一种Qu@β-CD纳米复合材料、制备与其作为群体感应抑制剂的应用

一种qu@
β-cd纳米复合材料、制备与其作为群体感应抑制剂的应用
技术领域
1.本发明属于功能材料制备及膜技术领域，具体涉及一种槲皮素/β-环糊精(qu@β-cd)纳米复合材料、制备与其作为群体感应抑制剂的应用。


背景技术：

2.随着我国生态文明建设及城市化发展的不断深入推进，污水处理及再生利用成为环保行业关注的重点领域。超滤技术被证实能够有效去除污水中的有机物、细菌、胶体等污染物，且膜具备微/纳米级可调的孔径分布，可以从水中选择性去除或保留目标溶质。然而，实际运行过程中，产生的生物污染问题，尤其是主要由微生物和胞外聚合物(eps)构成的不可逆污染，成为目前膜法水处理面临的重要障碍。群体感应是一种微生物之间的信号传输方式，由微生物自发产生并释放特定信号分子，通过识别、感知周围信号分子浓度，从而调控微生物群体生理特征，如生物膜形成。而干扰群体感应是一种通过群体感应抑制剂降低或淬灭微生物之间的群体感应来终止信号传输的过程，从而降低微生物间的相互作用并抑制生长代谢，被证实是一种能够从根本上解决生物污染问题的方法。
3.槲皮素(qu)作为一种多羟基、黄酮类化合物，被证实是天然的群体感应抑制剂，能够与信号分子竞争性结合受体，阻断细胞间的化学信号传递信息和核酸合成，从而控制生物膜形成。与其它抑制剂相比，qu除了具有广谱的群体感应干扰效应(包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌等)，亦具有较强的抑菌性及抑制氧化应激、调节细菌ros的产生、破坏细菌细胞膜等多种生物学活性，且被证实在较低的剂量浓度下，可达到理想的效果。但是qu与其它抑制剂类似，存在水溶性差及稳定性低的缺陷。近年来关于qu干扰群体感应的研究大都与其它材料进行结合提高qu的群体感应干扰作用，增强了qu的溶解度、稳定性及生物利用度。但是关于β-cd改性结合qu并用于群体感应抑制剂的研究未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种qu@β-cd纳米复合材料、制备与其在群体感应抑制剂的应用。其中，β-cd具有特殊空腔结构、丰富的羟基(-oh)反应位点、外侧亲水、内部疏水的性质。β-cd的疏水性空腔能够为qu提供作用位点，从而形成主-客包合物，提高了qu的稳定性、溶解度，并具有控释、活性保护、延长持效期等优势。具体的，本发明采用下述技术方案实现：
5.本发明的一种qu@β-cd纳米复合材料的制备方法，其是将qu溶液逐滴加入到β-cd水溶液中，于45-65℃搅拌1-3h，再将温度升高到70-90℃，搅拌1-2h，再降至常温搅拌4-6h，静置抽滤洗涤干燥。
6.上述制备方法中，于45-65℃搅拌1-3h，使得反应更充分；将温度升高到70-90℃，搅拌1-2h，其作用是将搅拌温度升高，有助于有机溶剂挥发去除。
7.上述所述的制备方法中，优选的，所述qu与β-cd的摩尔比为1:1-1:4。发明人研究发现，摩尔比太低会影响后续效果，摩尔比太高会导致大量的qu不能被包络完全。β-cd水溶液浓度不做特别要求。
8.上述所述的制备方法中，优选的，所述qu溶液所采用的溶剂包括甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及去离子水中的一种或两种，优选甲醇。qu溶液浓度不做特别要求。
9.上述所述的制备方法中，优选的，所述β-cd在45-65℃配制成水溶液，更优选在50-60摄氏度下进行。
10.上述所述的制备方法中，优选的，所述将qu溶液逐滴加入到β-cd水溶液的过程中，控制温度45-65℃，更优选温度50-60℃。
11.本发明利用具有包络作用、三维立体结构、亲水性β-cd作为主体纳米材料，qu作为客体，利用一锅法合成得到qu@β-cd主-客体包络纳米复合材料，在此过程中，对材料添加顺序、反应温度、材料添加比例、洗涤方式及干燥处理方式等进行调节，在最优状态下合成较高生物利用度的qu@β-cd纳米复合材料；所述的干燥处理方式包括冷冻干燥、高温烘干及常温真空干燥等。所述洗涤是利用有机溶剂及去离子水交替洗涤，并采用真空抽滤及过滤两种方式，洗涤可以去除未反应完全的qu和β-cd单体。
12.本发明上述所述制备方法得到的qu@β-cd纳米复合材料，其为浅绿色粉末状固体，qu颗粒吸附在β-cd颗粒表面，包合后形成β-cd包络的qu结构，该结构趋向于块状立方结构且相对均匀。
