CHR-6494在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用

chr-6494在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于动物疾病预防控制技术领域，具体涉及chr-6494在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用。


背景技术：

2.猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,prv)属于α疱疹病毒属，是一种线性双链dna病毒。prv可感染多种哺乳动物，包括犬科动物(狗、狐狸和狼等)、猫科动物(猫、狮等)、反刍动物(羊和牛等)、啮齿动物(鼠)和猪等，但猪属于prv唯一的自然宿主。prv感染可导致非自然感染宿主出现发热、瘙痒和神经症状等；导致仔猪腹泻、神经症状和妊娠母猪繁殖障碍等。此外，近年来已有大量案例证实prv可感染人，并可引起患者脑炎甚至死亡，且案例涉及患者多为生猪从业相关人员，提示prv流行不仅严重危害养殖业健康发展，同时对国民健康也可造成巨大的威胁。目前对于prv的防控主要依赖疫苗免疫接种和提高生物安全水平，暂时没有特效的治疗药物，这不利于prv感染的治疗。
3.chr-6494，3-(1h-吲唑-5-基)-n-丙基-咪唑并[1,2-b]吡嗪-6-胺，是一种haspin抑制剂，它在多种肿瘤细胞系中显示抗增殖活性。现有技术证明了chr-6494具有抗肿瘤血管生成的作用；小鼠体内实验同样显示出其抗肿瘤的潜能，并且对正常的组织没有明显的毒性。同时chr-6494在抗乳腺癌、结肠癌、宫颈癌中显示出良好的作用。chr-6494单独使用能以剂量依赖的方式抑制几类黑色素肿瘤细胞系的生长，与mek抑制剂(曲美替尼,gsk-1120212)同时使用，在抑制野生型突变和brafv600e突变的黑色素肿瘤细胞的活性方面也起到了叠加的效果。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在提供chr-6494在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用。
[0005]
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006]
chr-6494或其药学上可接受的盐在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用，chr-6494的结构式如下：
[0007][0008]
在其中一个优选的实施例中，所述chr-6494或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
[0009]
在其中一个优选的实施例中，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
[0010]
在其中一个优选的实施例中，所述chr-6494或其药学上可接受的盐通过抑制prv
vet sci,2021,8:762326.中记载的方式构建或分离)，并保存；haspin激酶抑制剂(chr-6494)购自于南京百鑫德诺生物科技有限公司；
[0026]
1.2主要试剂
[0027]
prv-gb单克隆抗体由南京农业大学姜平教授惠赠；抗β-actin兔源单克隆抗体购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品；此外，荧光定量试剂sybr green(诺唯赞)、cdna逆转录试剂盒(诺唯赞)、ecl超敏化学发光液(新赛美公司)和胎牛血清(gbico)等属于常规试剂，市面采购。
[0028]
实施例1
[0029]
chr-6494对3d4/21细胞毒性试验
[0030]
将3d4/21细胞铺于96孔板，待细胞密度达50～60％，弃去上清，加入含不同浓度chr-6494(0.1μm、0.25μm、0.5μm、1.0μm、2.0μm和4.0μm)的细胞维持液(dmem 1640培养基中添加2％fbs和1％双抗溶液)，以dmso组为对照组。细胞培养36h后，以mtt法检测各组细胞对应od490值。
[0031]
结果如图1所示，低浓度的chr-6494(0.1～0.5μm)对3d4/21细胞活性影响较小，但浓度超过1.0μm的chr-6494对细胞活性影响稍大。因此后续选择0～0.5μm chr-6494进行后续细胞试验。
[0032]
实施例2
[0033]
chr-6494处理对rprvhun-egfp半数有效抑制浓度的初步确定
[0034]
将1000个tcid50的rprvhun-egfp侵染12孔板的3d4/21细胞(密度约80％)，37℃吸附2h后弃去上清，pbs清洗3次。用细胞维持液将chr-6494抑制剂稀释成终浓度为1.95nm、3.90nm、7.80nm、15.62nm、31.25nm、62.50nm、125nm、250nm和500nm，分别加入不同细胞孔内，每组设置3个重复。24h后，弃去上清，用pbs清洗3次，加入适量pbs溶液后于荧光显微镜下观察各组表达egfp细胞比例。结果如图2所示。
[0035]
如图2可知，chr-6494可有效降低感染rprvhun-egfp阳性细胞比例，且在一定程度上呈浓度依赖性(图2-a)。进一步分析可知，与dmso组相比，chr-6494浓度高于12.5nm组egfp阳性细胞比例下降率均超过50％。若以表达egfp细胞比例下降50％，视为病毒滴度下降50％，chr-6494对细胞cc50为1.0～2.0μm，因此chr-6494对rprvhun-egfp的治疗指数(ti)应高于40，属于低毒高效(图2-b)。
