一种集胞藻PCC6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体及应用的制作方法

一种集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体及应用。


背景技术：

2.集胞藻pcc6803隶属蓝藻门(cyanophyta)、蓝藻纲(cyanophyceae)、色球藻目(chroococcales)，色球藻科(chroococcaceae)，集胞藻属(synechocystis)。其中pcc是法国巴斯德研究所蓝藻保藏库(pasteur culture collection)英文的缩写，6803是集胞藻的编号。集胞藻pcc6803以球形单细胞的形式在淡水介质中生长，最初是从1968年加利福尼亚州伯克利附近的淡水栖息地分离出来的。它对海水有很强的适应能力，在盐浓度高达正常海水的2倍时，仍然会生长。当集胞藻处于指数生长时期时，在海水中的倍增时间为30h，而在淡水中的倍增时间为26h。
3.集胞藻6803除了由质膜、肽聚糖层和外膜组成的细胞包膜外，还包含一系列内部类囊体膜，它们包围着类囊体腔。围绕着外膜外面存在s层，它是一种准晶质蛋白层。类囊体膜存在允许分子或蛋白质运输的穿孔。在细胞质中心区域存在羧基体，以及积累糖原、蓝藻素、聚羟基丁酸酯、脂质和多磷酸盐的各种储存体。集胞藻中的类囊体膜排列更复杂，三维成像表明，大多数类囊体膜排列成堆叠的平行薄片，这些薄片在质膜附近。
4.在自然转化过程中复杂的dna摄取机制仍然没有得到很好的描述，特别是在革兰氏阴性细菌中，转化的dna在进入细胞质之前必须穿过两层膜和肽聚糖。dna摄取机制被假设为假纤毛的形式，在重复地伸展和回缩循环后，它会将外部dna拉向细胞表面或进入周质空间，然后跨细胞膜转位。iv型菌毛被描述为直径约为6nm且可变长度可达2.5μm的柔性附属物。这些菌毛由由保守的pila基因编码的重复菌毛蛋白亚基的聚合物组成。在聚合之前，pila单体被pild蛋白修饰。蛋白pilb和pilt分别用于通过聚合和解聚pila亚基来延伸和缩回臂。外膜孔由pilq单体组成，这些外膜孔可以使菌毛延伸通过的，pilc、pilm、piln和pilo亚基的组合构成了菌毛锚定在内膜部件。此外，还有一些促进dna通过内膜进入细胞质的蛋白质，包括coma、come和comf。此外，集胞藻pcc 6803的pilj、pill-c和hfq蛋白质参与自然转化。
5.集胞藻pcc6803是单细胞微藻，它的细胞壁具有革兰氏阴性菌特点，不仅具有细胞外膜和质膜，还有类囊体膜，它可以进行自养生长，也能利用葡萄糖来异养生长，是天然的感受态，为基因工程的顺利进行提供了便利。集胞藻特点明显：
①
生长迅速，适应性强，饲养成本低，本身无毒无污染；
②
基因组已完全测序，遗传背景清晰；
③
天然的感受态细胞能进行自然转化。
6.集胞藻pcc 6803具有重要的商业价值，与细菌和真菌相比，蓝藻集胞藻6803(synechocystis sp.pcc 6803)作为底盘最主要的优势是能够利用光合作用从阳光中捕获能量，并将co2转化为目标产品，在生产高值产品的同时，起到碳减排的作用。与真核藻类和植物相比，集胞藻6803优势明显，它可以将高达9％的太阳能转化为生物量，远高于高等植
物的0.5-3％。蓝藻的生长速度远比高等植物快，没有根、茎、叶、花和果实的分化，使更多的碳、能量流导向感兴趣的产品。
7.集胞藻pcc 6803基因工程研究较为明确，集胞藻6803基因组简单且已经完成全基因组测序，遗传操作方法已经体系化，容易改造代谢通路。相比之下，真核藻类的遗传复杂性使得其代谢工程更具挑战性。值得一提的是，集胞藻可以在干旱等土地上的生物反应器中培养，从而最大限度地减少与农作物的竞争。
8.集胞藻pcc6803是科学研究中重要的模式生物。它是第一个被完全测序的光养生物，结合了植物的特征和微生物的特征：可以进行光合作用，同时培养简单，遗传转化方便。然而，由于蓝藻基因组的高倍性和动态变化的倍性，蓝藻是一个复杂的系统。因此，集胞藻6803的基因组修饰是一个繁琐的过程，需要多次在有抗性的培养基中繁殖多代，才能完全分离突变的基因组。在集胞藻pcc6803已经被完全测序的基础上，集胞藻产藻蓝蛋白表达载体的难点在于中性位点以及高效启动子的选择。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体及应用。
10.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
11.一种集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，载体含启动子、终止子和启动子和终止子之间插入外源目的基因，以及选择标记基因；其中，外源目的基因为聚球藻7942产藻蓝蛋白合成基因hemf-syf。
12.所述载体以pbluescriptⅱks(+),pbi221作为出发载体。
13.所述载体为集胞藻pcc6803中性位点的上游臂、启动子、外源目的基因、终止子、选择标记基因和集胞藻pcc6803中性位点的下游臂。
