一种打开真核细胞内质网IP3R钙离子通道的照明方法

一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法
技术领域
1.本发明涉及细胞内钙离子浓度的基础研究领域，尤其涉及一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法。


背景技术：

2.钙离子(ca
2+
)在所有的细胞中作为一种多功能的信号和第二信使发挥生物学作用
1.。它在基因表达、分泌、受精、增殖、发育、肌肉收缩和细胞死亡等过程的调节中必不可少
[1-3]
。尽管细胞内ca
2+
有限度的增加是ca
2+
信号传递的必要条件，但细胞内ca
2+
浓度持续过高会导致细胞通过坏死和凋亡途径而死亡。此外，不同的组织、单细胞和亚细胞区间通过不同的ca
2+
瞬变模式发出信号。实现这些不同的信号，需要对每种模式的离子通道、受体、缓冲剂、离子泵和ca
2+
结合蛋白进行特定的平衡。
[0003]
一般来讲，细胞外ca
2+
通过电压调控、受体调控或储存调控的ca
2+
通道进入细胞是用于增加细胞内ca
2+
浓度的主要作用机制
[4]
。然而，即使在没有细胞外ca
2+
的情况下，细胞内ca
2+
浓度也会发生变化。细胞内储存在钙库(比如内质网)中的ca
2+
释放在细胞内ca
2+
信号的调节中起着关键的作用
[4,5]
。事实上，细胞内ca
2+
浓度是由胞外流入以及内质网钙库释放这两者协调控制的
[6,7]
。
[0004]
在细胞内ca
2+
释放通道中，内质网ip3r钙离子通道的研究最为广泛，因为它有一套独特的特性组合：即，它受ca
2+
和其他第二信使的复杂调节，这使它能参与许多信号传导途径
[8-11]
，而且它经常在非兴奋性和兴奋性细胞中启动ca
2+
信号传导。
[0005]
目前对内质网ip3r钙离子通道的开放-关闭调控一般依赖于分子药物，例如：2-aminoethyl diphenylborinate(2-apb，内质网ip3r钙离子通道抑制剂)、3
″‑
dephospho-ada(内质网ip3r钙离子通道激活剂)。目前未见依靠光照打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的报道。
[0006]
参考文献
[0007]
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技术实现要素：

