高效合成2-苯乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于基因工程改造领域，具体涉及高效合成2-苯乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.2-苯乙醇(2-pe)是一种具有玫瑰气味的芳香醇，虽天然存在于玫瑰和百合等多种植物的精油中，但多数情况下浓度太低，无法提取。采用微生物转化法生产天然的2-苯乙醇保留了产品的单纯、天然的特点，又具有成本低、周期短、效率高等优点，且产品的质量符合国际标准。研究表明，酵母细胞具有从头合成2-苯乙醇的代谢途径，也可通过氨基酸分解代谢途径将l-苯丙氨酸(l-phe)直接转化为2-苯乙醇。1907年艾利希在酵母培养物中添加l-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量得到大幅提高，给利用酵母菌生物转化生产天然2苯乙醇的产业化带来了希望。
3.和许多醇类物质一样，高浓度的2-pe对微生物有一定的毒性，例如损伤细胞膜功能、影响细胞内能量代谢和积累活性氧ros破坏细胞体内氧化还原状态。浓度介于2～3g/l的2-pe能完全抑制多种细菌和真菌的生长，因而已经作为杀菌剂在医药行业中应用。此外，酵母在发酵过程中除生产2-pe外也会产生大量乙醇，乙醇和2-pe联合作用产生的毒性比它们各自产生的毒性作用累加还要高，这是微生物转化法生产2-pe工艺中产物浓度低的主要原因，也是生物法生产天然2-pe的瓶颈。因此，为了更有效地生产2-pe，培育一株健壮的菌株是必要的。提高耐受性基因工程，如全球转录机械工程(gtme)、进化工程、组学技术和基因工程的组合以及通过基因组规模筛选的逆向工程，已被应用于提高许多有机溶剂的耐受性，从而有助于经济和高效的生产。虽然增强耐受性并不总是导致产量的提高，但在各种研究中，提高耐受性直接促进了产物的生产。
4.由于遗传背景的变化，酵母菌株长期受到高浓度抑制剂的影响可以获得显着的耐受性。长期适应是模仿环境压力导致的自然选择的一种方式。由于与抑制剂耐受性相关的潜在分子机制的复杂性，进化工程策略已被用作在存在抑制化合物的情况下提高酵母菌株发酵能力的方法。对多组合诱变策略与适应性进化相结合的技术手段获得的高耐受2-pe的菌株进行illumina二代测序和pacbio三代测序比较基因组学分析，根据2-pe对细胞的损伤途径：能够破坏细胞膜功能、影响细胞内atp能量代谢和积累活性氧ros破坏细胞体内氧化还原状态，筛选出合适的抗逆元件进行性能表征来进一步把提高代谢通量与抗逆性能，为新的抗逆元件的挖掘提供了更多可能性。gsh编码谷胱甘肽合成酶，将甘氨酸和l-γ-谷氨酰-l-半胱氨酸转化为谷胱甘肽。谷胱甘肽的增加减轻了ros的积累、脂质过氧化和细胞膜的损伤，进而提高了2-苯乙醇的耐受性和产量。slc催化磷脂合成的第一步，磷脂是细胞膜的重要组成部分，因此在调节细胞膜成分方面发挥核心作用。slc表达的增加可能改变了细胞膜磷脂的组成，例如膜磷脂头的分布(例如pe、pg和cl)以及磷脂脂肪酸尾部的长度和不饱和百分比(例如c16：0、c16：1和c18：1)，从而提高了细胞膜的完整性，导致了更高的2-pe耐受性。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种高效合成2-苯乙醇的基因工程菌。
6.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种高效合成2-苯乙醇的基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达内源抗逆元件ampk，gdh，strap和tcyc及外源抗逆元件gsh和slc得到；
8.所述内源抗逆元件来源于季也蒙毕赤酵母；
9.所述外源抗逆元件gsh来源于解脂耶氏酵母；
10.所述外源抗逆元件slc来源于季也蒙毕赤酵母；
11.所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母菌。