14.所述集胞藻pcc6803中性位点的上游臂序列为seq id no:3所示碱基序列；
15.集胞藻pcc6803中性位点的下游臂序列为seq id no:4所示碱基序列；
16.外源目的基因含seq id no:6所示碱基序列；
17.选择标记基因为seq id no:5所示的碱基序列。
18.所述启动子为调控外源目的基因的组成型启动子；其中，启动子为seq id no:1所示的碱基序列；
19.所述终止子调控外源目的基因的终止子；其中，终止子为seq id no:2所示的碱基序列。
20.一种所述集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体的应用，所述集胞藻pcc 6803过表达藻蓝蛋白基因载体在获得过表达提高藻蓝蛋白含量的集胞藻pcc 6803中的应用。
21.具体，将聚球藻7942藻蓝蛋白合成基因导入至所述构建的载体再导入集胞藻pcc 6803中，经培养筛选获得转基因集胞藻pcc 6803。
22.本发明所具有的优点：
23.本发明利用了聚球藻7942藻蓝蛋白合成基因hemf-syf为外源目的基因重组到集胞藻pcc 6803基因组的载体。并获得了表达藻蓝蛋白的高产集胞藻突变株。与现有技术相
比，本发明实现了集胞藻pcc 6803基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：
24.1.本发明提供了集胞藻pcc 6803基因组上中性位点(nsc2)可以用来作为外源基因表达盒插入位点。
25.2.本发明提供了集胞藻pcc 6803基因组上高效表达基因的强组成型启动子，用于构建集胞藻pcc 6803表达载体，提高外源基因高效表达，获得高产产物。
26.3.本发明提供了大肠杆菌基因组上表达的终止子。
27.4.集胞藻pcc 6803是一种既能光合自养，又能利用葡萄糖等营养物质进行异养的藻种，能够利用光合作用从阳光中捕获能量，利用本发明在该藻中利用co2生产目标产品的同时生产藻蓝蛋白高附加值产物。
附图说明
28.图1为本发明实施例提供的转基因集胞藻pcc 6803过表达载体质粒示例图。
29.图2为本发明实施例提供的转基因集胞藻pcc 6803同源重组过表达载体图谱。
30.图3为本发明实施例提供的pcr产物电泳图(其中m为分子标记dl8000；泳道wt为野生株；泳道bar为阳性转基因藻株)
31.图4为本发明实施例提供的转基因集胞藻pcc 6803sds-page电泳图(其中泳道wt为野生株；泳道mutant为阳性转基因藻株)
32.图5为本发明实施例提供的转基因集胞藻pcc 6803western杂交图(其中泳道wt为野生株；泳道mutant为阳性转基因藻株)
具体实施方式
33.以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述。
34.下述实施例中集胞藻pcc6803为购自中国科学院淡水藻种库(fachb)，藻种库的编号为fachb-898。；聚球藻7942为购自中国科学院淡水藻种库(fachb)，藻种库的编号为fachb-805。。
35.实施例1目的片段的克隆
36.设计并合成如下引物：
37.seq1-for：5
’‑
gatgtcgacacctgtagagaagagtccct-3’38.seq1-rev：5
’‑
tgaattaatctcctacttgac-3’39.seq2-for：5
’‑
gatgaattcctgttttggcggatgagagaa-3’40.seq2-rev：5
’‑
gatctgcagaagagtttgtagaaacgcaaaaagg-3’41.seq3-for：5
’‑
gatggtaccgcgatatattggtgaagcaattcc-3’42.seq3-rev：5
’‑
gatctcgagctgtatggaatcaaatcgatagtttcc-3’43.seq4-for：5
’‑
gatgcggccgcaattccttgactagggctaaaaatagg-3’44.seq4-rev：5
’‑
gatgagctctaaattaccctggcaggaatgg-3’45.seq5-for：5
’‑
gatggatcctgatcggcacgtaagaggttc-3’46.seq5-rev：5
’‑
gatggatccaatagacataagcggctatttaacga-3’47.其中引物seq1-for和seq1-rev的扩增产物是seq id no:1；seq2-for和seq2-rev的扩增产物是seq id no:2；引物seq3-for和seq3-rev的扩增产物是seq id no:3；引物
seq4-for和seq4-rev的扩增产物是seq id no:4；引物pcpc560-for和pcpc560-rev的扩增产物是seq id no:5；其中引物seq6-for和seq6-for的扩增产物是seq id no:6；引物seq7-for和seq7-rev的扩增产物是seq id no:7。
