TT-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用

tt-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物用药领域，尤其涉及tt-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.布洛芬(ibuprofen，ibu)是一种被广泛使用的非甾体类抗炎药(non-st eroidantiinflammatory drugs，nsaids)，常被应用于治疗风湿性疾病、疼痛和发热。同时，它也是一种鲜少被提及和研究的新型污染物。已有一些研究表明ibu对水生动物的影响：部分学者发现ibu对海洋虾类、淡水腹足类等生物的形态、生长、存活、生殖、性激素平衡等有一定影响，在细胞水平上，ibu对淡水双壳类有细胞遗传毒性。
3.ibu被列为是最有效、安全的药物之一。ibu的使用剂量较大，可达1200mg/d。随着ibu的普遍使用，出现了越来越多关于ibu副作用的报道。近年来有研究发现ibu可致人类睾丸损伤、且长期定期服用ibu可能使男性发生“补偿机能减退”病；ibu也能使女性卵巢损伤而导致不孕，女性怀孕前三个月内使用ibu不仅会导致胎儿卵巢损伤，还会致胎儿睾丸的内分泌紊乱和生殖细胞发育异常。研究发现ibu能抑制小鼠卵巢功能：原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡数量均出现不同程度地减少，闭锁卵泡数增加，血清中雌二醇(estradiol，e2)和孕酮浓度降低；研究表明ibu能够抑制子宫肌层收缩，且通过腹腔给药ibu到达子宫具有一定的靶向性。国内外文献几乎没有ibu引起生殖器官损伤相关的预防、治疗研究。因此，研发能预防、治疗由ibu引起的生殖系统损伤的药物非常必要。
4.ibu作为一种nsaids，在体内、外都能抑制cox2-pge2信号通路，我们发现它可通过影响青春期小鼠生殖器官中的cox2、ep2、gas、β-caten in等蛋白的表达来对生殖系统造成损伤。基于此，我们采用tt-10来维护上述蛋白质的稳态，以此防治小鼠卵巢和子宫损伤。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了tt-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。本发明提供一种tt-10小分子在预防雌鼠生殖器官损伤中的应用，对ibu引起的雌鼠卵巢和子宫损伤起预防作用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了tt-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。
8.在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述生殖器官包括：卵巢和/或子宫。
9.在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述生殖器官损伤由非甾体抗炎药物引起。
10.在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述非甾体抗炎药物包括：布洛芬。
11.在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述布洛芬的浓度为50～200μm。
12.在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述tt-10升高雌激素和/或前列腺素e2的含量。
follicle＝次级卵泡,atretic follicle＝闭锁卵泡；nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，m组＝同时给予ibu和tt-10组，b组＝先给予tt-10后给予ibu组，a组＝先给予ibu后给予tt-10组；
29.图6示本发明一实施例tt-10拮抗ibu保护雌性青春期小鼠卵巢的cox2、ep2、β-catenin相关蛋白的差异表达的电泳条带图；其中：nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，m组＝同时给予ibu和tt-10组，b组＝先给予tt-10后给予ibu组，a组＝先给予ibu后给予tt-10组；