12.作为一种优选的实施方式，所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母ylg18，其保藏号为cctccno：m 2020638。
13.作为一种优选的实施方式，所述内源抗逆元件来源于季也蒙毕赤酵母ea20，其保藏号为cctcc no：m 2022053。
14.作为一种优选的实施方式，所述外源抗逆元件gsh的geneid为5124237，gsh的gene id为34714842。
15.本发明的第二目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，包括：分别构建内源抗逆元件ampk，strap和tcyc的共表达质粒与gdh的重组表达质粒；
16.将所述共表达质粒和重组表达质粒线性化后，通过酵母转化试剂盒导入宿主菌，获得表达内源抗逆元件的重组宿主菌；
17.构建外源抗逆元件gsh，slc的共表达质粒，将其线性化后通过酵母转化试剂盒导入重组宿主菌，获得所述基因工程菌。
18.作为一种优选的实施方式，用于表达内源抗逆元件和外源抗逆元件的载体质粒为113-gpd-tef质粒。
19.本发明的第三目的在于提供上述基因工程菌在合成2-苯乙醇中的应用。
20.一种具体的应用方式为：将所述基因工程菌进行种子培养后，种子液接种至发酵培养进行发酵培养，合成2-苯乙醇。
21.作为一种优选的实施方式，所述基因工程菌以葡萄糖为底物发酵合成2-苯乙醇。
22.本发明结合内源抗逆元件和外部抗逆元件对宿主菌进行基因工程改造，获得了对2-苯乙醇具有高耐受性且合成效率高的基因工程菌，提高了2-苯乙醇的产量，为2-苯乙醇合成提供了新的生产菌株。
附图说明
23.图1比较基因组分析抗逆元件代谢示意图。
24.图2是工程菌株e-ea20、诱变菌株ea20和原始菌株wt的斑点稀释对照结果。
25.图3是工程菌株e-ea20、诱变菌株ea20和原始菌株wt摇瓶发酵合成2-pe结果。
26.图4是工程菌株gsh-slc-e-ea20、工程菌株e-ea20和原始菌株wt的斑点稀释对照结果。
27.图5是工程菌株gsh-slc-e-ea20、工程菌株e-ea20和原始菌株wt摇瓶发酵合成2-pe结果线。
28.图6是工程菌株gsh-slc-e-ea20在发酵罐放大实验中发酵液不同时间的原料、产物含量。
具体实施方式
29.实施例使用的meyerozyma guilliermondii ylg18和meyerozyma guilliermondii ea20已分别公开于本技术人的在先申请cn112442452a(保藏号为cctcc no：m 2020638)和cn114574374a(保藏号为cctcc no：m 2022053)，抗逆元件ampk，tcyc，strap和gdh均来源于菌株ea20，具体基因序列由基因组比对ncbi查询确认获得并由基因组提取合成，具体如seq id no：1-4所示。
30.slc基因序列geneid:5124237，gsh基因序列gene id:34714842。
31.所用113质粒山东大学祁庆生课题组馈赠，为现有公开质粒。113(113-gpd-tef)质粒：相关特性为具有ori，ampr，ura3，pgpd，txpr2，ptef-in，tcyc1，loxp，t7 promater，t3 promoter。
32.实施例使用的培养基如下：
33.(1)ypd种子培养基：酵母粉10g/l；蛋白胨20g/l；葡萄糖20g/l。
34.(2)lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l
35.(3)合成发酵培养基(摇瓶)：100x salt(盐溶液)：10ml/l；微量元素trace：1ml/l；tris乙磺酸：2.292g/l；ynb 0.5g/l；na2hpo
4 20g/l；柠檬酸三钠10g/l；l-苯丙氨酸8g/l；葡萄糖40g/l(分消)。
36.(4)合成发酵培养基(发酵罐)：100x salt(盐溶液)：10ml/l；微量元素trace：1ml/l；tris乙磺酸：2.292g/l；ynb 0.5g/l；na2hpo