48.以集胞藻pcc6803基因组总dna为模板，经引物seq1-for和seq1-rev进行pcr扩增，反应程序为:95℃3min预变性；94℃30sec,55℃30sec,72℃80sec，共32个循环；72℃5min延伸。pcr扩增产物是集胞藻pcc6803基因组组成型启动子pcpc560序列，其为560bp，即为片段seq id no:1。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
49.以大肠杆菌基因组为模板，经引物seq2-for和seq2-rev进行pcr扩增，反应程序为:95℃3min预变性；94℃30sec,55℃30sec,72℃80sec，共32个循环；72℃5min延伸。pcr扩增产物是大肠杆菌rrnb基因t1t2终止子序列，其为437bp，即为片段seq id no:2。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
50.以集胞藻pcc6803基因组总dna为模板，经引物seq3-for和seq3-rev进行pcr扩增，反应程序为:95℃3min预变性；94℃30sec,55℃30sec,72℃150sec，共32个循环；72℃5min延伸。pcr扩增产物是中性位点的上游臂，其为988bp，即为片段seq id no:3。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
51.以集胞藻pcc6803基因组总dna为模板，经引物seq4-for和seq4-rev进行pcr扩增，反应程序为:95℃3min预变性；94℃30sec,55℃30sec,72℃150sec，共32个循环；72℃5min延伸。pcr扩增产物是中性位点的下游臂，其为853bp，即为片段seq id no:4。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
52.以pblunt-cm载体(购自丰晖生物，湖南)为模板，经引物seq5-for和seq5-rev进行pcr扩增，反应程序为:95℃3min预变性；94℃30sec,55℃30sec,72℃150sec，共32个循环；72℃5min延伸。pcr扩增产物是氯霉素抗性基因表达盒(cm)，为914bp，即为片段seq id no:5。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
53.同时上述各pcr扩增时扩增体系为50μl，其中2
×
pcr mix，25μl；seq-for，2μl；seq-rev，2μl；模板，1μl；ddh2o，up to 50μl。其中，变性至延伸32个循环。
54.实施例2：过表达载体骨架的构建
55.使用购自湖南丰晖生物科技有限公司的质粒pbluescriptⅱks(+)作为出发载体，使用ecorⅰ和pstⅰ进行酶切，37℃反应30min，65℃反应15min加热失活。同时将pcr扩增获得的终止子t1t2使用ecorⅰ和pstⅰ进行酶切。对片段进行胶回收。连接前为了防止酶切不完全，导致假阳性，进行dna的去磷酸化。将回收的片段用t4连接酶在16℃下连接12h。连接产物用大肠杆菌进行转化，得到正确质粒，命名为pbsk+t1t2。
56.提取质粒pbsk+t1t2，使用sacⅰ和notⅰ进行酶切，同时使用sacⅰ和notⅰ对片段seq id no:4进行酶切，再进行胶回收。使用t4连接酶连接并转化到大肠杆菌中复制，得到质粒，命名为pbsk+t1t2+2d。
57.提取质粒pbsk+t1t2+2d使用kpnⅰ和xhoⅰ进行酶切，将片段seq id no:3使用kpnⅰ和xhoⅰ进行酶切，再进行胶回收。使用t4连接酶连接转化，得到质粒，命名为pbsk+t1t2+2ud。
58.提取质粒pbsk+t1t2+2ud，使用bamhⅰ进行酶切得到的载体pbsk+t1t2+2ud抗生素
表达盒cm片段，再进行胶回收。使用t4连接酶连接转化，使用得到质粒，命名为2ud+cm并进行质粒提取。
59.实施例3按照上述实施例获得的载体在集胞藻pcc6803转化中的应用
60.下面将聚球藻7942藻蓝蛋白合成基因hemf-syf和片段seq id no:1进行重叠，将重叠片段seq id no:1+hemf-syf插入载体2ud+cm而后导入集胞藻pcc 6803中，通过检测外源基因的表达来检测该载体的性能。
61.1.过表达载体的构建
62.seq6-for：5
’‑
tcaagtaggagattaattcaatgcagaccctgcaagacga-3’63.seq6-rev：5
’‑
taatgatgatgatgatgatgggcggtcggccagttgac-3’64.2udpt-for：5
’‑
catcatcatcatcatcattaggaattcctgttttggcggatgagagaag a-3’65.2udpt-rev：5
’‑