30.图7示本发明一实施例tt-10拮抗ibu保护雌性青春期小鼠子宫的病理切片图；其中：nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，m组＝同时给予ibu和tt-10组，b组＝先给予tt-10后给予ibu组，a组＝先给予ibu后给予tt-10组；endometrium＝子宫内膜，myometrium＝子宫肌层,glandulae uterinae＝子宫腺
31.图8示本发明一实施例tt-10拮抗ibu保护雌性青春期小鼠子宫的cox2、ep2、β-catenin相关蛋白的差异表达的电泳条带图；其中：nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，m组＝同时给予ibu和tt-10组，b组＝先给予tt-10后给予ibu组，a组＝先给予ibu后给予tt-10组；
32.图9示本发明的一实施例ibu致体外培养雌鼠卵巢损伤的病理切片图；其中：control＝对照组，low＝低剂量组，medium＝中剂量组，high＝高剂量组；primordial follicle＝原始卵泡,primary follicle＝初级卵泡,secondary follicle＝次级卵泡,atretic follicle＝闭锁卵泡；
33.图10示本发明的一实施例ibu致体外培养雌鼠卵巢损伤的cox2、ep2、gas、β-catenin等相关蛋白的差异表达的电泳条带图；其中：control＝对照组，low＝低剂量组，medium＝中剂量组，high＝高剂量组；
34.图11示本发明的一实施例ibu致体外培养雌鼠子宫损伤的病理切片图；其中：control＝对照组，low＝低剂量组，medium＝中剂量组，high＝高剂量组；endometrium＝子宫内膜，myometrium＝子宫肌层,glandulae uterinae＝子宫腺；
35.图12示本发明的一实施例ibu致体外培养雌鼠子宫损伤的cox2、ep2、gas、β-catenin相关蛋白的差异表达的电泳条带图；其中：control＝对照组，low＝低剂量组，medium＝中剂量组，high＝高剂量组；
36.图13示本发明的一实施例tt-10干预后体外培养雌鼠卵巢的病理切片图；其中：primordial follicle＝原始卵泡,primary follicle＝初级卵泡,secondary follicle＝次级卵泡,atretic follicle＝闭锁卵泡；nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，tt-10-l组＝ibu+低剂量tt-10组，tt-10-m组＝ibu+中剂量tt-10组，tt-10-h组＝ibu+高剂量tt-10组；
37.图14示本发明的一实施例tt-10干预后体外培养雌鼠卵巢的cox2、ep2、β-catenin相关蛋白的差异表达的电泳条带图；其中：nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，tt-10-l组＝ibu+低剂量tt-10组，tt-10-m组＝ibu+中剂量tt-10组，tt-10-h组＝ibu+高剂量tt-10组；
38.图15示本发明的一实施例tt-10干预后体外培养雌鼠子宫的病理切片图；其中：nc＝阴性对照组，pc＝阳性对照组，tt-10-l组＝ibu+低剂量tt-10组，tt-10-m组＝ibu+中剂量tt-10组，tt-10-h组＝ibu+高剂量tt-10组；endometrium＝子宫内膜，myometrium＝子宫肌层,glandulae uterinae＝子宫腺；
catenin蛋白的表达可定性(或半定量)评估生殖器官损伤程度。
54.本发明提供了一种雌性小鼠生殖器官的体外培养方法。
55.雌性小鼠卵巢和子宫体外培养方法：在无菌条件下取出小鼠双侧卵巢和子宫，立即用无菌pbs缓冲液(ph＝7.4)洗涤3次，然后将pbs溶液中的生殖器官在体式显微镜下切成1～2mm3的组织块。后将组织块置于含有无菌transwell小室的12孔培养板中，每个小室大约有3～4个组织块，然后在含有5％co2和95％空气的培养箱中培养，温度37℃。
