一种发酵果油及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及日化用品技术领域，具体涉及一种发酵果油及其制备方法与应用。


背景技术：

2.化妆品用植物油脂的使用种类较多，其中橄榄油被西方领域称为“液体黄金”，其含有丰富的饱和及不饱和油酸及维生素，在使用于皮肤尤其是面部皮肤时可以实现保湿补水、减少皱纹、抗氧化、抗炎等多种功效。然而橄榄油中的大分子物质(甘油三酯)含量较多，在未经处理的情况下，相比于化妆品其他成分具有油腻感较强，难以在皮肤上迅速铺展，这也导致了该物质的理论功效和实际功效差别极大。虽然现有技术在植物油脂的基础上推广经过改性加工的发酵型植物油脂进行代替，这些产品中的大分子物质被发酵分解为小分子后铺展性提升，但部分发酵工艺反而会导致橄榄油中的部分活性成分丧失，产品的护肤性能比原产品更差。


技术实现要素：

3.基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种发酵果油的制备方法，该方法以巴西曲霉为发酵微生物，在特殊工艺下对橄榄油进行发酵处理，所得发酵果油中的大分子物质(甘油三酯)被有效转化，应用在护肤品中时油腻感低，肤感好，可以迅速在皮肤上铺展，同时该产物没有造成功能散失，甚至具有比原橄榄油更好的抗氧化、保湿补水功能。
4.为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
5.一种发酵果油的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将驯化后的巴西曲霉稀释，得巴西曲霉菌液；
7.(2)在发酵底物中接种巴西曲霉菌液，并在35～40℃下发酵48～75h，分离所得混合物，所得上层澄清液即为发酵果油；所述发酵底物中含有20～25wt％橄榄油，所述巴西曲霉菌液的接种量为3.5～5.5wt％。
8.一般而言，橄榄油中大分子物质(甘油三酯)含量较多，采用微生物发酵处理可以使得这些大分子物质转化为小分子物质，从而提升整体橄榄油发酵产品在皮肤表层的肤感及相容性，然而在不同的发酵微生物种类、发酵环境下，橄榄油中小分子物质的转化种类及转化程度也有所不同，若选取发酵工艺不当，不仅可能难以实现理想的发酵效率，甚至可能会导致发酵产物失去原有的护肤活性；另一方面，现有技术中发酵产物的发酵对象并不只有橄榄油，若发酵效果不佳，以橄榄油作为发酵底物制备的产品护肤效果可能比其他植物油脂选用相同工艺制备的产品差。而在本发明技术方案中，发明人以巴西曲霉作为发酵微生物，随后在特定的发酵条件下可制备具有高发酵效率发酵果油产品，该产品中小分子物质含量高且护肤活性好。
9.经过研究，在35～40℃下，巴西曲霉发酵橄榄油后制备的发酵果油中活性成分最高，进一步地，当接枝量维持在3.5～5.5wt％且发酵时间达到48～75h时，巴西曲霉的发酵
效率高。
10.优选地，所述驯化包括以下步骤：
11.将发酵底物加入巴西曲霉中进行一次驯化；随后对混合物进行洗脱，取部分洗脱产物接种至另一发酵底物中进行二次驯化，将所得菌悬液稀释80～100倍，得巴西曲霉菌液。
12.更优选地，所述二次驯化时，洗脱产物与发酵底物的体积比为(0.5:9.5)～(1.5:8.5)。
13.优选地，所述步骤(2)中发酵底物包括以下质量含量的组分：0.6～1wt％葡萄糖、1～1.5wt％蛋白胨、牛肉膏0.5～1wt％、20～25wt％橄榄油、0.02～0.1wt％mgso4、0.15～0.25wt％k2hpo4以及0.04～0.05wt％cacl2。
14.更优选地，发酵底物的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合并调节所得混合物ph至5.5～6.5，随后加热灭菌，即得所述发酵底物。
15.优选地，所述巴西曲霉菌液的接种量为4.5～5.5wt％(即巴西曲霉菌液接种至发酵底物后巴西曲霉菌液的质量含量)。
16.优选地，所述发酵时间为70～75h。
17.巴西曲霉菌液中的巴西曲霉中的脂肪酶活性受到接种量和发酵条件的影响，经过测试发现，当接种量选择4.5～5.5wt％(尤其是5wt％时)，巴西曲霉产生的脂肪酶活性较高且稳定性较强，可在发酵48后保持高活性，在72h时达到峰值。
18.本发明的另一目的在于提供所述发酵果油的制备方法制备得到的发酵果油。