tgaattaatctcctacttgactttatgagt-3’66.以聚球藻7942基因组总dna为模板，经引物seq6-for和seq6-rev进行pcr扩增，pcr扩增产物是hemf-syf序列，其为954bp，即为片段seq id no:6。扩增完成后，片段经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收(诺唯赞公司试剂盒)纯化备用。
67.将片段seq id no:1与片段seq id no:6按照2
×
pcr mix，25μl；seq id no:1，2μl；seq id no:6，2μl；ddh2o，up to 46μl。反应程序为：95℃3min预变性；95℃30sec变性；55℃30sec退火；72℃60sec延伸。其中，变性至延伸5个循环，进行第一部分融合pcr反应。扩增完成后，向第一步pcr产物加入引物seq1-for和seq6-rev各2μl，进行反应程序为95℃30s预变性；95℃15s变性；55℃15s退火；72℃90sec延伸；72℃300sec后延伸。其中，变性至延伸25个循环，得到重叠后的片段seq id no:1+hemf-syf。
68.引物2udpt-for和2udpt-rev反向pcr进行环p过表达质粒框架2ud+cm得到环p产物。将聚球藻7942(syf)藻蓝蛋白合成基因hemf-syf和片段seq id no:1的重叠片段按照线性化载体，(0.02*片段碱基对数)ng；2ud+cm，(0.04*片段碱基对数)ng；5
×
ce buffer，4μl；exnase，2μl；ddh2o，up to 20μl的体系，37℃反应30min。
69.重组完成后立即转化进大肠杆菌。转化后使用通用引物m13-f和m13-r进行菌体pcr进行阳性验证，而后利用阳性菌液进行提质粒，测序，得到过表达质粒。
70.2.集胞藻pcc 6803的转化
71.转化前几天，将新鲜的集胞藻pcc 6803的藻液加入终浓度为2mmedta，培养至对数生长期，取6ml藻液4000rpm离心10min，弃上清，用bg11液体培养基洗涤重悬，4000rpm离心10min，弃上清，重复4-5次，加新鲜培养液洗涤，用于转化分装。取300μl藻液到ep管中，加终浓度为1μg/100μl上述实施例3获得质粒，弱光照培育6h，每3h颠倒几次，将无菌的混合纤维酯膜放置于没有抗性的固体培养基中，浸润完全后，将温育完全后的藻液涂布于混合纤维酯膜上，晾干后用封口膜密封，倒置培养24h，24h后将混合纤维酯膜转入含有cm抗性(cm含量为50微克每升)的bg11固体培养基上培养数天，直至转化子单藻落长出。
72.3.集胞藻转化子的筛选与鉴定
73.将在抗性的固体培养基上长出的上述步骤2获得单藻落挑出，在含有相同抗性的平板上划线，传代四代，挑取藻落接种在含有cm抗性(cm含量为50微克每升)的bg11液体培养基中，在30℃下培养4天，离心收集藻液，提取集胞藻基因组dna。使用nsc2u-f和nsc2d-r引物扩增转化子和野生型集胞藻，通过电泳比较野生型电泳条带大小获得转化成功的集胞
藻转化子(参见图3)。
74.将生长在固体平板上的突变株挑取到bg11液体培养基培养，将藻种放到摇床30℃，160rpm进行活化并进一步扩培。收集藻液，进行藻蓝蛋白含量检测，蛋白质提取。
75.在30℃培养集胞藻至对数生长期，4000rpm离心10min收集藻液。去上清，加入500μl的蛋白提取buffer(已加入终浓度为1mm的pmsf)。功率50w，5s工作，5s间歇，超声10min。超声结束，13000rpm，4℃离心30min收集上清液，上清液即为可溶蛋白。
76.将突变株蛋白进行sds-page电泳，但使用nsc2位点过表达基因不能利用电泳图判断转入的基因表达为蛋白，蛋白电泳图与野生型基本一致(参见图4)。因此要验证突变株中过表达基因是否表达，还要进行western blot免疫杂交检测。杂交结果显示，过表达聚球藻7942来源的藻蓝蛋白合成基因突变株约为37.1kda，未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图5)，突变株插入基因均表达。
77.实施例4按照上述实施例获得的集胞藻突变株中检测藻蓝蛋白的含量
78.取20mg冻干后的上述实施例获得藻株的藻粉，用1ml的0.05mol/l磷酸盐缓冲液(ph＝6.8)将其重悬。将重悬液放置于-80℃冷冻24h，然后在4℃的恒温金属浴中解冻。将溶解的样品溶液进行超声破碎，得到的粗提物以12000g低温离心10min，收集上清液。利用分光光度计，分别测量上清液在615nm和652nm波长处的吸光度，并根据公式c-pc(mg/ml)＝(a
615-0.474a
652
)/5.34计算藻蓝蛋白(c-pc)的含量。结果表明，过表达聚球藻7942来源的藻蓝蛋白合成基因突变株藻蓝蛋白含量为0.0132mg/ml显著高于野生型集胞藻6803藻蓝蛋白含量0.00288mg/ml。