4 20g/l；柠檬酸三钠10g/l；l-苯丙氨酸10g/l；葡萄糖60g/l(分消)。
37.100x salt(盐溶液)：nacl 100g/l；mgcl2·
6h2o 50g/l；kh2po4 20g/l；nh4cl 30g/l；kcl 30g/l；cacl2·
2h2o 1.5g/l。
38.(5)微量元素trace：hcl 25％solution,w/w)10ml/l；fecl2·
4h2o 1.5g/l；cocl2·
6h2o0.19g/l；mncl2·
4h2o 0.1g/l；zncl
2 0.07g/l；h3bo
3 0.006g/l；na2moo4·
2h2o 0.036g/l；nicl2·
6h2o 0.024g/l；cucl2·
2h2o 0.002g/l。
39.(6)抗性筛选固体培养基：千分之一氨苄卡那霉素；琼脂粉20g/l；其余与lb培养基相同。
40.(7)hph抗性筛选培养基：0.2g/l hph；琼脂粉20g/l；其余与酵母合成发酵培养基(摇瓶)相同。
41.配制好的培养基等溶液均于高压灭菌锅进行115℃、20min灭菌。固体培养基于超净台内倒制。
42.实施例中2-苯乙醇(2-pe)和l-苯丙氨酸(l-phe)测量方法：
43.利用高效液相色谱仪hplc(agilent technologies 1260)检测发酵上清液中的l-phe与2-pe浓度。具体检测方法为：将发酵液离心取上清液稀释一定的倍数，利用0.22μm直径的水系滤膜对稀释液进行过滤以除去发酵液中菌体、蛋白等杂质。检测物质用到的色谱柱为c18column(acclaimtm，120，5μm，4.6
×
250mm)；流动相为50％甲醇与50％纯水；流速为0.6ml/min；柱温为30℃；紫外检测波长为210nm；样品进样量为10μl。所用标样现配
现用，且绘制标准曲线。
44.实施例中工程菌株的斑点稀释对照耐受性实验、摇瓶发酵培养方式如下：
45.①
斑点稀释对照耐受性实验；
46.将工程菌株接种至含有葡萄糖的ypd种子培养基生长至对数生长期后，收集大约1
×
108个细胞于1ml灭菌的离心管内。对收集的菌液离心后用ph为7.0的1ml生理盐水(0.9mol/l)洗涤重悬，重复操作两次。将洗涤重悬后的工程菌株按照10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
等梯度按照1ul的菌液量滴在含有0～6g/l的2-pe固体培养基上进行斑点稀释对照耐受性实验，于30℃培养箱培养1-2d。观察对比菌株耐受生长情况。
47.③
摇瓶发酵培养；
48.将工程菌株接种至含有葡萄糖的ypd种子培养基生长至对数生长期后，按照1％的接种量接种至以l-phe为唯一氮源的合成发酵培养基内发酵生产2-pe，考察其发酵生长和合成2-pe性能。发酵参数为摇瓶容量50ml，发酵温度30℃，发酵转速200rpm，ph 5.5，取出1ml的发酵液，离心取上清液，利用高效液相色谱检测2-pe产量。
49.实施例使用的引物及序列如下：
[0050][0051]
实施例1
[0052]
本实施例具体说明重组工程菌株gsh-slc-e-ea20的构建方法。
[0053]
(1)对菌株ea20与菌株ylg18进行illumina二代测序和pacbio三代测序比较基因组学分析(图1)，针对2-pe损伤细胞途径筛选了四个潜在的抗逆元件进行功能分析，分析结果表明调控基因strap调控细胞膜磷脂和甘油组成，内吞作用，增强季也蒙毕赤酵母细胞膜
的完整性；合成基因gdh提高菌株体内谷胱甘肽含量，将谷氨酸转化为tca循环中间物α-酮戊二酸(α-kg)回补三羧酸循环的加速调控提高菌株代谢活力；合成基因ampk加速糖酵解途径促atp的合成提高细胞代谢活性；运输基因abc转运蛋白tcyc调控膜蛋白功能和细胞膜内能量调节，调节膜的通透性。
[0054]
以上述四个具有潜在抗逆性能的差异基因：tcyc、gdh、ampk、strap作为下一步代谢工程改造基因，将其整合到诱变菌株ea20基因组上提高菌株ea20的抗逆能力(具体见后续步骤)。