[0036]
将5000个tcid50的prv变异株侵染6孔板的3d4/21细胞(密度约80％)，37℃吸附2h后弃去上清，pbs清洗3次。用细胞维持液将chr-6494抑制剂稀释成终浓度为0nm(dmso)、50nm、100nm、200nm和400nm，分别加入不同细胞孔；同时设置不加病毒组(nc)。24h后，弃去上清，用pbs清洗3次，观察各组细胞病变情况。
[0037]
结果如图3所示，dmso处理组细胞感染prv变异株24h后可见明显病变，且出现较大的“病变空洞”；而400nm和200nm chr-6494处理组细胞感染病毒后基本无病变，100nm和50nm抑制剂处理组细胞虽有细胞病变，但明显轻于dmso处理组。以上结果表明：chr-6494处理可有效缓解prv感染引起的细胞病变，提示该化合物具有抗prv感染的作用。
[0038]
实施例3
[0039]
chr-6496处理对prv变异株和经典株感染作用初步探究
[0040]
1)将3d4/21细胞铺板于6孔板，待细胞密度达80％左右，弃上清，加入dmem培养基；
2)每个孔侵染5000个tcid50的prv变异株或经典株，37℃吸附2h后弃去上清，pbs溶液清洗3次；3)用细胞维持液将chr-6494抑制剂稀释至终浓度为400nm、200nm、100nm和50nm，分别加入不同细胞孔内；4)36h后收集各组细胞，分别用于提取细胞总rna和蛋白，用于后续rt-qpcr和western blot等试验。
[0041]
提取蛋白和western blot检测prv gb蛋白相对表达水平的主要步骤如下：1)以6孔板细胞为例，用pbs清洗2次后加入含1％pmsf的ripa buffer，冰上孵育15min；2)刮取细胞入1.5ml离心管，低温(4℃)高速(12000r/min)离心15min，取上清置于洁净1.5ml离心管内；3)采用bca法确定蛋白浓度，向剩余上清加入5
×
sds buffer(含6％巯基乙醇)，煮沸5min；4)取约25.0μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶孔内，电压设置为85v，30min；120v，70min；5)采用半干法转膜，转膜条件为85v，80min；转膜结束后将pvdf膜放在5％脱脂奶粉中室温封闭1h或4℃封闭过夜；6)tbst冲洗3次，加入一抗(抗prv-gb/β-actin)室温孵育4h，tbst清洗5次，每次6min；7)加入hrp标记二抗(对应一抗属性)室温孵育45min，pbst洗膜5次，每次6min；8)现配现用显色液，于显影仪内采用化学发光法检测目的蛋白是否表达。
[0042]
细胞总rna提取方法如下：
[0043]
以trizol法提取细胞总rna，步骤为：
[0044]
1)用pbs润洗单层细胞后加入400μl trizol reagent，混匀后在冰上静置5min；用无rna酶枪头刮取混合物至无rna酶的1.5ml离心管；
[0045]
2)向离心管中加入100μl氯仿，于涡旋仪上涡旋15s，冰上静置2min；于4℃离心机中以12000r/min离心15min；
[0046]
3)吸取上层透明水相至新的无rna酶离心管，加入200μl异丙醇，上下颠倒10次，冰上静置10min；于4℃离心机中以12000r/min离心10min；
[0047]
4)弃去离心后液体，加入提前预冷的500μl 75％乙醇溶液洗涤沉淀，上下颠倒数次后于4℃离心机中以7500r/min离心5min；
[0048]
5)重复步骤4)一次，弃去上清；8000r/min离心1min，使管壁液体离心至底部；
[0049]
6)吸取上清，可见底部有少量白色沉淀；将离心管放置于超净工作台内，打开离心管盖，使管内乙醇挥发；4～5min后可向离心管内加入30～50μl无rna酶水；将离心管置于水浴锅(约60℃)5min，促进rna溶解。其后将rna逆转录为cdna，或将rna保存于-80℃。
[0050]
prv ge和gb基因转录水平测定(rt-qpcr)的主要步骤如下：1)细胞感染病毒后以trizol法提取总rna，测定所提取总rna的浓度，取1.0μg rna进行逆转录。该过程分为2步：
[0051]
a)12μl体系内加入1.0μg rna、10mm dntp和随机引物(random primer)各1.0μl，剩下用无rna酶水补齐；混匀后瞬离，反应条件为65℃10min；
[0052]
b)配置8μl体系的混合液，其中包括5
×
mlv buffer 4.0μl、0.1m dtt溶液2.0μl、无rna酶水1.5μl及1m m-mlv逆转录酶0.5μl；混匀后加入至前一步的反应体系，共20μl体系。反应条件为37℃60min，70℃15min。
[0053]
随机引物(random primer)(货号：48190011)、m-mlv逆转录酶(货号：28025013)、dntp(货号：r0194)、mlv buffer(货号：d1532)、m dtt溶液(货号：d1532)等逆转录反应相关试剂均购自于赛默飞世尔科技公司。
[0054]
采用在线软件primer-blast设计目的基因rt-qpcr引物(表1)，引物均由长沙擎科生物技术有限公司合成。以gapdh基因为内参，采用qpcr法验证细胞各检测基因相对表达情
