一种用于冬虫夏草菌遗传标记的重组质粒及遗传标记方法

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于冬虫夏草菌遗传标记的重组质粒、农杆菌菌株，以及冬虫夏草菌的遗传标记方法。


背景技术：

2.冬虫夏草是典型的虫菌复合体，由麦角科真菌—冬虫夏草菌[ophiocordyceps sinensis(berk.)]专一性侵染蝙蝠蛾科(hepialidae)幼虫后，在寄主体内增殖，最终致死寄主而形成。冬虫夏草具有免疫调节，抗氧化，调节血脂血糖，抗肿瘤，延缓衰老等功效。药用价值高是冬虫夏草市场需求日益增加的重要原因。但冬虫夏草菌和蝙蝠蛾生长缓慢，而且生存环境特殊，生存范围窄，导致冬虫夏草资源紧缺，同时也限制了冬虫夏草的基础研究及应用。冬虫夏草形成过程中的很多科学问题仍未得到解答，比如，自然条件下冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫的过程、冬虫夏草菌与宿主蝠蛾幼虫的免疫互作、冬虫夏草菌在蝠蛾体内的发育历程等。如果有特异标记的冬虫夏草菌，上述科学研究将突破限制，步入快速发展的新阶段。
[0003]
中国专利cn107557305a公布了一种发酵合成
13
c标记冬虫夏草菌菌丝体的方法。该标记方法操作繁琐，每次制备
13
c标记冬虫夏草菌菌丝体都需要
13
c标记的葡萄糖。而且，
13
c标记的冬虫夏草菌不具备可视性，检测需要大型仪器设备，此方法仅适用于代谢相关的研究，限制了冬虫夏草菌的基础研究和应用。因此，在遗传水平对冬虫夏草菌进行荧光标记是亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0004]
因此，本发明的目的是提供一种具有可视性、操作方便，可以在复杂的环境中特异地检测到不同形态的冬虫夏草菌的遗传标记方法。
[0005]
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006]
一方面，本发明提供了一种用于冬虫夏草菌遗传标记的重组质粒，其包含与绿色荧光蛋白编码序列可操作连接的组成型表达绿色荧光蛋白(gfp)的冬虫夏草菌启动子序列。
[0007]
根据本发明的实施方案，所述冬虫夏草菌启动子序列为冬虫夏草菌ef1α启动子序列。具体地，所述冬虫夏草菌ef1α启动子序列如以下序列所示：gctcaagttgggcatgacgggaccctcgcttttccacccgaaactcgagacgcaccgatttttttttggctccatcgtggatgcggcttcgaccccacttcgtaggtatctgctaacagatgacgtgtacgaagtatacactgccgttaggaagagcggcttcggcgcaccgtcgagtcatccgggcaggatgagtactttcgccgtagaaaaaaaccttccgctgctggctgcggcctcggcgccccgggacgagggcagggtcattgaaaataggatgagtcgtgtctgtctctcgtgcgcctgcgtttgggcattgcaccagtgactctcacgacaacaacacaaccggcccgaaatgcgtcaatctcattggcccgcgtagccctggtccacccacagacagagggggggcggggtaaattcactgcgaggcagggaaaaatagcgaccgaccaggtacctcgggcgtgttagggcttgcctgcacaaactgcacaaactgctcccaccctcctctagttgccccgcgcgagtgcggcagcagcatgagcc
actctcgccccaccctacccaccctttaaatcccttcctcccaccacagcgtttgcgaatttttctctttctgctcttcgtctcgcatacccggttcaagcatccgacctgcgattttgtcagttgctcgccttccgccatcgccatccacagcgagagcatcgtctaacgcgcgtcttcgctctgcagttcgatttcagtcaagcaatccacacgaacacttcacctccacaaacctcgccaag(seq id no.1)。
[0008]
根据本发明的优选实施方案，所述重组质粒还包含抗生素抗性筛选基因序列。具体地，所述抗生素抗性筛选基因可以选自潮霉素抗性基因或苯菌灵抗性基因。优选地，所述抗生素抗性筛选基因为潮霉素抗性基因。
[0009]
另一方面，本发明还提供了一种用于冬虫夏草菌遗传标记的农杆菌菌株，其包含上述根据本发明的重组质粒。
[0010]
根据本发明的实施方案，所述重组质粒采用冻融法转化到所述农杆菌菌株中。
[0011]
再一方面，本发明提供了一种冬虫夏草菌的遗传标记方法，其包括以下步骤：
[0012]
将上述根据本发明的农杆菌菌株与冬虫夏草菌共培养，筛选阳性转化子。
[0013]
根据本发明的实施方案，所述遗传标记方法包括将农杆菌菌株与冬虫夏草菌在16-22℃下于用于共培养的固体培养基上共培养，优选20℃下避光共培养48-96小时，再用包含抗生素的冬虫夏草菌固体培养基筛选共培养物，在16-22℃下培养25-35天获得抗性菌落。优选地，所述用于共培养的固体培养基包含磷酸二氢钾5-15mm，磷酸氢二钾7-17mm，硫酸镁2-2.5mm，氯化钠2-6mm，氯化钙0.1-0.5mm，硫酸亚铁0.5-10μm，硫酸铵3-5mm，葡萄糖3-7mm,甘油0.3-0.7％，琼脂1.5-2.0％，吗啉乙磺酸30-50mm，乙酰丁香酮200-300μm；和/或每升所述冬虫夏草菌固体培养基包含马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-10g、氯化钠1-5g、维生素b 20-100mg、胎牛血清10-100ml、琼脂15g。所述共培养在16-22℃的温度下避光进行既能保证农杆菌具有侵染能力，又可以保证冬虫夏草菌能够正常生长；所述共培养进行72小时既能保证农杆菌不至于生长过盛，又可以保证冬虫夏草菌能将目的片段整合至自身基因组。采用本发明所述冬虫夏草菌固体培养基可以大大缩短筛选阳性转化子的时间，仅约为30天。
[0014]