56.卵巢培养基成分为：不含酚红的dmed/f12培养基，含1％牛血清白蛋白、1％白蛋白、1％抗坏血酸、1％转铁蛋白、1％青霉素-链霉素。子宫培养基成分为：无酚红的dmem/f12培养基，含10％胎牛血清的、1％青霉素-链霉素和100μm抗坏血酸。
57.在本发明中，雌性小鼠生殖器官的体外培养优先用transwell培养小室，将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装小块组织，下室内盛装下层培养液，上下层之间以聚碳酸酯膜相隔，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的组织，从而可以研究下层培养液中的成分对组织生殖毒性的影响。此外本发明中将含有tt-10的培养基使用氢氧化钠或碳酸钠调节ph值至7.35～7.45，使溶液碱性化，平衡酸性物质对组织的损害。
58.本发明提供了一种青春期小鼠生殖器官的组织采集和检测方法。即小鼠经麻醉后腹主动脉取血待检，而后剖腹取出生殖器官；小鼠血液(或器官培养基)离心后取上清液进行性激素检测；小鼠生殖器官进行组织病理学观察，生殖器官组织中关键蛋白用westernblot检测。
59.本发明实施例1～实施例3中，tt-10购自默克公司，德国，雌激素elisa检测试剂盒(上海碧云天公司，产品编号：pe223，产品名称：estradiol elisa kit)；前列腺素e2 elisa检测试剂盒(上海碧云天公司，产品编号:s0168，产品名称：环氧化酶-2(cox-2)抑制剂筛选试剂盒)。
60.所用原料及试剂均可由市场购得。
61.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
62.实施例1ibu致青春期雌性小鼠生殖器官损伤
63.(1)ibu致青春期雌性小鼠生殖器官损伤模型制作
64.①
雌性小鼠体内生殖器官损伤模型：
65.根据中国一位成年女性约50千克体重算，其最高剂量为48mg/kg/day，而未成年人(小儿)口服则最低为15mg/kg/day。20g小鼠给药剂量系数为人类的3.3倍，再根据小鼠体重换算为在雌鼠中的染毒剂量。
66.将ibu悬浮于生理盐水中获得ibu溶液，临用现配，灌胃体积根据雌鼠体重变化而调整，1次/d，连续灌胃7d。
67.配置的4组ibu剂量，如下：
68.对照组：纯生理盐水0mg/kg
·
d；
69.低、中、高剂量染毒组分别为50、100、200mg/kg
·
d。
70.实验期间，每日观察各组雌鼠摄食情况及精神状况。
71.②
雌性小鼠体外生殖器官损伤模型：
72.将培养的组织随机分入4组：低剂量ibu组：50μm；中剂量ibu组：100μm；高剂量ibu
组：200μm；对照组为等体积dmso。ibu溶解在dmso中，所有的实验和对照孵育溶液的终浓度为0.1％dmso。而后根据卵巢和子宫的培养方法进行培养。
73.(2)ibu致青春期雌性小鼠生殖器官损伤的雌激素、前列腺素e2检测从上述ibu致青春期雌鼠生殖器官损伤模型的雌鼠腹主动脉取血离心(转速3000r/min、离心半径160mm、离心时间10min)，取上清，参照雌激素和前列腺素e2 elisa检测试剂盒说明书，加入相关检测液后，使用自动酶标仪测定样本的吸光度数值，根据标准曲线换算成雌激素、前列腺素e2含量。
74.(3)ibu致青春期雌性小鼠生殖器官损伤的组织采集
75.雌鼠经乙醚麻醉取腹主动脉取血后迅速剖腹取出生殖器官(卵巢和子宫)。一部分用于体积测量、质量称量，置于4％多聚甲醛固定液用于制作病理切片；一部分则置于含有ripa裂解液的ep管中用于蛋白质检测。
76.(4)ibu致青春期雌性小鼠生殖器官损伤的组织病理学观察
77.将固定后的生殖器官从低浓度到高浓度乙醇分级脱水，包埋在石蜡中，然后以5μm间隔连续切片，苏木精-伊红(he)染色和密封。每隔3张切片取1片，每张切片随机选6个视野进行观察。
78.(5)ibu致青春期雌鼠生殖器官损伤模型关键蛋白检测
79.生殖器官标本组织置于ripa裂解液，4℃条件下匀浆后取上清液即为总蛋白液，而后用二辛可宁酸法进行蛋白定量，最后加入0.1％苯甲基磺酰氟并冻存。