79.上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了聚球藻7942藻蓝蛋白合成基因hemf-syf在集胞藻6803基因组中实现共表达，证明了外源基因在集胞藻中实现藻蓝蛋白含量增长，证明了本发明载体调控外源基因在集胞藻基因组中表达外源基因的能力，可以实现藻蓝蛋白基因的高效表达。
80.seq id no.1
[0081]5’‑
tgaattaatctcctacttgactttatgagttgggattttcttaaacacaattcccc cggataaactgagggagtccaaagtaatgaccctagagttattgttactgatctccattaactttcgttaactacccggggatttatgagagatattacctaaataaatccagggagaaacacggaggcagcgacaagggccaccgggatgctcaaacagctcagcgcctaggcttgaatgcttttgcaatcccacagttaactttatacaacggtgatgggacttatgtctgttacatcttgttaattttattcctgcttttttgttaagtaatgttgcaggggattctcagattgtcctggattgggaagggaagacaaccagtttcgttcagcttatgttttagggctaaaattatgcaattgatgttcggtgcgaacttttctcgtttttttagtttccagtggggtagggaagactgttgcctagggaaccacagcctactttcctttttgagctttttatcccaccattttgatattcagggactcttctctacaggt-3
‘
[0082]
(a)序列特征：pcpc560
[0083]
●
长度：560bp
[0084]
●
类型：碱基序列
[0085]
●
链型：单链
[0086]
●
拓扑结构：线性
[0087]
(b)分子类型：dna
[0088]
(c)假设：否
[0089]
(d)反义：否
[0090]
(e)最初来源：集胞藻pcc6803基因组
[0091]
seq id no.2
[0092]5’‑
ctgcagaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctg cttaatttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttcgcaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagttccctactctcgcatggggagaccccacactaccatcggcgctacggcgtttcacttctgagttcggcatggggtcaggtgggaccaccgcgctactgccgccaggcaaattctgttttatcagaccgcttctgcgttctgatttaatctgtatcaggctgaaaatcttctctcatccgccaaaacaggaattc-3
‘
[0093]
(a)序列特征：t1t2
[0094]
●
长度：437bp
[0095]
●
类型：碱基序列
[0096]
●
链型：单链
[0097]
●
拓扑结构：线性
[0098]
(b)分子类型：dna
[0099]
(c)假设：否
[0100]
(d)反义：否
[0101]
(e)最初来源：大肠杆菌rrnb基因
[0102]
seq id no.3
[0103]5’‑
tcgagctgtatggaatcaaatcgatagtttcccgaattgatttatattcatccgttcc ttcaaagctaatcggttcattatttgtgagagcttttagcccgtagaagagattcatgatgctacacatcatcattgcccccccgcgcaaagtaaataaggatctaccaatccgacgaaagattgcttgcaggctaaaggctgatctccacaaatctcggtgggcttttaaaagctctgcaggggtcattttactgggcacgaatgtgacattatagccattgtaaaactcccaccccaaatccgaacgcaaccgatccgtatccatcatctttgagtatgaacgcgtgcctttaaaaggagtaagaatgctcaaaaatggcacatcaacaccaatttcctccagttggttggccatatcccggatgctttctggggtatctccatccaaaccggaaataaaaccagccatcacgccaatgccacggtcatgcaattttttgattttgccttgatattctgcgactttgttttggcgttttcccgcatcctccaaggattcctggccaaatgactcaatcccgaaaaaaattccgatgcaaccagagtctcgcattaaatctaacagctcgtcatccttggtaatatccatacttgcttgggtcaaccaccactttcgcaggggtatcatctggcgcagaagttctttgatatagggtctatttgccgtcaaattatcatcccaaaaccagacagtttttcgttgccaccaccatttgaatttgttgtatcggatgtcgttcagcaccgcctcgacagggcgagtacgaaagccgggattgagaacgggtacagtgcagaatgagcaggtaaatggacatcctctagtggcttgaacaacccgtcgaatgaagtactgcggaggtaacaggtcgtaccggggagtggggatatttgtgaggggaattgcttcaccaatatatcgcggtac-3
