnp)和载tdns的明胶纳米粒(tdn@gnp)的理化特性表征图；其中，a为dls测得gnp粒径分布图；b为gnp的tem电镜图；c为dls测得的tdn@gnp粒径分布图；d为tdn@gnp的tem电镜图；e为gnp的电位图；f为tdn@gnp电位图；g为tdn@gnp经胰蛋白酶消化后有tdn凝胶电泳图；h为tdn和tdn@gnp在50％胎牛血清中稳定性评价-凝胶电泳图；i为gnp和tdn@gnp细胞安全性评价-cck-8实验结果图；
40.图2为tdn@gnp复合载体显著提高tdn在hei-oc1细胞系中摄取效率统计图，与cy5-tdn相比，***p＜0.001；
41.图3为不同复合载体在听觉细胞系hei-oc1中的摄取的统计图，与cy5-tdn@gnp相比，**p＜0.01；
42.图4为不同载体抗rsl3引起的细胞毒性；其中，a为多种浓度rsl3引起细胞毒性作用，b为多种egcg浓度对细胞活性的影响，c为多种载体抗rsl3引起细胞毒性作用。****p＜0.0001。
具体实施方式
43.以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
44.本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，所用的试剂均购自sigma-aldrich公司。
45.本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：
46.1)gnp制取
47.胶原蛋白1.25％+naoh调整ph约91ml 40℃；97％乙醇(或丙酮)10ml加0.7g泊洛沙姆搅拌，加热至31℃
±
3℃混匀；400rpm下滴加明胶溶液至乙醇(或丙酮)中，速率3秒/10μl；滴加结束10min后，滴加2％戊二醛240μl，室温300rpm速度下搅拌16小时；于4℃，10g离心15min，加双蒸水，外部超声机加冰水中吹打重悬即得gnp，用于参照实验。
48.2)制取tdn@gnp递送载体
49.tdn@gnp递送载体制备：tdn及cy5标记的tdn制备方法参考nanoscale 2022，14：8000-8011。ph9的1.25wt％明胶溶液中加入18μg tdn，于40℃震荡孵育28分钟
±
5分钟，制得含tdn的明胶溶液；400rpm下滴加前述制得的含tdn的明胶溶液至乙醇(或丙酮)中，速率3秒/10μl；滴加结束10min后，滴加2％戊二醛240μl，室温800rpm速度下搅拌12小时；于4℃，10g离心15min，加双蒸水，外部超声机在冰水中吹打重悬即得。
50.fitc标记方法：制备好的gnp或tdn@gnp用双蒸水重悬后，调节ph＝9，按纳米粒：
fitc质量比85∶1与fitc混合，室温300rpm下搅拌反应4小时。同样条件下离心重悬即得。
51.特征评价：使用透射电镜(tem)观察gnp和tdn@gnp大小及形态，纳米粒检测浓度0.7mg/ml，在微栅碳支持膜上吸附2分钟，1.5％的磷钨酸负染45秒，干燥后用透射电镜拍摄。通过粒径检测分析仪(dls)检测gnp和tdn@gpn的粒径，分散系为纯水，检测浓度为15μg/ml。
52.3)制取tdn@plga递送载体
53.30mg peg-plga溶解于1ml乙腈溶液中；逐滴滴加至10ml溶有tdn的双蒸水中，过程中800rpm搅拌，滴加结束2min后，搅拌速度调节至300rpm，过夜室温搅拌至有机相挥发。超高速离心机(11000g，30min)离心，重悬。
54.4)细胞培养hei-oc1细胞系培养液成分为90％dmem培养液加10％胎牛血清，培养温度为33℃，10％co2。
55.5)细胞摄取效率评价以5
×
104个/孔的密度接种于24孔板，培养12小时以后，更换培养基为含有tdn@gnp或同浓度tdn(5nm)的dmem培养液，分别培养1小时、3小时、6小时、12小时和24小时。随后用pbs清洗细胞三次，4％多聚甲醛固定30分钟，hoechst染色细胞核30分钟，激光共聚焦显微镜拍摄。
56.实施例1 tdn@gnp递送载体的表征
57.如图1a、图1b、图1d和图1e所示，通过粒径检测分析仪(dls)测得gnp和tdn@gnp的粒径分别约为333.3
±
4.91nm和331.1
±
2.17nm；电位分别为22.9
±
0.26mv和23.3
±
0.66mv。tdn的负载未显著改变gnp粒径大小。tdn带负电荷，通过电荷吸附中和gnp部分正电荷，即制备获得tdn@gpn电位由27.9mv左右降低到约18.9mv。制备过程采用纳米沉淀法，未经过剧烈超声破碎，而是温和的滴注，最大限度保证tdn结果完整性。透射电镜(tem)检测结果表明，gnp和tdn@gnp表面光滑，大小均一的球体结构(图1c和图1f)，粒径大小分别约为153.26
±
2.1nm和144.64
±
3.5nm。透射电镜所测得粒径显著低于dls测得的粒径，可能是由于样本制备过程中需要磷钨酸负染，室温下吹干，样本可能发生皱缩。透射电镜结果同样提示gnp和tdn@gnp粒径大小无显著性差异。
58.实施例2tdn@gnp递送载体的稳定性
59.如图1g所示，tdn@gnp体外经胰蛋白消化后，有完整结构tdn释放，表现在tdn@gnp+trypsin组凝胶电泳所得tdn条带，与单独tdn组条带位置一致，gnp+trypsin在相同位置未发现目标条带。blank和tdn@gnp作为阴性对照，在电泳整个泳道中未发现特异性条带。
60.载体的稳定性是保障药效发挥的关键因素之一。如图1h所示，在含有50％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)的缓冲液中，tdn系统在缓冲液中孵育2h可观察到清晰tdn目标条带，12h后条带即完全消失，表明tdn在该时间点下已完全降解。同时，tdn@gnp孵育24h之内仍观察到清晰tdn条带，直至48h后tdn条带完全消失。以上结果表明gnp显著提高tdn在含50％胎牛血清稳定性。
61.胶原蛋白作为天然产物具有生物应用安全性高的特性。如图1i所示，gnp和tdn@gnp在浓度高达500μg/ml浓度下，对听觉毛细胞hei-oc1仍无细胞毒性，表明其应用时安全系数高。
62.实施例3tdn@gnp递送载体在听觉细胞系摄取效率评价
63.基于胶原蛋白制备明胶纳米粒具有良好的生物相容性、特异的稳定性、高细胞安
全性以及表面携带正电荷的特性，有望提高tdn在听觉细胞系中的摄取效率。cy5标记tdn(cy5-tdn)和tdn@gnp(cy5-tdn@gnp)经流式细胞检测后，单个细胞内荧光强度显示如图2所示。
64.cy5-tdn在3-24h孵育时间内，细胞内荧光强度未发现显著变化，均处于较低摄取水平。cy5-tdn@gnp随着孵育时间的延长，呈现时间依赖的细胞摄取强度提高，且在相同时间点下(6h、12h、24h)，摄取效率显著高于tdn。该结果表明，gnp具备显著提高tdn在听觉细胞系hei-oc1内的细胞摄取效率。
65.实施例4不同复合载体对tdn摄取效率的影响
66.为进一步确定gnp提高tdn在听觉细胞系中的摄取效率，选用已发表文章中(biomaterials 34，2013：3925e3937，journal of nanobiotechnology，2022.20：268)制备的聚乙二醇聚乳酸plga-np和聚硫化丙烯pps-np进行tdn复合物制备，相关载体粒径大小和所带电荷见表1。plga-np表面电荷为-26.13
±
3.28mv，与tdn表面电荷相互排斥，难以通过正负电荷吸附形成复合载体，故tdn@plga所形成的复合物出现大量沉淀，复合效率较低。pps-np表面电荷为10.86
±
3.27mv，易于tdn通过正负电荷吸附形成大小均一、粒径完整的复合体系，tdn@pps粒径和电位分别是148.92
±
2.32nm和12.76
±
0.45mv。
67.表1不同载体的粒径大小、电位值和tdn包封率比较
[0068][0069]
如图3所示，不同复合载体(tdn@plga，tdn@pps和tdn@gnp)与hei-oc1细胞系共孵育24h后，共聚焦检测细胞内荧光强度图，同时统计细胞内荧光强度值。结果显示，与tdn相比，tdn@gnp显著提高tdn听觉细胞系内hei-oc1摄取效率(p《0.01)，而tdn@plga和tdn@pps与tdn组相比，细胞摄取效率无显著性差异。
[0070]
实施例5tdn@gnp提高egcg抗rsl3引起的细胞毒性
[0071]