19.本发明所述产品的制备方法以橄榄油作为发酵对象，以特定的巴西曲霉作为发酵微生物，两者的特异性搭配在特定发酵条件下可以使得发酵过程中的关键物质脂肪酶保持高活性，从而使得发酵果油中的大分子物质(甘油三酯)高效转化，该发酵果油产品不仅具有舒适的肤感，同时具有显著的抗氧化和保湿补水功效。
20.本发明的再一目的在于提供所述发酵果油在制备化妆品中的应用。
21.一种精华油，包括本发明所述发酵果油和辛酸/癸酸甘油三酯，两者的质量会占比为(3:97)～(1:99)。
22.本发明所述发酵果油在保湿基质辛酸/癸酸甘油三酯中可充分发挥抗氧化及保湿锁水的功效，相比于其他植物油脂/发酵植物油脂制备的精华油产品存在显著性的效果提升。
23.本发明的有益效果在于，本发明提供了一种发酵果油的制备方法，该方法以巴西曲霉为发酵微生物，在特殊工艺下对橄榄油进行发酵处理，所得发酵果油中的大分子物质(甘油三酯)被有效转化，应用在护肤品中时油腻感低，肤感好，可以迅速在皮肤上铺展，同时该产物没有造成功能散失，甚至具有比原橄榄油更好的抗氧化、保湿补水功能。
附图说明
24.图1为本发明效果例1所述各产品的脂肪酶酶活测试图；
25.图2为本发明效果例2中原料橄榄油和实施例1所得发酵果油高效液相色谱图；
26.图3为本发明效果例3中各样品的抗氧化测试结果图。
27.图4为本发明效果例4中各样品的保湿测试结果图。
28.图5为本发明效果例5中各样品的锁水测试结果图。
具体实施方式
29.为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施、对比例所设计的实验试剂、原料及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂、原料及仪器。各实施例和对比例所述橄榄油为英国北星northstar生产产品，巴西曲霉为广东环凯微生物科技有限公司生产fscc114001。
30.实施例1
31.本发明所述一种发酵果油的制备方法，包括以下步骤：
32.(1)配制发酵底物，所述发酵底物包括0.8wt％葡萄糖、1.5wt％蛋白胨、0.8wt％牛肉膏、20wt％橄榄油、0.1wt％mgso4、0.2wt％k2hpo4、0.045wt％cacl2和余量水；
33.所述发酵底物的制备方法为：将各组分混合后调节ph至6，随后加热至121℃进行灭菌处理；
34.(2)取部分发酵底物用于驯化巴西曲霉，得巴西曲霉菌液；
35.所述驯化步骤为：将10ml发酵底物加入至装在斜面试管中的活化后的巴西曲霉中进行一次驯化，随后进行洗脱并取1ml洗脱产物接种至另一装有9ml发酵底物的试管中混合摇匀，所得菌悬液稀释100倍，得巴西曲霉菌液；
36.(3)将巴西曲霉菌液按照5wt％接种量接种至剩余的发酵底物中进行发酵，过滤上层澄清液，得发酵果油；所述发酵过程中使用摇床进行处理，摇床转速为250r/min，发酵温度设置为35℃，发酵时间为72h。
37.实施例2
38.本发明所述一种发酵果油的制备方法，与实施例1的差别仅在于，所述巴西曲霉菌液的接种量为4wt％。
39.实施例3
40.本发明所述一种发酵果油的制备方法，与实施例1的差别仅在于，所述发酵底物包括0.8wt％葡萄糖、1wt％蛋白胨、1wt％牛肉膏、25wt％橄榄油、0.05wt％mgso4、0.2wt％k2hpo4、0.044wt％cacl2和余量水。
41.对比例1
42.一种发酵果油的制备方法，与实施例1的差别仅在于，所述巴西曲霉菌液的接种量为3wt％。
43.对比例2
44.一种发酵果油的制备方法，与实施例1的差别仅在于，所述巴西曲霉菌液的接种量为6wt％。
45.效果例1
46.为了验证本发明所述产品制备方法所选用的巴西曲霉的优选性，将实施例1～2和对比例1～2所述产品进行脂肪酶酶活测试，
47.测试步骤如下：
48.1.制备底物溶液：称取聚乙烯醇(pva)40g加水800ml，在沸水浴中加热，搅拌直至全部溶解，冷却后定容至1000ml。用干净的双层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150ml,加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理6min，即得乳白色pva乳化液。
49.2.测定：取四个100ml三角瓶，分别于空白瓶(a)和样品瓶(b、c、d)中加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲溶液5.00ml，再于a瓶中加入95％乙醇15.00ml，于40℃
±
