密度调节液体及其使用方法与流程

密度调节液体及其使用方法
1.相关申请
2.本技术要求2020年11月25日提交的美国临时专利申请号63/118,160的权益，所述美国临时专利申请的完整内容据此以引用的方式整体并入。
发明领域
3.本公开涉及浸没和/或悬浮在液体中的颗粒或其亚群，更具体地涉及其中可以在液体培养基中操纵此类颗粒的分布或定位的应用。
4.发明背景
5.无论是在使用中、合成过程中还是其他情况下，颗粒通常都浸没在液体环境中。例如，可以在液体培养基中合成纳米颗粒、微粒等，或者可以在液体培养基中测定或培养细胞。由于这些操作是在液体培养基中进行的，例如在合成、测定、取样或回收颗粒时，因此出现了许多挑战。
6.密度高于液体培养基密度的颗粒将趋向于在液体培养基内沉降，这可能会限制它们的表面积暴露于合成所需的亚基或在测定情况下暴露于反应物。此外，颗粒沉降的趋向导致液体内有偏移(例如，非均质)的分布，潜在地影响测定或(连续)取样操作。虽然在一些情况下颗粒的沉降可能促进它们的回收，但在其他情况下，当例如颗粒群体由一个或多个颗粒亚群组成并且仅对某个亚群感兴趣时，这种趋向可能是不期望的。
7.在液体中重新分布颗粒的方法是已知的，但此类方法可能繁重、耗时和/或干扰合成、测定、取样或回收操作，或者通常可负面地影响颗粒的健康、质量或良好状态。
8.在基于细胞的应用的特定背景下，细胞培养过程越来越多地从单层条件适应悬浮条件。虽然悬浮培养条件可能更经济，但就每单位体积培养基的细胞输出数量而言，许多挑战阻碍了广泛采用。例如，在悬液中生长的细胞趋向于沉降到培养器皿或容器的底部。为了实现悬浮培养的潜在益处，细胞应维持悬浮状态，这通常通过搅动培养基来实现。然而，搅动培养基会影响含颗粒液体的液-气或液-液界面的质量传递，这可能会增加培养基的氧合和/或对细胞生长培养物施加剪切力。尽管各种细胞培养生物反应器已经商业化，但至少上述原因阻碍了悬浮条件在许多细胞培养过程中的广泛采用。
9.因此，需要能够在悬浮于液相中时实现具有成本和时间效率的合成(例如生长)、测定、取样和/或回收颗粒(例如细胞)而不负面地影响它们的健康、质量或良好状态的试剂和工艺。


技术实现要素：

10.本公开涉及密度调节液体和使用密度调节液体的方法。
11.在本公开的一个方面，提供了操纵液体体积/柱内的颗粒群体或其一个或多个亚群的定位的方法。此类方法可包括：a)将颗粒群体或其一个或多个亚群暴露于液体，所述液体补充有比重调整剂(specific gravity-modifying means)并且具有不等于一(unity)的(相对)比重；和b)影响(和/或实现改变)颗粒群体或其一个或多个亚群在液体体积/柱内的
浮力。
12.在一个实施方案中，颗粒群体是细胞悬液，并且所述群内的亚群可分别包含活细胞和垂死或死细胞。因此，本公开的液体和/或方法可用于从液体的共同体积/柱的重复取样/等分操作中，无论是手动还是自动，降低将死细胞或垂死细胞吸入子孔的风险，同时在这样的操作期间在接种的子孔中实现均匀或基本均匀的接种密度(与未补充比重调整剂和/或具有等于一或基本等于一的比重的液体相比)。
13.在一个实施方案中，液体的(相对)比重小于一的+/-0.5％。在一个实施方案中，液体的(相对)比重大于一的+/-0.5％。在一个实施方案中，颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度不同于液体的密度。在一个实施方案中，液体的比重等于一。
14.在一个实施方案中，方法还可包括在颗粒群体或其一个或多个亚群与液体接触之前或之后通过改变比重调整剂在液体中的浓度来调节液体的比重。
15.在一个实施方案中，降低液体中比重调整剂的浓度包括用另外的液体(例如，包含较低浓度的比重调整剂或不含比重调整剂的相同或不同液体)稀释液体。在一个实施方案中，增加液体中比重调整剂的浓度包括向液体添加另外的相同或不同的比重调整剂，无论是固体/粉末形式还是浓缩液体原料。
16.在一个实施方案中，方法还可包括向液体施加能量输入以将颗粒群体或一个或多个亚群分布在整个液体体积/柱中。在一个实施方案中，能量输入是湍流混合力。在一个实施方案中，颗粒群体或其一个或多个亚群均匀或均质地分布在整个液体体积/柱中。
17.在一个实施方案中，增加的液体比重对应于减少的在液体体积/柱内分布颗粒群体或一个或多个亚群的能量输入。换句话说，液体的(相对)比重(例如密度)与用于在整个液体体积/柱中分布颗粒群体的能量输入水平成反比。
18.在一个实施方案中，方法还可包括停用能量输入。
19.在一个实施方案中，在停用能量输入之后，在整个液体体积/柱中维持颗粒群体或一个或多个亚群的(均质或均匀)分布。
20.在一个实施方案中，方法还可包括从液体体积/柱中去除第一等分试样的颗粒。在一个实施方案中，方法还可包括从液体体积/柱中去除第二等分试样的颗粒，其中第二等分试样中的颗粒浓度在第一等分试样中的颗粒浓度的约80％或更多内。
21.在一个实施方案中，群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度与液体的比重(例如密度)相同或在液体的比重(例如密度)约+/-3％以内，并且颗粒群体或其一个或多个亚群在液体体积/柱内呈中性浮力。