13.本发明所述的qu@β-cd纳米复合材料是经过β-cd改性后的qu。其中，β-cd具有特殊空腔结构、丰富的羟基(-oh)反应位点、外侧亲水、内部疏水的性质。β-cd作为主体纳米材料具有包络作用、三维立体结构、亲水性作用，基于此，其可与作为客体的qu形成主-客体包络纳米结构。β-cd的疏水性空腔能够为qu提供作用位点，从而形成主-客包合物，提高了qu的稳定性、溶解度，并具有控释、活性保护、延长持效期等优势。qu@β-cd纳米复合材料能够在较长时间内保持对生物膜生长的控制作用，从而使得其可作为群体感应抑制剂应用。
14.所述的qu@β-cd纳米复合材料在超滤膜污染控制中的应用，所述的超滤膜可以是纤维素、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚砜、聚偏氯乙烯、聚丙烯腈、改性丙烯酸聚合物、交链的聚乙烯醇、磺化聚砜及聚砜酰胺等等材质，更优选聚偏氟乙烯(pvdf)聚砜、磺化聚砜及聚砜酰胺超滤膜。
15.本发明还提供了一种提高群体感应抑制剂qu干扰作用的方法，其是采用β-cd对qu进行改性，制成上述所述的qu@β-cd纳米复合材料。
16.本发明探索出了一种qu与β-cd复合材料的制备方法，保留qu的生物利用度，不破坏其结构和群体感应干扰效应，以增强对超滤膜生物污染的控制作用，对解决抑制剂应用局限性及膜污染问题具有重要的意义。
17.本发明的利用具有包络作用的β-cd作为主体纳米材料对客体qu进行包络，采用一锅法合成qu@β-cd纳米复合材料；考察qu@β-cd复合材料在错流系统中对聚偏氟乙烯(pvdf)超滤膜的生物污染控制，基于复合材料中qu的群体感应干扰效应，有效降低了pvdf膜表面的生物膜量，并影响了微生物的生长周期，具有较强的抗生物污染性能；长效实验表明，经过β-cd改性后的qu能够在较长时间内保持对生物膜生长的控制作用。
18.本发明的qu@β-cd纳米复合材料具有以下优点：(1)本发明中用到的一锅合成法有
普遍的适用性；(2)本发明中合成的qu及β-cd纳米复合材料提高了qu的稳定性，增强了qu的生物利用度，实现了对超滤膜污染的控制，在连续运行实验中有效缓解了通量下降和对多种细菌的抑菌效果；(3)本发明选取的针对qu稳定性提高的主体材料β-cd成本低廉且来源广泛，可推广应用。
附图说明
19.图1为本发明实施案例制备的qu@β-cd复合材料(a)和单一qu(b)的sem图，根据形貌结果，qu成功被β-cd包络，仅观察到少量qu单体形态；
20.图2为本发明实施案例制备的qu@β-cd复合材料(a)和单一qu(b)的水溶性变化图，在试管中，qu@β-cd溶解性优于单一qu，基于β-cd的包络作用，提高了qu的水溶性；
21.图3为本发明实施案例制备的qu@β-cd对大肠杆菌基因表达的影响结果图，群体感应基因luxs，lsrr大幅度下调，毒力基因sdia以及鞭毛运动基因和黏附蛋白的基因fimh，flhd，tnaa都在一定程度下调，说明材料对于大肠杆菌的群体感应调控起到重要的抑制作用；
22.图4为本发明实施案例制备的qu@β-cd长效实验中对通量控制效果图，抑制剂显著缓解了动态生物污染过程中的水通量下降；
23.图5为本发明实施案例制备的qu@β-cd对生物膜生长影响变化图，抑制剂的加入控制了生物膜的生长，且随着qu@β-cd复合材料浓度的增加，控制效果增强。
具体实施方式
24.下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
25.实施例1
26.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法：将3.75g(3.3mmol)β-cd溶解于80ml去离子水中，在恒温50℃条件下充分搅拌溶解；将1g(3.3mmol)qu溶于50ml甲醇中，待qu完全溶解后逐滴加入到β-cd水溶液中，继续50℃条件下搅拌2h；完全反应后，将温度升高为80℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将温度降至25℃，继续搅拌5h；充分静置，采用真空抽滤的方式用去离子水和甲醇依次洗脱，去除未反应完全的qu和β-cd单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到浅绿色粉末状固体qu@β-cd纳米复合材料；在扫描电镜(sem)条件下的结构图像如图1所示，sem图像显示单一qu形貌松散，qu@β-cd纳米复合材料呈包络一体形态。
27.在50ml离心管中加入(10ml)去离子水，将制备好的qu@β-cd纳米复合材料(0.01g)及未改性的单一qu(0.01g)分别加入离心管中，超声溶解10min，静置2h，观察qu@β-cd及单一qu的水溶性，如图2，溶解性结果显示qu经β-cd包络后溶解度显著提高，而单一qu在静置后沉淀较多，说明水溶性较差。