80.将上述总蛋白加入上样缓冲液煮沸5min进行变性，变性电泳分离采用10％sds-page胶，上样量10μg/孔，电泳参数：浓缩胶80v，20min；分离胶120v，90min。然后，转聚偏二氟乙烯(pvdf)膜100v，120min。用5％脱脂奶粉封闭1h；加western稀释液对一抗进行稀释(anti-cox2单克隆抗体1：1000，anti-ep2单克隆抗体1：1000，anti-gas单克隆抗体1：1000，anti-β-catenin单克隆抗体1：1000，β-actin单克隆抗体1：3000)，4℃孵育过夜；1
×
tbst洗膜3次，10min/次。加入tbst稀释的二抗(抗兔hrp-lgg1∶8000)，摇床室温孵育1h；1
×
tbst洗膜3次，10min/次。
81.采用化学发光成像系统，进行拍照显影。
82.实施例2tt-10拮抗ibu保护体外雌鼠生殖器官
83.①
雌鼠实验分组：适应性饲养1周后，雌鼠按体重随机分为5组：
84.阳性对照组(pc)：经口给予ibu 100mg/kg
·
bw/d，连续7天；
85.阴性对照组(nc)：经口给予等体积生理盐水7天；
86.m组：同时灌胃ibu(100mg/kg
·
bw/d)和腹腔注射tt-10(10mg/kg
·
bw/d)连续7天；
87.b组：在灌胃ibu(100mg/kg
·
bw/d)之前24小时腹腔注射tt-10(10mg/kg
·
bw/d)，连续7天；
88.a组：在灌胃ibu(100mg/kg
·
bw/d)7天后腹腔注射tt-10(10mg/kg
·
bw/d)7天。
89.②
体外培养组织分组：
90.ibu致体外培养卵巢、子宫损伤的实验结果发现，100μm ibu可致体外培养卵巢、子宫出现明显的组织学、cox2-pge2信号通路等分子生物学指标改变，因此我们选择100μm ibu致体外卵巢、子宫损伤模型来进行cox2-pge2激活实验。
91.实验分为5组：
92.阳性对照组(pc)：100μm ibu；
93.阴性对照组(nc)：等体积dmso；
94.tt-10-l组：100μm ibu+5μm tt-10；
95.tt-10-m组：100μm ibu+10μm tt-10；
96.tt-10-h组：100μm ibu+20μm tt-10；
97.(2)tt-10拮抗ibu保护青春期雌鼠生殖器官的雌激素、前列腺素e2检测，与实施例1中步骤(2)相同，具体参照实施例1。
98.(3)tt-10拮抗ibu保护青春期雌鼠生殖器官的组织采集，与实施例1中步骤(3)相同，具体参照实施例1。
99.(4)tt-10拮抗ibu保护青春期雌鼠生殖器官的组织病理学观察，与实施例1中步骤(4)相同，具体参照实施例1。
100.实施例3ibu或tt-10暴露后繁殖实验
101.前期研究发现，实施例2模型中m组(同时给予ibu和tt-10组)对i bu致小鼠卵巢和子宫损伤保护效果最好，因此从实施例2模型的阴性对照组、阳性对照组和m组中随机选择雌鼠与正常雄鼠进行繁殖实验，以孕鼠所产子代小鼠为观察对象，通过计算胎仔数量评价ibu暴露对小鼠生殖功能的影响及tt-10拮抗ibu保护青春期小鼠生殖功能的效果。
102.小鼠实验分组：
103.①
阴性对照组雌鼠与阴性对照组雄鼠合笼；
104.②
阳性对照组雌鼠和阴性对照组雄鼠合笼；
105.③
m组(tt-10干预组)雌鼠和阴性对照组雄鼠合笼。
106.每组雌鼠20只，雄鼠10只，耳标标记，晚上22:00合笼，次日8:00将雄鼠取出，观察合笼后的雌鼠阴栓确认受精后将其置入新的饲养笼单独饲养，完成一代繁殖实验。仔鼠出生时，计数每只孕鼠产仔数与性别。
107.实验结果：
108.(1)tt-10干预前雌性小鼠结果
109.体内外实验中，随着ibu剂量增加，小鼠体重、卵巢和子宫重量减轻，雌激素和前列腺素e2水平降低(如表1)，染毒组卵巢和子宫的脏器系数降低，卵巢中各级卵泡数量减少(如表2、表3、图1、图9)，子宫组织结构紊乱、皱襞不明显，子宫壁厚度降低、肌层与内外膜界限不清(如图3、图11)，以上结果提示ibu参与了青春期小鼠生长发育，导致成年期体重减轻，剂量依赖性雌激素分泌减少，子宫和卵巢病理改变。
110.同时，如图2、图4、图10、图12蛋白结果所示，染毒组cox2表达下降，抑制cox2-pge2信号通路，提示ibu在体内和体外参与卵巢和子宫的剂量依赖性损伤。