22.在一个实施方案中，方法还可包括使颗粒群体或一个或多个亚群从液体体积/柱的下部向上偏移或朝向液体体积/柱的下部向下偏移。
23.在一个实施方案中，群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度低于液体的比重(例如密度)，并且群体或亚群向上偏移或偏移到液体体积/柱的气液界面。在一个实施方案中，在颗粒群体或一个或多个亚群与液体接触之前，颗粒群体或一个或多个亚群沉降在液体体积/柱内，并且在开始与液体接触之后在液体体积/柱内向上偏移。
24.在一个实施方案中，群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度高于液体的比重(例如密度)，并且群体或亚群沉降在液体体积/柱内。
25.在一个实施方案中，液体的比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。
26.在一个实施方案中，液体的比重大于或小于一的+/-3％。
27.比重调整剂可以是存在于液体中或可以添加到液体中并且将具有调整液体(相对)比重的效果的任何物质。比重调整剂的实例可以包括，无论是液体还是固体形式，碘化化合物(例如碘克沙醇、碘帕醇、碘海醇等)、全氟化合物、全氟萘烷、盐(例如nacl、钨盐等)，或密度梯度培养基，例如可以以商标名lymphoprep
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、nycodenz
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、percoll
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等销售的密度梯度培养基。在一个实施方案中，比重调整剂是比重调整可溶性固体或可混溶溶液。在一个实施方案中，比重调整可溶性固体是碘克沙醇。在一个实施方案中，比重调整可混溶溶液是水可混溶的。在一个实施方案中，比重调整可混溶溶液是非离子碘化溶液。在一个实施方案中，非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。
28.在一个实施方案中，颗粒群体或其一个或多个亚群是细胞群或亚群。在一个实施方案中，细胞群或一个或多个亚群是单个细胞或细胞聚集体。在一个实施方案中，细胞群或一个或多个亚群是干细胞、原代组织来源的细胞或组织碎片，或细胞系。在一个实施方案中，干细胞是多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞。在一个实施方案中，细胞群或一个或多个亚群是中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞。
29.在一个实施方案中，液体是细胞培养基。
30.在一个实施方案中，方法还可包括在液体体积/柱内培养和/或扩增细胞群或一个或多个亚群。在一个实施方案中，细胞群或一个或多个亚群的生长和/或健康和/或质量在液体中没受不利影响。
31.在本公开的另一方面，提供了用于操纵颗粒群体或其一个或多个亚群的定位和/或浮力的液体，其包含稀释剂和比重调整剂，其中液体的比重不是等于一。
32.在一个实施方案中，比重调整剂是比重调整可溶性固体或可混溶溶液。在一个实施方案中，比重调整可溶性固体是碘克沙醇。在一个实施方案中，比重调整可混溶溶液是水可混溶的。在一个实施方案中，比重调整可混溶溶液是非离子碘化溶液。在一个实施方案中，非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。
33.在一个实施方案中，颗粒群体或其一个或多个亚群是细胞群或一个或多个亚群。
34.在一个实施方案中，稀释剂是缓冲液或细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是水性的。在一个实施方案中，细胞培养基是均质的。在一个实施方案中，液体的粘度在水的10％以内。在一个实施方案中，粘度在37℃下为约0.69cp。
35.在一个实施方案中，液体的比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。
36.在一个实施方案中，液体还可包含缓冲液、无机盐、微量元素、脂质、白蛋白、生长因子和细胞因子中的一种或多种。
37.在一个实施方案中，比重调整剂不隔离在细胞群或一个或多个亚群内。
38.在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度高于液体的比重。在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度低于液体的比重。在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度与液体的比重相同或在液体的比重的+/-3％内。
附图说明
39.为了更好地理解本文所述的各种实施方案，并且为了更清楚地示出可以如何实现这些各种实施方案，将以举例的方式参考示出至少一个示例性实施方案的附图，并且现在加以描述。附图不意图限制本文所述的教导的范围。