‘
[0104]
(a)序列特征：nsc2u
[0105]
●
长度：988bp
[0106]
●
类型：碱基序列
[0107]
●
链型：单链
[0108]
●
拓扑结构：线性
[0109]
(b)分子类型：dna
[0110]
(c)假设：否
[0111]
(d)反义：否
[0112]
(e)最初来源：集胞藻pcc6803基因组
[0113]
seq id no.4
[0114]5’‑
agctctaaattaccctggcaggaatggcccctactgcaatcagcctcaccaaaa atccattgtgcggttaatacctgtcaatactcgttcactcctgccccaacttccgttacccatcccactaatttcaccgccaagctccaccgttacctatgccctgaactgcgaattttgcatctgattggcaacagtgatggcattgacctcgaacccgatcgccagatattggctaatttgactaaaaataggggcttgagggtgcaagttaccgaactattacagccagactatggccaacttagtcgtactctgcgccgatcgccaggttttgatctgtttgtttactctggccacagtgaagcctcctatggccaagaactagcagcgatgttatttgcaggacgacagggggtaactatccccgatctgcaactttccttccaacaggcgatcgcctcgggtccaggatttgatccaccgtcaaatagttatcgggggcggggctaaaaagttatgcaaaatcagtaaaatattttttctctcccattgaatgagccctagataagtgaaatattaatgtccaaagctttgatagggtaaggatttcagcccagtaaattaatagtgaaatattaatgtccaaagctttgatagggtaaggatttcagcccagtaaattaattttgttgaggtacattgaataacttttcccccatgggccgataactctacagttctgccaaagacgaggaatatcacaatgagtgcaattcaacctgttattcaagttttatcgcaattaacggtctatcaaacgccacctatttttagccctagtcaaggaattgcggcc-3
‘
[0115]
(a)序列特征：nsc2d
[0116]
●
长度：853bp
[0117]
●
类型：碱基序列
[0118]
●
链型：单链
[0119]
●
拓扑结构：线性
[0120]
(b)分子类型：dna
[0121]
(c)假设：否
[0122]
(d)反义：否
[0123]
(e)最初来源：集胞藻pcc6803基因组
[0124]
seq id no.5
[0125]5’‑
tgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactacc gggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcactatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggttgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattg-3
‘
[0126]
(a)序列特征：cm
[0127]
●
长度：914bp
[0128]
●
类型：碱基序列
[0129]
●
链型：单链
[0130]
●
拓扑结构：线性
[0131]
(b)分子类型：dna
[0132]
(c)假设：否
[0133]
(d)反义：否
[0134]
(e)最初来源：大肠杆菌基因组
[0135]
seq id no.6
[0136]5’‑