[0055]
(2)抗逆元件重组质粒的构建
[0056]
利用酵母基因组dna提取试剂盒提取季也蒙毕赤酵母ea20的基因组，以基因组为模板，利用四对引物strap f/r，ampk f/r，gdh f/r，tcyc f/r分别扩增出两端带有ptef启动子与tcyc1终止子同源臂的四个抗逆元件strap，ampk，gdh，tcyc，将带有筛选标记hph基因的质粒113-hph通过限制性内切酶swal酶切线性化；将线性化后的载体质粒与两端带有相应启动子与终止子同源臂的目的基因通过一步克隆转化试剂盒连接整合得到新的质粒，转入大肠杆菌感受态dh5α中，涂在带有氨苄青霉素抗性(100mg/l)的lb筛选平板上，选取阳性克隆子进行pcr验证并进一步测序验证，将得到的重组质粒命名为113-gpd-tef-hph-ampk、113-gpd-tef-hph-strap、113-gpd-tef-hph-tcyc和113-gpd-tef-hph-gdh。
[0057]
以113-gpd-tef-hph-strap为例，其具体构建步骤为：
[0058]
利用引物strap f/r扩增出两端带有ptef启动子与tcyc1终止子同源臂的抗逆元件strap，将带有筛选标记hph基因的质粒113-hph通过限制性内切酶swal酶切线性化；将线性化后的载体质粒与两端带有相应启动子与终止子同源臂的目的基因strap通过一步克隆转化试剂盒连接整合得到新的质粒。得到的质粒命名为113-gpd-tef-hph-strap。同样，得到其余重组质粒，命名为113-gpd-tef-hph-ampk、113-gpd-tef-hph-tcyc和113-gpd-tef-hph-gdh。
[0059]
(3)工程菌株e-ea20的构建
[0060]
由于四个基因共表达在一个质粒时，条带bp数太多容易产生缺失等问题。根据基因长度，本实施例的表达方式为：先将ampk、ampk、strap三个基因共表达，gdh单独表达。
[0061]
a.共表达抗逆元件重组质粒的构建
[0062]
以质粒113-gpd-tef-hph-tcyc为模板，利用引物ampk f/r进行pcr扩增得到目的片段ampk；利用限制性内切酶pme i酶切质粒113-gpd-tef-hph-tcyc使其线性化；利用一步克隆转化试剂盒将线性质粒载体113-gpd-tef-hph-tcyc与目的片段ampk连接整合得到新的质粒，转入大肠杆菌感受态dh5α中，涂在带有氨苄青霉素抗性(100mg/l)的lb筛选平板上，选取阳性克隆子进行pcr验证及测序验证，得到质粒113-gpd-tef-hph-tcyc-ampk。同上述操作利用限制性内切酶sma i酶切得到重组质粒113-gpd-tef-hph-tcyc-ampk-strap。
[0063]
b.将共表达质粒113-gpd-tef-hph-tcyc-ampk-strap和重组质粒113-gpd-tef-hph-gdh利用限制性内切酶not i酶切进行线性化，利用酵母转化方法将线性dna片段整合到ea20酵母基因组上，如下：
[0064]
酵母转化方法：
[0065]
使用美国zymo research公司生产的frozen-ez酵母转化试剂盒进行酵母转化，操作步骤如下：
[0066]
1.将季也蒙毕赤酵母ea20接入ypd试管中，30℃，200rpm培养2～4h，待od
600
达到0.8～1.0。
[0067]
2.取10ml种子液，500*g离心4min，收集菌泥，弃上清。
[0068]
3.加入10ml ez 1溶液重悬菌泥，再次离心，弃上清。
[0069]
4.加入1ml ez 2溶液重悬菌泥。
[0070]
5.每管分装50μl感受态细胞，直接进行下一步转化，或用2-6层纸包裹后储存于-80℃冰箱6个月。
[0071]
6.往新鲜配置的，或解冻后的50μl感受态细胞中加入0.2-1μg dna(最多加5μl)，再加入500μl ez3溶液，充分混匀。
[0072]
7.将上述混合体系置于30℃孵育45min，每隔10min用旋涡震荡仪充分混合孵化体系。
[0073]