根据本发明的优选实施方案，所述遗传标记方法还包括将获得的抗性菌落在冬虫夏草菌培养液中扩繁。优选地，每升所述冬虫夏草菌培养液包含马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-10g、氯化钠1-5g、维生素b 20-100mg、胎牛血清10-100ml。根据本发明的优选实施方案，所述遗传标记方法还包括用荧光显微镜检测扩繁获得的阳性转化子的绿色荧光信号。
[0015]
根据本发明的实施方案，在所述共培养之前，将所述农杆菌用乙酰丁香酮诱导培养5-7个小时至od
660
为0.3-0.5。
[0016]
根据本发明的实施方案，所述冬虫夏草菌为冬虫夏草菌芽孢。优选地，所述冬虫夏草菌芽孢的浓度为1.0
×
107个/ml。使用冬虫夏草菌芽孢容易培养和收集。
[0017]
发明人出乎意料地发现，使用组成型表达的冬虫夏草菌ef1α启动子能够保证受体冬虫夏草菌组成型地高表达gfp蛋白，使各个形态的冬虫夏草菌都可以发出绿色荧光。并且，发明人曾尝试了多种真菌中常用的组成型表达的启动子，然而只有含ef1α启动子的重组质粒获得了阳性转化子，而其他组成型表达的启动子，例如β-tubulin、trpc等启动子均未获得有荧光信号的阳性转化子。
[0018]
此外，还令人吃惊地发现，由于本发明的冬虫夏草菌固体培养基和培养液中含有
适量的胎牛血清，可以起到刺激并加速冬虫夏草菌的生长的作用，大大缩短阳性转化子扩繁的时间，7-10天即可完成扩繁。
[0019]
鉴于农杆菌介导的转化系统可以不使用原生质体作为转化受体，分生孢子、菌丝甚至真菌组织体作为转化受体都能实现遗传转化的特点，特别是对于生长缓慢的冬虫夏草菌来说，省略原生质体的制备与复苏步骤意味着节省大量的时间，本发明采用了农杆菌介导的转化系统。除此之外，农杆菌介导的转化法与传统的真菌转基因技术相比具有转化效率高、操作方便、单拷贝插入等优势。
[0020]
本发明优化了农杆菌与冬虫夏草菌的共培养条件及筛选条件，30天即可完成筛选。利用本发明的冬虫夏草菌培养液，加快了阳性转化子扩繁速度，7-10天即可完成扩繁。
[0021]
本发明采用农杆菌介导的真菌转化系统，用绿色荧光蛋白标记冬虫夏草菌，其中启动子为冬虫夏草菌自身组成型表达的启动子，优化了农杆菌与冬虫夏草菌的共培养条件及筛选条件，并利用本发明的冬虫夏草菌培养液快速扩繁阳性转化子，最终获得gfp标记的冬虫夏草菌菌株。
[0022]
本发明的标记方法稳定、无毒、安全、操作方便，为该菌株的应用提供便利条件。本发明利用冬虫夏草菌自身组成型表达的启动子和外源gfp基因，实现了冬虫夏草菌的活体遗传标记。可以根据需要扩繁出大量具有绿色荧光的冬虫夏草菌，也可以获得具有绿色荧光的不同形态的冬虫夏草菌，从而可以在复杂的环境中特异地检测到冬虫夏草菌，具有可视性，为冬虫夏草的研究和应用提供更加广阔的前景。本发明可用于冬虫夏草菌特定基因的转录水平检测、特定蛋白的亚细胞定位、特定蛋白质的功能研究等。也可以参考本发明的方法，结合同源重组理论，对冬虫夏草菌的某一特定基因进行敲除，用于冬虫夏草菌特定基因的功能研究。
附图说明
[0023]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0024]
图1是本发明构建的质粒pbht2-ospef1α-gfp的简图。
[0025]
图2是体外培养的gfp标记的冬虫夏草菌芽孢及菌丝。
[0026]
图3是僵虫体内的gfp标记的冬虫夏草菌。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本实施例仅为解释本发明，不意味以任何方式限制本发明内容。
[0028]
实施例1
[0029]
本实施例为农杆菌介导的以gfp标记冬虫夏草菌的方法，包括以下步骤：
[0030]
步骤1)预测冬虫夏草菌ef1α、β-tubulin、trpc启动子序列：
[0031]
分析冬虫夏草菌的基因组数据，分别导出冬虫夏草菌ef1α、β-tubulin、trpc编码区及其前侧1000-2000bp的序列(其中下划线部分为基因编码区)：
[0032]
ef1α基因编码区及其前侧序列
[0033]
ccgaggcgacgaggagtgtacgaattgacttgaagatttgtgaaagtgtcgccatgtgttatcgagctccgatgcgggtgcaacatctagggcaacccgaggtcatcctcatcgcagcgcgggcagttggtgtcacagcctgga
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[0034]
β-tubulin基因编码区及其前侧序列
[0035]
tgcgcttgcgcgtgccctgttctgcgagcccgaccttttgctactcgacgaaccgtccaacatgttggacgttccttcaatcacctttctttccggatacctgcaaagctaccctagtactctcctcgtcgtctctcacgacagggcctttctcaacgaagtggctacagacattatccaccagcactcggagcgcctcgactactaccgtggagccaactttgactccttctactccacgcgcgaagagcgcaaaaaggttgccaagagagagtacgagaaccagatggcccagcgtgcccacctgcaggcctttatcgacaagtttcgctacaacgcggccaagtcctccgaggcccagtcgcgcatcaaaaagttggagaaaatgccggtgctggacgcgccagagtcagagtacagcgtcaagtttcggtttcccgaagtggagaagctgtcccctcccatcattcaaatgtccgaggtggattttggctactccaaggacaagccgctgctaagaaacgtggacttggacgtccagttagactcccgcatcggcatcgtcgggcccaacggtgcgggtaagacgacaattttgaagctccttactggcaggctggagccgttcaaaggaatcgtcacggcgaatgcccgactgcggattggcttctttgcgcagcaccacgtcgacgcgctcgatctgacaatgagttcagtgagtttcatggccaaaatgtatcctggccgcaccgacgaggaataccgacggcagctcggcgcctttggcatcacgggcaccacgggcctgcagaagatgggtcagctctcgggtggtcagaagtcaagggtcgcgtttgcttgcctggccctcacgaacccgcacattttggtgctcgacgagccttcgaatcatctcgacattgaggccatggacgccctggcggaggcgctcaccgagttccagggcggtgtgctcatggtgtcccacgacgtcaccatgctgcagatggtgtgcacatcgctgtgggtatgcgacggcggaatagttgagaagtttccgggcgatgtgcagcagtacaagaagaggatcgcggcgcaggcagacgcggctggtgtagtcaaagctcattagcagcccggagacaagggatccggggagacatatccatccattgtgtagcgaatggaaatggcgtgtcctcagccgccgtggtggtgagtgctgagatgcccgtcgaggtgatcccgcgcggactctcctatctgtttccttctcttttcaaagcttcatgcgccgaagatatctcgcgcttctgccccttgttgggcggtaacgcgccggaaacaccgcgacgtcccggccaaaacaccttctcctcgcgtcaagagggaaatacttatttcgatagcatgaggatcgggcccgtaacacttgtactcggatcttcacaccgggtcgaggttgatggaagcaaccgctcacccaactggcttacgtaattcccagcctggcaaatgaattgcaatgcaggcgagaggagttgtctcttgccgccccggcggtgaagaggtatgtatgtacctgatctcctgcaggagtgtccaacaaaaatccacctctcacttctctcaccacaacacacactatcaccaccctcgcatcgcgaagctccccttggccctcgcgatctcgcccgattccctcttccgctcagtacgcctcttcgacgatagccttcatccgtcaacatgcgcgaaattgtgagtctccctctttctccccggcaagctcaattcgcgcgacgcgtctcgaccacccaagatgcccctgatgatgtgtgccccaccaaaaacattgcactcccatttcggcccaacttgaggagcacgcagatacaagcgacctgctgtcgacgaccagcctgctgaccgagactctttgaacgactataggttcatcttcagaccggccagtgcgtaagtaactgccctccaccgcgatggccacacgtgtttcccggaggctcaacagtcgtctgcagggcaaccaaatcggtgctgcgttctggcagaccatctctggcgagcatggcctcgacagcaatggtgtctacaacggcacttcggagcttcagctcgagcgcatgagcgtatacttcaatgaggttcgtctcgccatgtgtgccctgcttgggaaacccatccgccaaagcccaactaaccgtattggctggtgaataggcctcaggaaacaaatatgtcccccgcgctg
tccttgtcgatctcgagcccggcaccatggacgccgttcgtgccggtccctttggtcagctgttccgcccggataacttcgttttcggccagtccggtgctggcaacaactgggccaagggccactacactgagggtgccgagctggtcgaccaggtcctcgacgtcgttcgtcgcgaggctgagggctgcgactgcctgcagggcttccagatcacccactccctgggtggcggcactggtgctggtatgggtaccttgctcatttccaagatccgcgaggagttccccgaccgcatgatggccaccttttctgtcgtgccctcccccaaggtctccgacaccgtcgtcgagccctacaacgccaccctctccgtccaccagcttgtggagaactcggacgagacgttctgcatcgacaacgaggccctctatgatatctgcatgcgtaccctgaagctgtccagcccctcgtacggtgacctaaaccacctcgtctcggctgttatgtcgggcgtcacgacctgcctgcgattcccgggtcagctcaactcggatctccgcaagctcgccgtcaacatggttcccttccctcgtcttcatttcttcatggtcggcttcgcgcccctgaccagccgtggcgcccactctttccgcgccgtcagcgtgcccgagttgacgcagcaaatgttcgaccccaagaacatgatggctgcctccgatttccggaacggccgctacctgacttgctctgccattttgtatgtgttcctgactatgctgtcggccttgagacttggactaacatgcattgcagccgtggcaaggtcgccatgaaggaggtcgaggaccagatgcgcaacgtgcagaacaaaaatgcaacgtactttgttgaatggattcccaataatatccagacagccctttgcgctatccctccccgtggcctcaagatgtcgtccacctttatcggcaactcgacctctatccaggagctctttaagcgtgttggtgagcagttcactgccatgttccgtcgcaaggctttcttgcattggtacacgggcgagggcatggatgagatggagttcaccgaggccgagtctaacatgaacgacttggtctccgagtaccagcagtaccaggatgctggtatcgacgatgagccggaggagtacgacgaggagcaggctcccgaggccgaggaatag(seq id no.3)。