28.实施例2
29.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法：将3.75gβ-cd溶解于80ml去离子水中，在恒温50℃条件下充分搅拌溶解；将1g qu溶于50ml甲醇中，待qu完全溶解后逐滴加入到β-cd水溶液中，继续的50℃条件下搅拌2h；完全反应后，将温度升高为80℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将
温度降至25℃，继续搅拌5h；充分静置，采用真空抽滤的方式用按照先甲醇后去离子水的顺序洗脱，去除未反应完全的β-cd和qu单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到qu@β-cd纳米复合材料。
30.利用实时荧光定量pcr技术检测分析qu@β-cd通过干扰群体感应进而对微生物基因表达的影响(图3)。将qu@β-cd复合材料与大肠杆菌共存暴露4h，观察到群体感应基因luxs(ncbi 947168)，lsrr(ncbi 946070)大幅度下调，毒力基因sdia(ncbi 946421)以及鞭毛运动基因和黏附蛋白的基因fimh(ncbi 948847)，flhd(ncbi 945442)，tnaa(ncbi 948221)都发生明显下调，说明qu@β-cd对大肠杆菌的群体感应调控起到重要的抑制作用，具有较强的生物利用度。
31.实施例3
32.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法：将3.75gβ-cd溶解于80ml去离子水中，在恒温50℃条件下充分搅拌溶解；将1g qu溶于50ml甲醇中，待qu完全溶解后逐滴加入到β-cd水溶液中，继续的50℃条件下搅拌10h；完全反应后，将温度升高为80℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将温度降至25℃，继续搅拌2h；充分静置，采用真空抽滤的方式用去离子水和甲醇依次洗脱，去除未反应完全的qu和β-cd单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到qu@β-cd纳米复合材料。
33.本发明考察了以聚偏氟乙烯(pvdf)为典型超滤膜，考察qu@β-cd复合材料对动态错流系统中膜表面生物污染的控制作用。生物污染实验基于污水处理厂二级出水水质特征配制的合成废水(柠檬酸钠1.2mm，0.8mm nh4cl，0.5mm nahco3，k2hpo40.2 mm，8.0mmnacl，0.2mm cacl2·
h2o，0.15mm mgso4·
7h2o)作为进水溶液，考察qu群体感应干扰对pvdf超滤膜的生物污染控制作用；在合成废水中添加不同种类菌株，大肠杆菌mg1655和铜绿假单胞菌atcc6538等污水中分离的典型菌株；在进水中加入qu@β-cd纳米复合材料及未添加复合材料的进行对照，在此过程中，连续监测错流超滤系统中通量宏观性能的变化(图4)，考察菌株对qu调控作出的响应，结果表明抑制剂显著缓解了动态生物污染过程中的水通量下降；
34.基于结晶紫染色法对长时间qu干扰下的生物膜形成过程进行定量、定性测定(图5)。将od
600
＝1的模式菌株(大肠杆菌mg1655)培养液与不同浓度抑制剂加入96孔板中，在37℃培养箱内进行不同天数(1，2，3，4，5d)的恒温培养，利用结晶紫染色液进行染色，并在570nm处测量吸光度，定量测定od值，从结果可以看出，与对照组相比，复合材料添加的孔中颜色较浅，说明生物膜量较少，是由于qu通过抑制微生物之间的群体感应，显著降低了生物膜量，且随着抑制剂添加剂量增加，对生物膜的控制效果更明显。由于单一的qu生物利用度很低，水溶性很差，无法进行实验，对照组采用的抑制剂浓度为0即空白对照不添加抑制剂。
35.实施例4
36.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法中：将3mmolβ-cd溶解于100ml去离子水中，在恒温48℃条件下充分搅拌溶解；将1mmol qu溶于50ml甲醇中，待qu完全溶解后逐滴加入到48℃的β-cd水溶液中，继续48℃条件下搅拌2h；完全反应后，将温度升高为80℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将温度降至室温，继续搅拌5h；充分静置，采用真空抽滤的方式用去离子水和甲醇依次洗脱，去除未反应完全的qu和β-cd单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到浅绿色粉末状固体qu@β-cd纳米复合材料。