0.2℃水浴中预热5min，然后于a、b、c、d瓶中各加入待测样品各实施例和对比例的待测物a1.00ml，立即混匀计时反应15min后，于b、c、d等瓶中加入95％乙醇15.00ml终止反应，取出；于各三角瓶中加入酚酞指示剂2～3滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
50.3.计算：x1＝(v
1-v2)
×c×
50
×
n1/0.05
×
(1/15)，式中：
51.x1——样品的酶活力，u/ml；
[0052]v1
——滴定样品时候消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；样品分别代表b、c或d瓶样品，该三个样品为一个样品的平行实验品；
[0053]v2
——滴定空白时候消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；
[0054]
c——氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/l)；
[0055]
50——0.05mol/l氢氧化钠1.00ml相当于脂肪酸50μmol；
[0056]
n1——样品的稀释倍数；
[0057]
0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；
[0058]
1/15——反应时间15min，以1min计。
[0059]
通过上述计算方式分别计算出对应b、c、d样品的x
1b
、x
1c
和x
1d
并计算各实施例或对比例产品的平均值，汇总作图。
[0060]
同时，根据实施例1～2和对比例1～2中的工艺，在其他条件不变的情况下，同步将发酵的时间分别缩短至24h和48h，以及延长至96h并进行上述相同实验测试并汇总作图。
[0061]
结果如图1所示，可以看出，在不同接种量下，只在前24h进行发酵时的巴西曲霉中的脂肪酶酶活性较低，随着发酵时间增加至48h，接种量为3wt％、4wt％和6wt％的产品中脂肪酶的酶活达到峰值，并在发酵时间继续延长至72h时衰减，只有在5wt％接种量下的巴西曲霉中的脂肪酶酶活继续提升至各实验组最高(在72h时达到峰值)，因此可以确定巴西曲霉菌液的接种量为5wt％时效果最佳。
[0062]
效果例2
[0063]
为了验证本发明所述发酵果油中的大分子物质转化效率，将实施例1中所述制备方法所得产品以及原料橄榄油同时进行高效液相色谱分析，对应参数为：
[0064]
色谱柱：agilent 5tc-c18(2)250*4.6mm；
[0065]
柱温：30℃；
[0066]
检测波长：210nm；
[0067]
流动相：乙腈：异丙醇＝56:44；
[0068]
流速：1ml/min；
[0069]
进样量：5ul；
[0070]
初始柱压：121
±
10bar。
[0071]
结果如图2所示，可以看出，发酵后的产品中大分子物质(甘油三酯)含量显著减
少，而小分子物质含量显著增加，转化率较高。
[0072]
效果例3
[0073]
为了验证本发明所述发酵果油的应用效果，将实施例1所得发酵果油按照2:98的质量比与辛酸/癸酸甘油三酯混合，得到一款精华油产品，同时，设置如下若干个对照组：
[0074]
(1)对照组1：所述精华油中的发酵果油替换为采用实施例1相同方法，以青刺果油(云南英格生物技术有限公司生产)替换发酵底物中橄榄油后制备的发酵产物；
[0075]
(2)对照组2：所述精华油以未经发酵处理的橄榄油按照2:98的质量比与辛酸/癸酸甘油三酯混合所得产品；
[0076]
(3)对照组3：所述精华油中的发酵果油替换为采用实施例1类似方法，但发酵微生物替换为皱褶假丝酵母(广东省微生物菌种保藏中心，gdmcc2.5)，发酵微生物菌液的接种量为5wt％，发酵时间为72h，采用效果例1相同方法测试后脂肪酶酶活达到1.26u/g的发酵产品；
[0077]
(4)对照组4：所述精华油中的发酵果油替换为采用实施例1类似方法，但发酵微生物替换为米根霉(广东省微生物菌种保藏中心，gdmcc3.207)，发酵微生物菌液的接种量为5wt％，发酵时间为72h，采用效果例1相同方法测试后脂肪酶酶活达到1.84u/g的发酵产品；
[0078]
(5)对照组5：该组为空白组，即为纯辛酸/癸酸甘油三酯。
[0079]
将实施例1产品制得精华油和对照组1～5产品分别进行抗氧化测试、保湿测试和锁水测试：
[0080]
所述抗氧化测试，具体测试方法为：
[0081]
dpph
·
自由基清除法：