[0036]
trpc基因编码区及其前侧序列
[0037]
cggcaatctcgtccgagtcgagggccgacgatgcgcccaggtccgataggaaagatgcgccttgaccattttgaaggccggcggcttcttgtagatttgcggcgtcctgagaggagagcgggcccataagatgcctgaaagggcgcgactgggcctcgacaatgacgacccgcagcgcagcgacggggttaatctttgcgttttgactgagccattccgcatctgccttgaaggtcttgacatcgtggtccgaggccgaggtcacgttgacgggagccgtcttggtctcaaagtccttttggaaggcgtcgttgggcggcgcaaacacggccgaagggtctctgagcaaagaatgaacgtgttcatctgcgaggaaaccgaccacagctgggcacgtctgtcgttggccggattggtccgaaagcgcggtcgcgatgtgagtccaggagctaaagggaagtcagtcgcaagcatctcaatggaggggagaaggctcacagaagcacgcgctccccggacaagcacccctccagcggggggaaataagtgctatccgacaccggcgccatggccgcgagcgtcagtcaaggggtgacggcaggcgcatcccttggcgggggggttggcgcaggtgaggatgaggatgttggtgttgacgcgcttgagcagcagcatttgtccgtcgagctacgaatacactcctcactgtctgggactttttccttaggcccgagcttcgttggaccgatgtttagccagctaagccgttccccggcagttgatggaagcgctgcactgtgcatacgcacggtacatgacgccctgttcatcgtgcgacgacacagtacgccgggttatctatcggtgcccgcagattctcaatggcctcgagtcagtcacgtctggcgaagcgagcgtttcccttgcattctatctcggcggcgccgtgttcctgtatcagtgcacacatcaatcaagacattgtcggaagtctttgaaaatgccgtcggctctcggaatcatcgatcactctccccatcagcccgaaccctccccccccattccaacagcctccaacctcgttctcatcgacaactacgactcctttacctggaacatctaccagtatctcgttctcgagggagccaccgtccatgtattccgcaacgaccagatcagcctcgaggagctcatccagaagaaccctacccagctcatcatcagcccaggcccggggcaccccgcaaccgactcgggcatcagtcgagatgccattcgtcattttgccggcaaggtccccatctttggtgtttgcatgggcctgtgagtctctatagaggtggtgtccctccctgtactggtctgtctggctcacgcttgccagacaatgcatgtttgatgtctatggcggagatgtcaactcggctggcgagtggcttcacggcaagacgtcccctttggtacatgactccaagggcgtctttgccgacctcgagcagaatctcccagtgacgaggtatcattccctggcgggaacccacgtcaccctgcccgagtgccttgaaatcacctcgtgggtggccaacgc
ggacggctcgcccggcatcatccaaggcattcgtcacaagacgtttgccatggagggagtgcagtttcaccctgagagcatactgacagcccacggccgcaagatgattaaaaatttcctgcttatgcagggtggcacctgggaggaaaactctcagctgcagagggcggcgtcggccaaggacgctgccgctgcgccggcgaagcccaagggcaacaacatccttgagcgaatctatgctagccgaagggctgctgttgcgattcagaaagagatcccttcccagagaatggccgacctgcaggctgcctacgatcttaacgccgcccctcctctggtcccgctcgtcagtcgcctgcgccaaacaccattcgacgtggctctcatggccgagatcaagcgtgcctctccttccaaaggcgtctttgctctcgacatcaatgcgcccactcaagcacgcacgtatgcactggcgggcgccagcgtcatctcggttctcacggagccagagtggttcaagggaagtctcgacgacttgcgagccgtgcggcaggtcctggacggaatgccaaacaggcccgtcgttttgcgcaaggacttcatctttgacgagtaccagatcctcgaggcgagactagcgggcgccgacacgattctgctgattgtcaagatgctgcatctcgagctgctcgaacggctgtacaagtactcgctctcgctgggcatggagccactggtggaggttcaaaacgccgaggagatgacgacggccgtgaagctgggcgccagggttatcggggtgaacaaccggaacctggaaaatttcgaggtagacctggacacgacgggccggctgaggcgcatggtgcccgaaaacacgctcatctgcgctctcagcggcatcaacacccacgacgacgtgctgatgaacaaaaatgacggggtcaacgccgtgctcgtgggagaggcaattatgcgcgcgccaaacgcgggcgtcttcatcagcgagctctgcgcgggctcgaagccggtggccgacaagccgccgccgcgacggctctacgtcaagatttgcgggactcggtcggtcgaagccgcccaagaagccgtcaagtcaaaggccgactttgtgggcatttgcctggtgcgtggcgccaagcgctgcgtcactcacgagacggcgctggcaatatccaacgcgttgcattcgcaacctggacgtctcgaggccagagctgagtgccaattgtccagcagctgcgccacggactactttacagccgccgcttcacggcttctgagctcacggacccgcctggtgggcatcttccagaaccagcccctggcagacgtgttggaaatgcagaggctctacgacctagatctcgtccagctgcacggtgacgagccggttgagtgggccagggtcatcccggtgcccgtcatccggtgcttcaaacccggccaggtcgggctcgggctgcgcggttaccacacgataccgctgctcgactcggggtccggctcgggcaaactgctcgacgtgtcgagcgtcaaggctgcgctggagaaggatgcccacctccgagtcttcttcgccggcggcctgagcccggacaacgtggccgaggcggtcgatgccctaggcgggctgagcgctcgggtcctcggggtcgacgtgagcagcggtgtcgaggaggacggggagcagagtctgagcaagattgctgcttttgtcgaggctgcgaagagcatcagatag(seq id no.4)。
[0038]
将上述三段序列分别上传至网站http://www.softberry.com/berry.phtml？topic＝tssp&group＝programs&subgroup＝promoter，预测的启动子序列如下：
[0039]
冬虫夏草菌ef1α的启动子序列长800bp，为：
[0040]
gctcaagttgggcatgacgggaccctcgcttttccacccgaaactcgagacgcaccgatttttttttggctccatcgtggatgcggcttcgaccccacttcgtaggtatctgctaacagatgacgtgtacgaagtatacactgccgttaggaagagcggcttcggcgcaccgtcgagtcatccgggcaggatgagtactttcgccgtagaaaaaaaccttccgctgctggctgcggcctcggcgccccgggacgagggcagggtcattgaaaataggatgagtcgtgtctgtctctcgtgcgcctgcgtttgggcattgcaccagtgactctcacgacaacaacacaaccggcccgaaatgcgtcaatctcattggcccgcgtagccctggtccacccacagacagagggggggcggggtaaattcactgcgaggcagggaaaaatagcgaccgaccaggtacctcgggcgtgttagggcttgcctgcacaaactgcacaaactgctcccaccctcctctagttgccccgcgcgagtgcggcagcagcatgagccactctcgccccaccctacccaccctttaaatcccttcctcccaccacagcgtttgcgaatttttctctttctgctcttcgtctcgcatacccggttcaagcatccgacctgcgattttgtcagttgctcgccttccgccatcgccatccacagcgagagcatcgtctaacgcgcgtcttcgctctgcagttcgatttcagtcaagcaatccacacgaacacttcacctccacaaacctcgccaag(seq id no.1)。
[0041]
冬虫夏草菌β-tubulin的启动子序列长868bp，为：
[0042]
cagcccggagacaagggatccggggagacatatccatccattgtgtagcgaatggaaatggcgtgtcctcagccgccgtggtggtgagtgctgagatgcccgtcgaggtgatcccgcgcggactctcctatctgtttccttctcttttcaaagcttcatgcgccgaagatatctcgcgcttctgccccttgttgggcggtaacgcgccggaaacaccgcgacgtcccggccaaaacaccttctcctcgcgtcaagagggaaatacttatttcgatagcatgaggatcgggcccgtaacacttgtactcggatcttcacaccgggtcgaggttgatggaagcaaccgctcacccaactggcttacgtaattcccagcctggcaaatgaattgcaatgcaggcgagaggagttgtctcttgccgccccggcggtgaagaggtatgtatgtacctgatctcctgcaggagtgtccaacaaaaatccacctctcacttctctcaccacaacacacactatcaccaccctcgcatcgcgaagctccccttggccctcgcgatctcgcccgattccctcttccgctcagtacgcctcttcgacgatagccttcatccgtcaacatgcgcgaaattgtgagtctccctctttctccccggcaagctcaattcgcgcgacgcgtctcgaccacccaagatgcccctgatgatgtgtgccccaccaaaaacattgcactcccatttcggcccaacttgaggagcacgcagatacaagcgacctgctgtcgacgaccagcctgctgaccgagactctttgaacgactataggttcatcttcagaccggccagtgcgtaagtaactgccctccaccgcg(seq id no.5)。