[0018]
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法，不依赖药物，方法简单易于推广。
[0019]
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0020]
一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法，照明设备不做限定，采用光谱范围为400～780nm全光谱可见光，真核细胞表面可接受的照射光强大于等于10000lux，光照时间不低于40分钟。
[0021]
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
[0022]
本发明使用400～780nm全光谱且细胞表面光照强度大于等于10000lux的照明设备，可造成真核细胞内质网ip3r钙离子通道开放，导致胞内钙离子浓度骤升。本发明不依赖药物可大幅升高真核细胞胞内钙离子浓度，为未来对真核细胞钙离子信号通路的研究提供便利。
附图说明
[0023]
图1为led光源光谱范围。
[0024]
图2为强光光照与普通光照对hela细胞胞内钙离子浓度的影响，其中，图2中各图说明如下：
[0025]
a：150lux普通光照照射40分钟后hela细胞fluo-4荧光视野；
[0026]
b：10000lux强光光照照射40分钟后hela细胞fluo-4荧光视野；
[0027]
比例尺：100μm。
[0028]
图3为强光光照与普通光照对hek293t细胞胞内钙离子浓度的影响，其中，正负分别代表钙离子螯合剂bapta-am的有无。
[0029]
图4为ip3r钙离子通道抑制剂2-apb对hela细胞胞内钙离子浓度的影响，其中，图4中各图说明如下：
[0030]
a：dmso对照组中，10000lux强光光照照射40分钟后hela细胞fluo-4荧光视野；
[0031]
b：100μm 2-apb实验组中，10000lux强光光照照射40分钟后hela细胞fluo-4荧光视野；
[0032]
比例尺：100μm。
[0033]
图5为ip3r钙离子通道抑制剂2-apb对hek293t细胞胞内钙离子浓度的影响，其中，正负代表钙离子螯合剂2-apb的有无。
具体实施方式
[0034]
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
[0035]
实验材料：
[0036]
实验用人胚胎肾细胞hek293t、人宫颈癌细胞hela来自本实验室冻存。
[0037]
本实验器材应用到白光led光源、倒置显微镜、细胞培养箱、无菌超净台、正置荧光显微镜、promega荧光检测仪。
[0038]
实验方法：
[0039]
实验1：培养hela细胞，种板于12孔细胞培养板并完成细胞爬片。将hela细胞玻片随机分为2组：即，强光光照组和普通光照组。分别将2组细胞转移至10000lux强光和150lux普通光照下照射40分钟。完成照射后，丙酮固定细胞，封闭后对细胞进行fluo-4 am钙离子荧光探针(碧云天，s1060)的装载。在hela细胞中加入2μm fluo-4 am工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准。37℃孵育30分钟进行荧光探针装载。随后用pbs漂洗细胞，再孵育20～30分钟，确保fluo-4 am在细胞内完全转变成fluo-4。用荧光显微镜检测fluo-4的荧光，以确定细胞内钙离子浓度的变化。
[0040]
实验2：培养hek293t细胞，种板于12孔细胞培养板。使用lipofectamine 3000脂质体转染试剂盒(l3000008)进行瞬时转染，转染质粒为萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒(nfat-luc)和海肾荧光素酶表达质粒(prl-tk)，转染比例为10:1。将hek293t细胞玻片随机分为4组：即，强光光照组、强光光照组(螯合钙离子)、普通光照组、普通光照组(螯合钙离子)。螯合钙离子组的细胞预先使用10μm钙离子螯合剂bapta-am处理12小时。分别将4组细胞转移至10000lux强光和150lux普通光照下照射40分钟。使用promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒(e1910)进行检测，向每个孔中加入细胞裂解液，置于定轨摇床上，室温裂解15分钟。待裂解完成后，取细胞裂解液加入到larⅱ中，用移液器吹打混均4～5次，检测萤火虫荧光素酶活性。随后立即加入stop glo试剂，吹打混均4～5次，检测海肾荧光素酶活性(作为内参)。将萤火虫荧光素酶活性除以肾荧光素酶活性，获得转录激活效应的强度。每个样本设有3孔平行样。
[0041]
实验3：培养hela细胞，种板于12孔细胞培养板并完成细胞爬片。将hela细胞玻片随机分为2组：即，强光光照对照组(dmso)和强光光照实验组(2-apb)。强光光照实验组加入100μm的2-apb，将hela细胞在普通光照下孵育30分钟(dmso为对照)，随后将2组细胞转移至10000lux强光下照射40分钟。完成照射后，丙酮固定细胞，封闭后对细胞进行fluo-4 am钙
离子荧光探针(碧云天，s1060)的装载。在hela细胞中加入2μm fluo-4 am工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准。37℃孵育30分钟进行荧光探针装载。随后用pbs漂洗细胞，再孵育20～30分钟，确保fluo-4 am在细胞内完全转变成fluo-4。用荧光显微镜检测fluo-4的荧光，以确定细胞内钙离子浓度的变化。
[0042]
实验4：培养hek293t细胞，种板于12孔细胞培养板。使用lipofectamine 3000脂质体转染试剂盒(l3000008)进行瞬时转染，转染质粒为萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒(nfat-luc)和海肾荧光素酶表达质粒(prl-tk)，转染比例为10:1。将hek293t细胞玻片随机分为4组：即，强光光照组、强光光照组(阻断ip3r钙离子通道)、普通光照组、普通光照组(阻断ip3r钙离子通道)。阻断ip3r钙离子通道组的细胞预先使用100μmip3r钙离子通道抑制剂2-apb处理30分钟。分别将4组细胞转移至10000lux强光光照下照射40分钟。使用promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒(e1910)进行检测，向每个孔中加入细胞裂解液，置于定轨摇床上，室温裂解15分钟。待裂解完成后，取细胞裂解液加入到larⅱ中，用移液器吹打混均4～5次，检测萤火虫荧光素酶活性。随后立即加入stop glo试剂，吹打混均4～5次，检测海肾荧光素酶活性(作为内参)。将萤火虫荧光素酶活性除以肾荧光素酶活性，获得转录激活效应的强度。每个样本设有3孔平行样。
[0043]
实验结果：
[0044]
本实验led光源的光谱范围如图1所示，为400～780nm全光谱可见光。
[0045]
荧光显微镜下观察实验1中预先装载fluo-4 am钙离子荧光探针的玻片，如图2a和2b所示，强光光照组视野中发现大量绿色荧光信号，提示强光光照造成hela细胞胞内ca
2+
浓度升高；而普通光照组视野中未发现明显的绿色荧光信号。
[0046]
can/nfat双荧光素酶报告基因系统显示(图3)，强光光照组hek293t细胞中可以反应ca
2+
浓度的荧光强度是普通光照组的11倍，且这一现象可以被钙离子螯合剂bapta-am的预处理来抵消。提示，强光光照造成hela细胞胞内ca
2+
浓度显著升高。
[0047]
荧光显微镜下观察实验3中预先装载fluo-4 am钙离子荧光探针的玻片，如图4a和4b所示，强光光照对照组(dmso)视野中发现大量绿色荧光信号，而强光光照实验组(2-apb)视野中未发现明显的绿色荧光信号。说明hela细胞胞内ca
2+
浓度显著升高是由于强光光照造成内质网上ip3r钙离子通道持续开放。
[0048]
can/nfat双荧光素酶报告基因系统显示(图5)，强光光照组hek293t细胞中可以反应ca
2+
浓度的荧光强度是普通光照组的13倍，且这一现象可以被ip3r钙离子通道抑制剂2-apb的预处理来抵消。说明hela细胞胞内ca
2+
浓度显著升高是由于强光光照造成内质网上ip3r钙离子通道持续开放。

技术特征：
1.一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法，其特征在于：使用光照强度大于等于10000lux的照明灯具进行细胞照射。2.如权利要求1所述的一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法，其特征在于：控制照射高度及角度使细胞接受光强维持在10000lux及以上，且照射时间不少于40分钟。3.如权利要求1或2所述的一种打开真核细胞内质网ip3r钙离子通道的照明方法，其特征在于：使用照明灯具的光谱范围为400～780nm全光谱可见光。

技术总结
一种打开真核细胞内质网IP3R钙离子通道的照明方法，使用400～780nm全光谱且细胞表面光照强度大于等于10000lux的照明设备，可造成真核细胞内质网IP3R钙离子通道开放，导致胞内钙离子浓度骤升。本发明不依赖药物可大幅升高真核细胞胞内钙离子浓度，为未来对真核细胞钙离子信号通路的研究提供便利。离子信号通路的研究提供便利。离子信号通路的研究提供便利。


技术研发人员：陈仕玺 张子豪
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/10/7