8.吸取50-150μl的上述转化液于准备好的潮霉素b抗性筛选平板上，涂板。
[0074]
9.置于30℃培养箱中培养2-4d。
[0075]
将共表达质粒113-gpd-tef-hph-tcyc-ampk-strap的线性dna片段整合到ea20酵母基因组上后，涂布在0.2g/l hph抗性筛选平板上，培养2～3d，选取阳性克隆点进行pcr验证，将验证正确的点接入ypd试管中过夜培养，提取基因组进行测序验证。得到构建成功的重组工程菌株ea20-tcyc-ampk-strap。将上述构建的质粒113-hph-gdh利用限制性内切酶not i酶切进行线性化，得到线性目的片段。利用上述酵母转化方法将线性dna片段整合到工程菌株ea20-tcyc-ampk-strap基因组上，涂布在潮霉素b抗性浓度更高(0.4g/l hph)的筛选平板上，培养2～3d，选取阳性克隆点进行pcr验证，将验证正确的点接入ypd试管中过夜培养，提取基因组进行测序验证，最终得到构建成功的工程菌株e-ea20。
[0076]
(4)外源抗逆元件重组质粒的构建
[0077]
利用酵母基因组dna提取试剂盒提取季也蒙毕赤酵母(mg)、解脂耶氏酵母(yl)的基因组，以基因组为模板，利用两对引物gsh-yl f/r，slc-mg f/r分别扩增出两端带有pgpd启动子与txpr2终止子同源臂的两个目的基因gsh-yl，gslc-mg，将上述构建的带有筛选标记hph基因的质粒113-hph通过限制性内切酶sma i酶切线性化；将线性化后的载体质粒与两端带有相应启动子与终止子同源臂的目的基因通过一步克隆转化试剂盒连接整合得到新的质粒，转入大肠杆菌感受态dh5α中，涂在带有氨苄青霉素抗性(100mg/l)的lb筛选平板上，选取阳性克隆子进行pcr验证并进一步测序验证，将得分别构建成功的带有目的基因的重组质粒命名为113-gpd-tef-hph-gsh-yl和113-gpd-tef-hph-slc-mg。
[0078]
以113-gpd-tef-hph-gsh-yl为例，重组质粒的构建方式具体如下：
[0079]
利用gsh-yl f/r扩增出带有pgpd启动子与txpr2终止子同源臂的目的基因gsh-yl，将上述构建的带有筛选标记hph基因的质粒113-hph通过限制性内切酶sma i酶切线性化，将线性化后的载体质粒与两端带有相应启动子与终止子同源臂的目的基因通过一步克隆转化试剂盒连接整合得到新的质粒，将得到的带有目的基因gsh-yl的重组质粒命名为113-gpd-tef-hph-gsh-yl。同样操作，得到其他重组质粒，命名为113-gpd-tef-hph-slc-mg。
[0080]
(5)共表达外源抗逆元件重组质粒的构建
[0081]
以质粒113-gpd-tef-hph-slc-mg为模板，利用引物slc-mg f/r进行pcr扩增得到
2-pe平板都能稀释生长存活菌液的10-5
，且在5g/l 2-pe平板生长生物量多余e-ea20。由斑点稀释对照结果表明，外源抗逆元件表征进一步提高了菌株对2-pe的耐受性。
[0091]
进一步验证外源抗逆元件对2-pe合成性能的提高，对工程菌株gsh-slc-e-ea20、e-ea20和原始菌株wt进行发酵合成2-pe性能对比验证，如图5。相比于e-ea20对数生长期只能达到48h，随后稳定缓慢增长，工程菌株gsh-slc-e-ea20在摇瓶内的对数生长期延长到84h，120j内菌株没有凋亡现象。e-ea20在发酵后期没有凋亡显现，呈现缓慢增加生长，在120hod
600
能够生长到42，2-pe产量达到3.658g/l，但是工程菌株gsh-slc-e-ea20生长od
600
能达到47.8，生物量累积更高。gsh-slc-e-ea20的2-pe产量在4.05g/l左右，比e-ea20提高了11％，比wt提高了62.6％。
[0092]
实施例4
[0093]
本实施例说明工程菌株gsh-slc-e-ea20在发酵罐放大体系中的发酵效果。
[0094]