[0043]
冬虫夏草菌trpc的启动子序列长431bp，为：
[0044]
ggccgcgagcgtcagtcaaggggtgacggcaggcgcatcccttggcgggggggttggcgcaggtgaggatgaggatgttggtgttgacgcgcttgagcagcagcatttgtccgtcgagctacgaatacactcctcactgtctgggactttttccttaggcccgagcttcgttggaccgatgtttagccagctaagccgttccccggcagttgatggaagcgctgcactgtgcatacgcacggtacatgacgccctgttcatcgtgcgacgacacagtacgccgggttatctatcggtgcccgcagattctcaatggcctcgagtcagtcacgtctggcgaagcgagcgtttcccttgcattctatctcggcggcgccgtgttcctgtatcagtgcacacatcaatcaagacattgtcggaagtctttgaaa(seq id no.6)。
[0045]
步骤2)扩增冬虫夏草菌ef1α、β-tubulin、trpc启动子序列：
[0046]
设计扩增上述三个启动子的引物序列分别如下所示：
[0047]
posef1α-f:accatgattacgaattcgctcaagttgggcatgacgggaccc(seq id no.7)。
[0048]
posef1α-r:tcgcccttgctcaccatcttggcgaggtttgtggaggtgaag(seq id no.8)。
[0049]
postub-f:accatgattacgaattccagcccggagacaagggatccgggg(seq id no.9)。
[0050]
postub-r:gcccttgctcaccatcgcggtggagggcagttacttacgc(seq id no.10)。
[0051]
postrpc-f:catgattacgaattcggccgcgagcgtcagtcaaggggtg(seq id no.11)。
[0052]
postrpc-r:tcgcccttgctcaccattttcaaagacttccgacaatgtc(seq id no.12)。
[0053]
以ctab法提取的冬虫夏草菌基因组为模板，扩增冬虫夏草菌的ef1α启动子(ospef1α)、β-tubulin启动子(osptub)和trpc启动子(osptrpc)。pcr反应体系：缓冲液6μl，2.5mm dntps 2.4μl，10μm引物各0.6μl，冬虫夏草菌基因组0.6μl，dna聚合酶0.6μl，补加ddh2o至终体积30μl。
[0054]
pcr扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物为单一条带，且条带大小符合预期，即获得了冬虫夏草菌的ef1α启动子(ospef1α)、β-tubulin启动子(osptub)和trpc启动子(osptrpc)。pcr产物暂存于4℃下，用于后续连接质粒。
[0055]
步骤3)构建重组质粒pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp：
[0056]
由于原始质粒pbht2-gfp(购自普如汀生物技术有限公司)中ptrpc启动子两端没
有合适的酶切位点，不能直接通过双酶切进行质粒重构。本实施例借助中间克隆载体peasy-blunt(购自北京全式金生物技术股份有限公司)，采用快速克隆和双酶切结合的方法构建质粒pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp(流程图见图1)。具体操作如下：
[0057]
以pbht2-gfp为模板，pcr扩增ptrpc-hyg-camv和egfp-nos片段，并连接至peasy-blunt载体(连接方法参考peasy-blunt克隆试剂盒说明书)。取2μl连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株，转化方法为常规的热激法。次日菌落pcr检测并测序，确认成功构建质粒blunt-phygt和blunt-gfpt。pcr反应体系和pcr扩增程序参考步骤2)，引物如下：
[0058]
ptrpchygcamv-f：gaattcgtaatcatggtcatagctg(seq id no.13)。
[0059]
ptrpchygcamv-r：gacaacttaataacacattgcggac(seq id no.14)。
[0060]
egfpnos-f：atggtgagcaagggcgagg(seq id no.15)。
[0061]
egfpnos-r：gatctagtaacatagatgacaccgc(seq id no.16)。
[0062]
通过快速克隆的方法将步骤2)扩增的三个启动子序列分别连至blunt-gfpt载体，构建三个含有egfp表达盒子的质粒blunt-ospef1gfpt、blunt-osptubgfpt和blunt-osptrpcgfpt。快速克隆法需要线性化blunt-gfpt载体，线性化通过普通pcr反应实现。反应体系：缓冲液6μl，2.5mm dntps 2.4μl，10μm引物各0.6μl，质粒blunt-gfpt 20ng，dna聚合酶0.6μl，补加ddh2o至终体积30μl扩增。其中，引物序列如下所示：
[0063]
line-blunt-egfpnos-f：atggtgagcaagggcgaggag(seq id no.17)。
[0064]
line-blunt-egfpnos-r：gaattcgtaatcatggtcatagctg(seq id no.18)。
[0065]
反应程序：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2min，18个循环，72℃终延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物为单一条带，且大小约为5000bp，即获得了线性化的质粒linear-blunt-gfpt。