egcg是茶叶中含量最丰富的儿茶素，具有包括抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等活性作用。研究表明，egcg具有改善线粒体功能，清除细胞内ros，抑制脂质过氧化等功能。此外，研究表明egcg能够缓解氨基糖苷类抗生素及顺铂引起的听力损伤，这使egcg被视为对抗噪音性耳聋的候选药物。由于egcg的低生物利用度、稳定性和低溶解度极大地限制了其在临床中的应用，将egcg封装于各类药物递送载体成为了研究的热点之一。研究表明，egcg能够通过非共价作用嵌入dna的双链结构中，这提示利用该机制将egcg装载于dna纳米结构具有可行性，所构建的药物递送载体具有应用价值。
[0072]
前期研究基于egcg经非共价作用结合于dna纳米结构的潜力及egcg具备的抗脂质过氧化特性，而制备了一种内耳药物递送系统-载egcg正四面体dna纳米结构(egcg@tdn)。
经gnp复合tdn之后，期望通过gnp提高细胞摄取效率以提高药物egcg@tdn抗药物引起的细胞毒性。在hei-oc1听毛细胞系中我们构建了rsl3脂质过氧化细胞损伤模型。如图4a所示，rsl3呈现浓度依赖性的细胞毒性增强。图4b结果表明egcg在0.5-5μm对hei-oc1无细胞毒性，浓度为20μm有显著细胞毒性作用，故后续实验选用egcg浓度小于5μm。如图4c所示，不同载体预先与hei-oc1细胞系共孵育6h，随后加入rsl3(7μm)诱导细胞毒性，在共孵育24h后检测细胞毒性，结果显示，egcg和tdn-egcg在4μm、4.5μm和5μm浓度下对rsl3引起的细胞毒性无逆转和抵抗作用(p＞0.05，ns)，而tdn-egcg@gnp在以上三个浓度下均显著抵抗rsl3引起的细胞毒性，体现在细胞活性提高2-3倍(****p＜0.0001)。以上结果进一步证实tdn@gnp在提高细胞内摄取效率的前提下还有效提高药物活性，达到更强的抵抗细胞毒性的药效。

技术特征：
1.一种向听觉细胞递送dna的方法，其特征在于将tdn分散于胶原蛋白溶液中，而使tdn负载于胶原蛋白上，降低tdn的电位，以此提高听觉细胞对dna的摄取效率。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的tdn负载于胶原蛋白后制得tdn@gnp颗粒的电位为18.9
±
1.2mv。3.一种递送载体，其特征在于包括tdn和胶原蛋白，tdn负载于胶原蛋白上，载体的电位为18.9
±
1.2mv。4.根据权利要求3所述的递送载体，其特征在于所述载体的粒径为313.5
±
4.2nm。5.根据权利要求3所述的递送载体，其特征在于tdn和胶原蛋白重量比小于1∶400。6.根据权利要求3所述的递送载体用于提高向听觉细胞的摄取dna的效率。7.根据权利要求3所述的递送载体，其特征在于按如下方法制取：先在碱性的明胶溶液中加入tdn于40℃震荡孵育28分钟
±
5分钟，制得含tdn的明胶溶液；然后，将含tdn的明胶溶液滴加入乳化剂浓度为7％的97v/v％乙醇或丙酮溶液中，于31℃
±
3℃混匀，滴加过程中同时搅拌乙醇或丙酮溶液；10分钟后滴加2v/v％戊二醛，随后室温搅拌10小时以上；最后，离心，取沉淀即得。8.根据权利要求3所述的递送载体，其特征在于含tdn的明胶溶液滴加时，搅拌速率800
±
20rpm。9.根据权利要求3所述的递送载体，其特征在于所述的乳化剂为泊洛沙姆407。10.根据权利要求3所述的递送载体在制备治疗遗传性耳聋、噪音性聋或药物性聋的药物中的应用。

技术总结
一种向听觉细胞递送DNA的方法，将TDN分散于胶原蛋白溶液中，而使TDN负载于胶原蛋白上。将本发明方法制取得到的递送载体，其电位显著下降，并使得听觉细胞对DNA的摄取效率显著挺高，是使得活性分子发挥更佳药效的决定性因素。当活性分子负载于载体后，由于听觉细胞对递送载体的摄取效率提高，也同样提高了活性分子的递送效率，进而相应增强了药理学活性，有利于改善听觉损失的治疗。利于改善听觉损失的治疗。利于改善听觉损失的治疗。


技术研发人员：吴皓 於得红 汪雪玲
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2023.02.23
技术公布日：2023/10/6