利用发酵罐进行放大发酵，由于可以更好的控制发酵体系的诸多条件，如ph恒定、提高溶氧、连续补料等，更加有利于季也蒙毕赤酵母的培养与2-pe的合成。对工程菌株gsh-slc-e-ea20进行发酵罐放大实验来进一步提高2-pe合成效率。实验条件为：发酵温度30℃，ph恒定控制在5.5，发酵体系2l，通气量控制在2vvm。
[0095]
结果如图6所示，工程菌株gsh-slc-e-ea20在60-72h内达到生长稳定期，od
600
能达到82，生长周期缩短，生长速率提高，2-pe产量在5.7g/l左右。从结果看出，与摇瓶发酵结果不同，在发酵罐中，由于补料分批发酵策略，发酵前期，葡萄糖消耗速率、菌株的生长速率、底物消耗速率以及产物合成速率都较快，菌株的发酵周期大大缩短。

技术特征：
1.高效合成2-苯乙醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达内源抗逆元件ampk，gdh，strap和tcyc及外源抗逆元件gsh和slc得到；所述内源抗逆元件来源于季也蒙毕赤酵母；所述外源抗逆元件gsh来源于解脂耶氏酵母；所述外源抗逆元件slc来源于季也蒙毕赤酵母；所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母菌。2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母ylg18，其保藏号为cctcc no：m 2020638。3. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述内源抗逆元件来源于季也蒙毕赤酵母ea20，其保藏号为cctcc no：m 2022053。4. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源抗逆元件gsh的geneid为5124237，gsh的gene id为34714842。5.权利要求1~4任一项所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：分别构建内源抗逆元件ampk，strap和tcyc的共表达质粒与gdh的重组表达质粒；将所述共表达质粒和重组表达质粒线性化后，通过酵母转化试剂盒导入宿主菌，获得表达内源抗逆元件的重组宿主菌；构建外源抗逆元件gsh，slc的共表达质粒，将其线性化后通过酵母转化试剂盒导入重组宿主菌，获得所述基因工程菌。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用于表达内源抗逆元件和外源抗逆元件的载体质粒为113-gpd-tef质粒。7.权利要求1~4任一项所述基因工程菌在合成2-苯乙醇中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌进行种子培养后，种子液接种至发酵培养进行发酵培养，合成2-苯乙醇。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌以葡萄糖为底物发酵合成2-苯乙醇。

技术总结
本发明公开了高效合成2-苯乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达内源抗逆元件ampk，gdh，strap和tcyc及外源抗逆元件gsh和slc得到；所述内源抗逆元件来源于季也蒙毕赤酵母；所述外源抗逆元件gsh来源于解脂耶氏酵母；所述外源抗逆元件slc来源于季也蒙毕赤酵母；所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母菌。本发明结合内源抗逆元件和外部抗逆元件对宿主菌进行基因工程改造，获得了对2-苯乙醇具有高耐受性且合成效率高的基因工程菌，提高了2-苯乙醇的产量，为2-苯乙醇合成提供了新的生产菌株。成提供了新的生产菌株。成提供了新的生产菌株。


技术研发人员：章文明 姜岷 杨欣怡 信丰学 蒋羽佳 姜万奎 高豪
受保护的技术使用者：山东亚华生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/10/7