[0066]
dpni酶使线性化的质粒linear-blunt-gfpt分别与步骤2)获得的三个冬虫夏草菌启动子(ospef1α、osptub和osptrpc)连接，连接体系：linear-blunt-gfpt 6μl，ospef1α或osptub或osptrpc 3μl，dpni(neb#r0176)1μl。37℃孵育1小时。分别取2μl连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株，转化方法为常规的热激法。次日菌落pcr检测并测序，确认成功构建重组质粒blunt-ospef1gfpt、blunt-osptubgfpt和blunt-osptrpcgfpt。
[0067]
再通过双酶切的方法分别将质粒blunt-ospef1gfpt、blunt-osptubgfpt和blunt-osptrpcgfpt中的三个egfp表达盒子整合至质粒blunt-phygt中。双酶切反应体系：ecori 2.5μl，ecorv 2.5μl，10
×
h缓冲液5μl，质粒10μl，ddh2o 30μl。37℃反应2小时后，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物。t4连接酶切产物，反应体系：10
×
连接缓冲液2μl，t4连接酶1μl，双酶切后的载体片段50ng，双酶切后的目的片段100ng，补加ddh2o至20μl。16℃过夜连接后，取2μl连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株，转化方法为常规的热激法。次日菌落pcr检测并测序，确认成功构建重组质粒blunt-hygospef1gfpt、blunt-hygosptubgfpt和blunt-hygosptrpcgfpt。
[0068]
最后采用快速克隆法将原pbht2-gfp中表达hyg和gfp的相关元件替换为blunt载体中的hyg和egfp表达盒子，即成功构建用于农杆菌转化的重组质粒pbht2-ospef1α-gfp、
pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp。线性化pbht2-gfp的引物为：
[0069]
linepbht-f：aagcttggcactggccgtcgttttacaac(seq id no.19)。
[0070]
linepbht-r：taagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcc(seq id no.20)。
[0071]
扩增blunt载体中hyg和egfp表达盒子的引物为：
[0072]
hygegfpbox-f：aaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacg(seq id no.21)。
[0073]
hygegfpbox-r：gccagtgccaagcttcctctagatgcatgctcgagc(seq id no.22)。
[0074]
pcr反应及dpni酶的连接反应参考上述快速克隆法。
[0075]
分别接种包含重组质粒pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp的阳性dh5α菌株于5ml lb培养液(含50μg/ml卡那霉素)，37℃200rpm过夜摇培。分别取3ml过夜摇培的菌液提取三个重组质粒pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp，采用康为世纪质粒提取试剂盒(cw0500m)，方法按照其说明书。其余菌液用20％甘油冻存于-80℃下。构建的三个重组质粒既包含适用于冬虫夏草菌阳性转化子筛选的潮霉素抗性基因hyg，又包含组成型表达gfp的启动子序列ospef1α、osptub或osptrpc。
[0076]
步骤4)重组质粒pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp和pbht2-osptrpc-gfp分别转化至农杆菌agl-1(购自北京博迈德基因技术有限公司)中：
[0077]
用常规的冻融法分别将三个重组质粒转化至农杆菌中，具体可参考博迈德生物公司agl-1农杆菌感受态(bc302)说明书。
[0078]
步骤5)农杆菌介导的冬虫夏草菌转化：
[0079]
分别接种含pbht2-ospef1α-gfp、pbht2-osptub-gfp或pbht2-osptrpc-gfp质粒的agl-1单菌落到5ml yeb培养液中(含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)，28℃下220rpm过夜摇培。5000g离心5分钟收集菌体，除去上清，用适量的诱导培养液(含200μm乙酰丁香酮)重悬菌体，调整菌液浓度使od
660
为0.15。置于28℃，220rpm摇床培养6小时，至菌液浓度od
660
约为0.5。在此培养期间制备冬虫夏草菌芽孢悬液。
[0080]
取20ml液体摇培10天的冬虫夏草菌，用神奇滤膜(购自默克密理博公司)过滤除去菌丝，滤液5000g离心5分钟，除去上清，1ml无菌水重悬芽孢沉淀并洗涤3次，最终用无菌水重悬冬虫夏草菌芽孢，调整浓度至1.0
×
107个/ml。
[0081]
分别取三种诱导培养过的农杆菌菌液100μl至三支无菌的离心管中，均加入制备好的芽孢悬液100μl，充分混匀后，分别涂布于三个共培养的固体培养基上，20℃避光共培养72小时。分别加入3ml无菌水至共培养的固体培养基上，用涂布器洗涤除去多余的共培养物，显微镜观察仍有残留的共培养物，用于后续筛选阳性转化子。再将含抗生素的冬虫夏草菌固体培养基(含300μg/ml潮霉素和300μg/ml噻孢霉素)倒至洗涤后的共培养的固体培养基上，18℃下培养30天至抗性菌落出现。用牙签将抗性菌落转移至冬虫夏草菌培养液中(300μg/ml潮霉素和300μg/ml噻孢霉素)，18℃下100rpm摇培7天扩繁。用荧光显微镜镜检，发现含质粒pbht2-ospef1α-gfp的农杆菌转化的冬虫夏草菌菌株有明显的绿色荧光信号，但含质粒pbht2-osptub-gfp或pbht2-osptrpc-gfp的农杆菌转化的冬虫夏草菌菌株均无绿色荧光信号。挑选由pbht2-ospef1α-gfp农杆菌转化而得的冬虫夏草菌中绿色荧光信号较强的菌株，即可获得gfp标记的冬虫夏草菌菌株(如图2)。