况。qpcr反应体系包括2
×
sybr green预混液5.0μl、上游/下游引物各0.2μl、cdna模板1.0μl和无rna酶水3.6μl；反应条件为95℃5min；95℃10s，60s 30s，共设置40个循环。反应结束后，根据各组目的基因和gapdh基因对应ct值，以2-δδct法分析各基因相对表达水平，应用graphpad prism 9.0软件统计结果并作图。
[0055]
表1的基因rt-qpcr引物
[0056]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)qpcr-prv-ge-f(上游引物)gaccccgaggacgagttcaqpcr-prv-ge-r(下游引物)acgccatagttgggtccattqpcr-prv-gb-f(上游引物)cagacgtagaagcggtcccqpcr-prv-gb-r(下游引物)agtccctcgaggagatcgac
[0057]
结果如图4所示，不同浓度chr-6494处理均可显著抑制prv ge和gb基因转录水平和gb蛋白表达水平，且呈剂量依赖性。
[0058]
实施例4
[0059]
chr-6496处理对prv感染不同阶段影响探究
[0060]
chr-6496直接对prv杀灭效果探究：1)将1000个tcid50的rprvhun-egfp与chr-6494(200nm)置于1.5ml离心管内(处理组)，混匀后放置37℃恒温箱孵育2h；以含1000个tcid50的rprvhun-egfp的dmem溶液为对照组；2)将两组混合液分别侵染6孔板的3d4/21细胞(密度约80％)，2h后弃去上清，pbs清洗3次后换成细胞维持液；3)24h后弃去上清，加入适量pbs，于荧光显微镜下观察各组表达egfp细胞比例。
[0061]
chr-6496对prv吸附细胞阶段的影响：1)将3d4/21细胞铺板于6孔板，待细胞密度达80％左右；2)弃上清，试验组细胞加入含200nm chr-6496化合物的dmem溶液和1000个tcid50的rprvhun-egfp；对照组细胞加入等体积dmem溶液和1000个tcid50的rprvhun-egfp；3)将细胞板置于4℃冰箱内1h待病毒吸附，弃去上清，pbs清洗3次后加入细胞维持液；4)24h后弃去上清，加入适量pbs后，在荧光显微镜下观察各组表达egfp细胞比例。
[0062]
chr-6496对prv进入细胞阶段的影响：1)将3d4/21细胞铺板于6孔板，待细胞密度约80％；2)向对照组和试验组细胞孔内加入1000个tcid50的rprvhun-egfp，置于4℃冰箱内1h待病毒吸附；3)弃去上清，pbs清洗3次后分别加入含200nm chr-6496化合物的细胞维持液(试验组)和不含化合物的细胞维持液(对照组)，置于恒温箱内2h待病毒进入细胞；4)弃去上清，用pbs溶液清洗3次，各组均加入适量细胞维持液；5)24h后，弃去上清，加入适量pbs溶液，于荧光显微镜下观察各组表达egfp细胞比例。
[0063]
chr-6496对prv复制阶段的影响：1)将3d4/21细胞铺板于6孔板，细胞密度约80％后进行后续试验；2)向试验组和对照组细胞孔内分别加入1000个tcid50的rprvhun-egfp，置于恒温箱内2h待病毒进入；3)弃去上清，pbs清洗3次，分别加入含200nm chr-6496化合物的细胞维持液(试验组)和不含该化合物的细胞维持液(对照组)，置于恒温箱内培养24h；4)弃去上清，加入适量pbs溶液，于荧光显微镜下观察各组表达egfp细胞比例。
[0064]
通过观察表达egfp细胞比例可初步评估各处理方式下rprvhun-egfp株在细胞中增殖情况，如图5所示，与对照组相比，在病毒复制阶段加入chr-6494可有效降低表达egfp细胞比例，而其他处理组表达egfp细胞比例差异较小。因此，该化合物主要是抑制prv复制阶段来发挥抗病毒感染作用。
[0065]
综上，本发明实施例以3d4/21细胞为例，证明了化合物chr-6494可有效抑制prv在宿主细胞中增殖效率。
[0066]
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。

技术特征：
1.chr-6494或其药学上可接受的盐在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用，其特征在于，chr-6494的结构式如下：2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述chr-6494或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述chr-6494或其药学上可接受的盐通过抑制prv复制防治猪伪狂犬。5.一种防治猪伪狂犬病的药物，其特征在于，包括chr-6494或其药学上可接受的盐。

技术总结
本发明公开了CHR-6494在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用，CHR-6494的结构式如下：本发明中确定了抑制剂CHR-6494对PRV增殖具有明显抑制作用。6494对PRV增殖具有明显抑制作用。6494对PRV增殖具有明显抑制作用。


技术研发人员：姚俊 王爱兵 谭磊 舒相华 宋春莲
受保护的技术使用者：湖南农业大学 云南农业大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/10/7