111.(2)tt-10干预后雌性小鼠结果：
112.体内外实验中，随着tt-10剂量的升高，tt-10组卵巢和子宫组织切片中病理损伤逐渐减少，卵巢可见多个不同发育阶段的卵泡(如表2、表3、图5、图13)，子宫内膜、肌层和外膜结构清晰、皱襞明显(如图7、图15)，逐渐趋于对照组。同时，tt-10组卵巢和子宫雌激素和前列腺素e2浓度均升高(如表1)。
113.如图14、图16所示，体外实验中，tt-10通过激活cox2-pge2信号通路对ibu致卵巢和子宫损伤起保护作用，其中tt-10-m组的作用最大；如图6、图8所示，体内实验中，同时给
予ibu和tt-10组对ibu致小鼠卵巢和子宫损伤保护效果最好，先tt-10后ibu组效果次之，先ibu后tt-10组效果最差，提示tt-10对ibu致卵巢和子宫损伤起预防作用。
114.综上，tt-10剂量一定程度越大，或者同时给药时，对ibu造成卵巢和子宫损伤的保护效果越好。
115.(3)繁殖实验结果：
116.如表4所示，计算每组胎仔鼠数量发现，ibu组胎仔数明显低于对照组，tt-10干预组胎仔数明显高于ibu组，提示小鼠青春期暴露于ibu，虽然亲代和子代小鼠外观均无异常，但可造成其生殖功能受损，繁殖能力下降，而tt-10可以有效保护青春期小鼠免受ibu引发的生殖系统损伤。
117.表1血清/培养基中的雌二醇、前列腺素e2浓度
[0118][0119][0120]
其中：表1结果为平均值
±
标准差，体重、子宫重量及子宫脏器系数(n＝14)，e2、pge2(n＝8)，anova，t检验，*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001和****p＜0.0001表示ibu暴露组与对照组之间存在显著差异。
[0121]
表2小鼠实验卵巢组织卵泡计数
[0122][0123]
表2中的卵巢组织卵泡计数，n＝6，表3组织培养实验卵巢组织卵泡计数
[0124][0125][0126]
表3中的卵巢组织卵泡计数，n＝6，表4繁殖试验胎仔出生基线数据
[0127] conibutt-10雌鼠出生数/只715262雄鼠出生数/只675865胎仔数138110127
[0128]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.tt-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生殖器官包括：卵巢和/或子宫。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生殖器官损伤由非甾体抗炎药物引起。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非甾体抗炎药物包括：布洛芬。5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述tt-10升高雌激素和/或前列腺素e2的含量。6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述tt-10激活cox2-pge2信号通路。7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为5～10mg/kg
·
bw/d。8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射、静脉注射和/或腹腔注射中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及生物用药领域，尤其涉及TT-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。本发明提供了TT-10在制备预防和/或治疗生殖器官损伤的药物中的应用。本发明提供一种TT-10小分子在预防雌鼠生殖器官损伤中的应用，对IBU引起的雌鼠卵巢和子宫损伤起预防作用。用。


技术研发人员：朱勇飞 王晴 白铭新 辛冰艳 李帆 王旭宁
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/10/6