[0082]
在本实施例中，所述用于共培养的固体培养基的组成为：磷酸二氢钾10.66mm，磷酸氢二钾11.77mm，硫酸镁2.03mm，氯化钠2.57mm，氯化钙0.45mm，硫酸亚铁9μm，硫酸铵3.78mm，葡萄糖5mm,甘油0.50％，琼脂1.50％，吗啉乙磺酸40mm，乙酰丁香酮200μm；每升所述冬虫夏草菌固体培养基包含马铃薯200g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化钠5g、维生素b 20mg、胎牛血清100ml、琼脂15g；每升所述冬虫夏草菌培养液包含马铃薯200g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化钠5g、维生素b 20mg、胎牛血清100ml。在本实施例中，筛选阳性转化子大约需30天，扩繁大约需7天。
[0083]
实施例2
[0084]
本实施例筛选确定用于冬虫夏草菌的培养基配方。
[0085]
冬虫夏草菌生长缓慢，给其相关的科学研究带来诸多不便，为了提高遗传转化效率，在执行实施例1之前，发明人比较了不同配方的培养基，最终选择最适合冬虫夏草菌生长的培养基。
[0086]
取2μl浓度为1.0
×
107个/ml的冬虫夏草菌芽孢悬液滴加至不同的固体培养基中心，待液体完全吸收后，倒置于18℃培养。60天后量取菌落直径。不同培养基配方如下表1所示：
[0087]
表1不同配方的培养基的扩繁效果比较
[0088][0089]
由表1中的实验结果可以看出，使用编号为3～7的培养基培养冬虫夏草菌芽孢60天后，所得到的菌落直径显著大于编号为1、2的培养基以及现有技术中常用的ppda培养基进行培养所得到的菌落直径，表明向培养基中添加胎牛血清具有出人意料的刺激并加速冬虫夏草菌的生长的作用。
[0090]
实施例3
[0091]
本实施例为gfp标记的冬虫夏草菌菌株的应用。
[0092]
gfp标记的冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫6小时后，取5μl血淋巴滴至载玻片，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察，即可轻松观察到蝠蛾血细胞对冬虫夏草菌的免疫攻击，如包囊和结节。
[0093]
gfp标记的冬虫夏草菌在小金蝠蛾幼虫体内扩繁后，致死冬虫夏草菌，形成僵虫，即虫菌复合体。取适量僵虫组织，置于载玻片上，滴加一滴生理盐水，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察，可以轻松观察到僵虫组织中的冬虫夏草菌，如图3。

技术特征：
1.一种用于冬虫夏草菌遗传标记的重组质粒，其包含与绿色荧光蛋白编码序列可操作连接的组成型表达绿色荧光蛋白(gfp)的冬虫夏草菌启动子序列。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其中所述冬虫夏草菌启动子序列为冬虫夏草菌ef1α启动子序列。3.根据权利要求1所述的重组质粒，其中所述冬虫夏草菌ef1α启动子序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求1所述的重组质粒，其中所述重组质粒还包含抗生素抗性筛选基因序列；优选地，所述抗生素抗性筛选基因为潮霉素抗性基因或苯菌灵抗性基因。5.一种用于冬虫夏草菌遗传标记的农杆菌菌株，其包含权利要求1至4中任一项所述的重组质粒。6.根据权利要求5所述的农杆菌菌株，其中所述重组质粒采用冻融法转化到所述农杆菌菌株中。7.一种冬虫夏草菌的遗传标记方法，其包括以下步骤：将权利要求5或6所述的农杆菌菌株与冬虫夏草菌共培养，筛选阳性转化子。8.根据权利要求7所述的遗传标记方法，其包括将农杆菌菌株与冬虫夏草菌在16-22℃下于用于共培养的固体培养基上共培养，优选20℃下避光共培养48-96小时，再用包含抗生素的冬虫夏草菌固体培养基筛选共培养物，在16-22℃下培养25-35天获得抗性菌落。9.根据权利要求8所述的遗传标记方法，其中每升所述冬虫夏草菌固体培养基包含马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-10g、氯化钠1-5g、维生素b 20-100mg、胎牛血清10-100ml和琼脂15g。10.根据权利要求7所述的遗传标记方法，其中，所述遗传标记方法还包括将获得的抗性菌落在冬虫夏草菌培养液中扩繁；优选地，每升所述冬虫夏草菌培养液包含马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-10g、氯化钠1-5g、维生素b 20-100mg和胎牛血清10-100ml；进一步优选地，所述遗传标记方法还包括用荧光显微镜检测扩繁获得的阳性转化子的绿色荧光信号。11.根据权利要求7所述的遗传标记方法，其中，在所述共培养之前，将所述农杆菌用乙酰丁香酮诱导培养5-7个小时至od
660
为0.3-0.5；和/或所述冬虫夏草菌为冬虫夏草菌芽孢；优选地，所述冬虫夏草菌芽孢的浓度为1.0
×
107个/ml。

技术总结
提供了一种用于冬虫夏草菌遗传标记的重组质粒，其包含与绿色荧光蛋白编码序列可操作连接的组成型表达绿色荧光蛋白(GFP)的冬虫夏草菌启动子序列。还提供了包含所述重组质粒的农杆菌菌株和使用所述农杆菌菌株的冬虫夏草菌的遗传标记方法。本发明的遗传标记方法具有可视性、操作方便，可在复杂的环境中特异地检测不同形态的冬虫夏草菌。测不同形态的冬虫夏草菌。测不同形态的冬虫夏草菌。


技术研发人员：吴佩佩 孟茜 秦启联 张继红 张寰 李瑄 王红托 苗麟 郭力
受保护的技术使用者：中国科学院动物研究所
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/6