[0082]
(1)待测样品溶液制备：称取样品10.0mg，用蒸馏水溶解，定容至1.0ml，充分混合均匀，配制成10.0mg/ml的母液。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的待测样品溶液。
[0083]
(2)谷胱甘肽溶液制备：称取l-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0ml，充分混合均匀，配制成10.0mg/ml的母液。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的谷胱甘肽溶液。
[0084]
(3)测定：
[0085]
对照组：取3支试管，分别编号为1、2、3号，在1号试管中加入3.0ml dpph溶液和1.0ml谷胱甘肽溶液，作为试验组(as)；在2号试管中加入1.0ml谷胱甘肽溶液和3.0无水乙醇溶液，作为对照组(ac)；在3号试管中加入3.0mldpph溶液和1.0ml样品溶剂溶液，作为空白组(ab)。分别充分混合均匀后，室温避光反应30min，于波长517nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。
[0086]
样品组：用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同对照组。
[0087]
试验数据处理：
[0088]
p＝[1-(a
s-ac)/ab]
×
100％
[0089]
式中：p—清除率；as—待测溶液与dpph溶液混合液的吸光度；ac—待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度；ab—dpph溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度。
[0090]
abts
+
自由基清除法：
[0091]
(1)待测样品溶液制备：称取样品10.0mg，用蒸馏水溶解并定容至1.0ml，充分混合
均匀，配制成10.0mg/ml的母液。用95％乙醇将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的待测定溶液。
[0092]
(2)谷胱甘肽溶液制备：称取l-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0ml，充分混合均匀，配制成10.0mg/ml的母液。用95％乙醇将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的测定溶液。
[0093]
(3)测定：
[0094]
对照组：取2支试管，分别编号为1、2号，在1号试管中加入3.6mlabts溶液和0.4ml谷胱甘肽溶液，作为试验组(as)；在2号试管中加入3.6mlabts溶液和0.4ml样品溶剂溶液，作为空白组(ab)；分别充分混合均匀后，室温避光反应5min，于波长734nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。
[0095]
样品组：用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同对照组。
[0096]
试验数据处理：p＝(ab-as)/ab
×
100％
[0097]
式中：p—清除率；ab—abts溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度；as—待测溶液与abts溶液混合液的吸光度。
[0098]
所述保湿测试，具体测试方法为：
[0099]
选取一年龄30岁、皮肤健康的女性志愿受试者，测试当天前臂曲侧不涂任何产品，受试者自我清洁待测试部位，恒温恒湿环境下平衡20～30min，在前臂曲侧选取3cm*4cm区域，用记号笔标记，并设置空白对照，不涂抹任何产品，用皮肤角质层水合测量仪测试空白对照初始值0h。样品按2.0mg/cm2的用量进行换算，使用移液枪进行定量，乳胶指套将样品均匀涂布于试验区内即可，于8h在对应位置测试数值。
[0100]
所述锁水测试，具体测试方法为：
[0101]
选取一年龄30岁、皮肤健康的女性志愿受试者，测试当天前臂曲侧不涂任何产品，受试者自我清洁待测试部位，恒温恒湿环境下平衡20～30min，在前臂曲侧选取3cm*4cm区域，用记号笔标记，并设置空白对照，不涂抹任何产品，用经皮水分流失测量仪测试空白对照初始值0h。样品按2.0mg/cm2的用量进行换算，使用移液枪进行定量，乳胶指套将样品均匀涂布于试验区内即可，于8h在对应位置测试数值。