atgcagaccctgcaagacgagatttgcgcaggtctagaagcgctcgatggcggtggccaatttcgagaggacagctgggagcgt cctgaagggggtggcgggcgatcgcgcgtcatccgtgaaggtaatgtcttcgagcagggcggcgttaacttctcggaagtctggggcgaaaaactgccgccttcgatcctggcgcagtatcccgaagctgccggccatggctactttgcgacgggcacctcgatggtgctgcacccgcgcaatccctacatcccaacggtgcacctcaactatcgctacttcgaggcagggcctgtctggtggtttggcggcggcgctgacctaacgccctactatccctttgcggaagacgccaagcacttccacagcagctttaaggctgcttgcgatcgccactacccgcagttctacgacgtcttcaaactgtggtgtgatgagtacttcttcctcaagcatcgcggtgaaacgcgcggcattggcggcatcttcttcgactaccaagacgggcgtggcgacctctacaacaaggggcccgctccttccggccctgcgggtcaaaaagcggctgaagtcggcattgtttccgatctcaactgggaaaaactgtttgcttttgcccaagattgcggtcgtaccttcctgccagcctacagtccgatcgtggaacgtcgcaaagataccccttggggcgatcgcgagcgccaattccagctctaccgtcgaggccgctacgtcgaattcaaccttgtttacgatcgcggcacgattttcgggctgcaaactaacggccgcaccgagtcgatcctgatgtccttgccgccgctggtgcgctgggaatacatgtatcaaccggaggccggcagtcgcgagcaagagctctacgatgtcttcctcaagccccaagactgggtcaactggccgaccgcctag-3
‘
[0137]
(a)序列特征：hemf-syf
[0138]
●
长度：954bp
[0139]
●
类型：碱基序列
[0140]
●
链型：单链
[0141]
●
拓扑结构：线性
[0142]
(b)分子类型：dna
[0143]
(c)假设：否
[0144]
(d)反义：否
[0145]
(e)最初来源：聚球藻7942基因组。

技术特征：
1.一种集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，其特征在于：载体含启动子、终止子和启动子和终止子之间插入外源目的基因，以及选择标记基因；其中，外源目的基因为聚球藻7942产藻蓝蛋白合成基因hemf-syf。2.按权利要求1所述的集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，其特征在于：所述载体以pbluescriptⅱks(+),pbi221作为出发载体。3.按权利要求1或2所述的集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，其特征在于：所述载体为集胞藻pcc6803中性位点的上游臂、启动子、外源目的基因、终止子、选择标记基因和集胞藻pcc6803中性位点的下游臂。4.按权利要求3所述的集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，其特征在于：所述集胞藻pcc6803中性位点的上游臂序列为seq id no:3所示碱基序列；集胞藻pcc6803中性位点的下游臂序列为seq id no:4所示碱基序列；外源目的基因含seq id no:6所示碱基序列；选择标记基因为seq id no:5所示的碱基序列。5.按权利要求3所述的集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体，其特征在于：所述启动子为调控外源目的基因的组成型启动子；其中，启动子为seq id no:1所示的碱基序列；所述终止子调控外源目的基因的终止子；其中，终止子为seq id no:2所示的碱基序列。6.一种按权利要求1所述集胞藻pcc6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体的应用，其特征在于：所述集胞藻pcc 6803过表达藻蓝蛋白基因载体在获得过表达提高藻蓝蛋白含量的集胞藻pcc 6803中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种集胞藻PCC6803藻蓝蛋白相关基因同源表达载体及应用。载体含启动子、终止子和启动子和终止子之间插入外源目的基因，以及选择标记基因；其中，外源目的基因为聚球藻7942产藻蓝蛋白合成基因HemF-syf。采用本发明的集胞藻PCC 6803稳定表达系统,可实现藻蓝蛋白稳定表达。6803稳定表达系统,可实现藻蓝蛋白稳定表达。


技术研发人员：高政权 孟春晓 邵亚萍 曹凯 王晓东 崔玉琳 张浩 王萌
受保护的技术使用者：烟台泓源生物肥料有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/10/7