37.实施例5
38.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法中：将2mmolβ-cd溶解于80ml去离子水中，在恒温55℃条件下充分搅拌溶解；将1mmol qu溶于50ml n,n-二甲基甲酰胺中，待qu完全溶解后逐滴加入到β-cd水溶液中，继续55℃条件下搅拌2h；完全反应后，将温度升高为85℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将温度降至室温，继续搅拌5h；充分静置，采用真空抽滤的方式用去离子水和甲醇依次洗脱，去除未反应完全的qu和β-cd单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到浅绿色粉末状固体qu@β-cd纳米复合材料。
39.实施例6
40.qu/β-cd纳米复合材料的制备方法中：将4mmolβ-cd溶解于200ml去离子水中，在恒温60℃条件下充分搅拌溶解；将1mmol qu溶于50ml甲醇中，待qu完全溶解后逐滴加入到β-cd水溶液中，继续60℃条件下搅拌2h；完全反应后，将温度升高为75℃，搅拌1h，使甲醇挥发；将温度降至常温25℃，继续搅拌5h；充分静置，采用真空抽滤的方式用去离子水和甲醇依次洗脱，去除未反应完全的qu和β-cd单体；置于冷冻干燥器中干燥48h，最终得到浅绿色粉末状固体qu@β-cd纳米复合材料。
41.应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。

技术特征：
1.一种qu@β-cd纳米复合材料的制备方法，将qu溶液逐滴加入到β-cd水溶液中，于45-65℃搅拌1-3h，再将温度升高到70-90℃，搅拌1-2h，再降至常温搅拌4-6h，静置抽滤洗涤干燥。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述qu与β-cd的摩尔比为1:1-1:4。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述qu溶液所采用的溶剂包括甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及去离子水中的一种或两种。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-cd在45-65℃配制成水溶液。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将qu溶液逐滴加入到β-cd水溶液的过程中，控制温度45-65℃。6.由权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的qu@β-cd纳米复合材料，其为浅绿色粉末状固体，槲皮素颗粒吸附在环糊精颗粒表面，包合后的结构为立方结构且均匀。7.权利要求6所述的qu@β-cd纳米复合材料作为群体感应抑制剂的应用。8.权利要求6所述的qu@β-cd纳米复合材料在超滤膜污染控制中的应用。9.一种提高群体感应抑制剂qu干扰作用的方法，其特征在于，采用β-cd对qu进行改性，形成权利要求6所述的qu@β-cd纳米复合材料。

技术总结
本发明公开了一种Qu@β-CD纳米复合材料、制备与其作为群体感应抑制剂的应用，属于功能材料制备及膜技术领域，本发明利用具有包络作用的β-CD作为主体纳米材料对客体Qu进行包络，采用一锅法合成Qu@β-CD纳米复合材料；考察Qu@β-CD复合材料在错流系统中对聚偏氟乙烯(PVDF)超滤膜的生物污染控制，基于复合材料中Qu的群体感应干扰效应，有效降低了PVDF膜表面的生物膜量，并影响了微生物的生长周期，具有较强的抗生物污染性能；长效实验表明，经过β-CD改性后的Qu能够在较长时间内保持对生物膜生长的控制作用。本发明选用的Qu及β-CD材料效果明显、价廉易得、对环境无污染的，制备方法简单，反应条件可控，适用于规模化工业生产。适用于规模化工业生产。适用于规模化工业生产。


技术研发人员：李媛 马妍菁 代继祥 吴李君
受保护的技术使用者：安徽大学
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/7