[0102]
测试结果如图3～5所示。
[0103]
从图3可以看出，本发明所述发酵果油产品制备的精华油对于dpph和abts具有去除能力，可以起到优异的抗氧化效果；相比之下，以纯橄榄油和青刺果油制备的发酵产物作为功能成分的对照组1和2产品的抗氧化效果较低，甚至与作为空白对照的对照组5相当，说明纯橄榄油在直接使用时难以发挥抗氧化功效，而一些其他植物油脂在相同微生物发酵后也并不一定具备抗氧化功能；而对照组3和4所述发酵产物是其他发酵微生物发酵得到的(发酵时微生物存在一定酶活)，这两种产物在复配保湿基质后并没有明显的抗氧化功效，说明这两种微生物并没有有效转化具有抗氧化活性的物质。
[0104]
从图4可以看出，各产品中作为保湿基质的辛酸/癸酸甘油三酯具备相当的保湿功效，提高皮肤角质层含水量，而本发明所述发酵果油产品则可以在保湿基质的基础上进一步提升产品的保湿能力；相比之下，采用纯橄榄油或者其他植物油脂发酵得到的产品虽然也具备保湿能力，但效果稍差，而采用其他微生物发酵的产品的保湿效果同样不如本发明所述发酵果油。
[0105]
从图5可以看出，作为保湿基质的辛酸/癸酸甘油三酯在单独使用时的锁水能力一般，在涂抹8h后的经皮失水变化率较高，而负载发酵产品或纯橄榄油的精华油产品其锁水能力有效提升，其中，依然是本发明所述采用橄榄油作为发酵底物，随后以特定的巴西曲霉作为发酵微生物制备的发酵果油产品的锁水能力更优。
[0106]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种发酵果油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将驯化后的巴西曲霉稀释，得巴西曲霉菌液；(2)在发酵底物中接种巴西曲霉菌液，并在35～40℃下发酵48～75h，分离所得混合物，所得上层澄清液即为发酵果油；所述发酵底物中含有20～25wt％橄榄油，所述巴西曲霉菌液的接种量为3.5～5.5wt％。2.如权利要求1所述发酵果油的制备方法，其特征在于，所述驯化包括以下步骤：将发酵底物加入巴西曲霉中进行一次驯化；随后对混合物进行洗脱，取部分洗脱产物接种至另一发酵底物中进行二次驯化，将所得菌悬液稀释80～100倍，得巴西曲霉菌液。3.如权利要求2所述发酵果油的制备方法，其特征在于，所述二次驯化时，洗脱产物与发酵底物的体积比为(0.5:9.5)～(1.5:8.5)。4.如权利要求1所述发酵果油的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵底物包括以下质量含量的组分：0.6～1wt％葡萄糖、1～1.5wt％蛋白胨、牛肉膏0.5～1wt％、20～25wt％橄榄油、0.02～0.1wt％mgso4、0.15～0.25wt％k2hpo4以及0.04～0.05wt％cacl2。5.如权利要求1所述发酵果油的制备方法，其特征在于，发酵底物的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合并调节所得混合物ph至5.5～6.5，随后加热灭菌，即得所述发酵底物。6.如权利要求1所述发酵果油的制备方法，其特征在于，所述巴西曲霉菌液的接种量为4.5～5.5wt％。7.如权利要求1所述发酵果油的制备方法，其特征在于，所述发酵时间为70～75h。8.如权利要求1～7任一项所述发酵果油的制备方法制备得到的发酵果油。9.如权利要求8所述发酵果油在制备化妆品中的应用。10.一种精华油，其特征在于，包括权利要求8所述发酵果油和辛酸/癸酸甘油三酯，两者的质量会占比为(3:97)～(1:99)。

技术总结
本发明公开了一种发酵果油及其制备方法与应用，属于日化用品技术领域。本发明所述方法以巴西曲霉为发酵微生物，在特殊工艺下对橄榄油进行发酵处理，所得发酵果油中的大分子物质(甘油三酯)被有效转化，应用在护肤品中时油腻感低，肤感好，可以迅速在皮肤上铺展，同时该产物没有造成功能散失，甚至具有比原橄榄油更好的抗氧化、保湿补水功能。保湿补水功能。


技术研发人员：蔡红丽 张子生 薄海侠 潘翠霞 钟妙如 杨志坚 陈明华
受保护的技术使用者：深圳市仙迪化妆品股份有限公司
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/10/7