40.图1显示了用于培养细胞(在这种情况下为psc)的培养基密度与使细胞悬浮在整个在本公开的密度调节培养基中的最小rpm之间的关系图。
41.图2显示了在1.0g/ml mtesr
tm 3d(a)或密度调节为1.048g/ml(b)的mtesr
tm 3d中以20rpm培养的psc聚集体的图像。(c)和(d)中的图像分别是(a)和(b)中图像的放大图。
42.图3显示了在比重为1g/ml(a)、1.024g/ml(b)、1.032g/ml(c)和1.04g/ml(d)的培养基中以20rpm培养3天后stips-f016ipsc形态的代表性图像。比例尺为500μm。
43.图4显示比较在比重基本上为1g/ml的培养基或比重》1g/ml的密度调节培养基中培养的psc聚集体的每日倍数扩增值的图表。对于1g/ml，平均值＝1.027，n＝57。对于》1g/ml，平均值＝1.347，n＝37。框中最低的线代表第25个百分位，中间的线代表第50个百分位(中位数)，最上面的线代表第75个百分位。“晶须”等于1.5xiqr(其中iqr＝四分位距)。p《0.0001学生t检验。
44.图5显示了在密度调节培养基中扩增培养对psc的影响。在比重高于一密度的培养基中生长的图2的细胞在调节至1.032g/ml的培养基中进一步培养，并相对于在标准mtesr1
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(d)中2d生长的对照培养物中tra-1-60水平，评估第4代每日倍数扩增(a)、活力百分比(b)和多能性标志物tra-1-60(c)的表达。
45.图6显示了密度调节培养基对从普通细胞悬液接种到多孔板的各自孔中的psc连续等分试样的影响。与从对照培养基中的悬液中等分试样的细胞相比，从悬浮在密度调节培养基(1.04g/ml)中的细胞等分到子孔中的psc在所有孔中具有更均匀的接种密度(a)和活力百分比(b)(1.0g/ml)。
46.图7显示了比图6更大规模实验的结果，使用机器人液体处理器将psc源悬液的等分试样接种到48个子孔中。(a)当源细胞悬液在标准密度培养基(1.0g/ml)或密度调节培养基(1.04g/ml和1.06g/ml)中包含单一psc时接种效率的直方图。(b)(a)的接种细胞活力的直方图。
47.图8显示了比图6显示的结果更大规模实验的结果，使用机器人液体处理器将psc源悬液的等分试样接种到48个子孔中。(a)当源细胞悬液在标准密度培养基(1.0g/ml)或密度调节培养基(1.04g/ml和1.06g/ml)中包含psc团块时接种效率的直方图。(a)当源细胞悬液在标准密度培养基(1.0g/ml)或密度调节培养基(1.04g/ml和1.06g/ml)中包含psc聚集体时接种效率的直方图。
48.图9显示了阐明在传代操作期间重复、间断地暴露于密度调节培养基对单层维持的psc的潜在影响的实验结果。当将psc培养物传代到子孔中时，解离的psc被重新悬浮并接种在密度调节培养基中培养前48小时。传代10代后，与具有基本等于一比重的培养基相比，使用密度调节培养基累积活细胞产量(a)、活力百分比(b)、多能性标志物的表达水平(c)、评估区域的基因组完整性(d)、核型(e)以及psc分化为培养的psc中的三个胚层(f)没有受到显著影响。
49.图10显示了使用密度调节培养基从微孔板的孔中收获wls-1cpsc聚集体的效果。
与具有标准密度(1.0g/ml)的对照培养基相比，使用调节密度增加(1.1g/ml、1.2g/ml和1.3g/ml)的细胞培养基挽救聚集体损失。
50.图11显示了具有由白色箭头示出的聚集体的任一标准(1g/ml)培养基(a)中和密度调节(1.08g/ml)培养基(b)中液体体积/柱内聚集体差异沉降的照片。(b)的放大照片显示在整个液体(c)的体积/柱中均质或或多或少均质悬浮的单独聚集体。两种细胞悬液分别通过37um网状过滤器后的残留物照片，标准(1g/ml)培养基(d)的残留物中存在聚集体(黑色箭头)。
51.图12显示了使psc聚集体通过过滤器的效果。在将图11的聚集体经过过滤器传代后，针对每种条件，对滤液中回收的细胞进行评估，以确定回收的活细胞数(a)和此类细胞的活力％(b)。数据汇总显示在(c)中。
具体实施方式
52.此公开涉及密度调节液体和使用密度调节液体的方法。更具体地，本公开涉及操纵密度调节液体体积/柱中颗粒或其一个或多个亚群的浮力和/或定位，并且涉及由此操纵密度调节液体体积/柱中颗粒或其一个或多个亚群的浮力和/或定位以执行工艺的应用。
53.在本公开中使用的术语“颗粒”是指任何生物或非生物颗粒。生物颗粒可包括但不限于：原核或真核细胞及其聚集体；亚细胞成分，例如细胞器或细胞外囊泡；蛋白质；核酸；或病毒。非生物颗粒可包括但不限于：包含一种或多种金属和/或准金属或任何其他无机物的颗粒；或非生物但包含有机物质的颗粒。在某些实施方案中，颗粒可以是生物颗粒和非生物颗粒的组合。例如，本公开的颗粒可包含与一种或多种磁性或可磁化颗粒复合的细胞。本公开的颗粒的平均直径范围可以从埃级到毫米。本公开的颗粒应该能够悬浮在本公开的密度调节液体的实施方案中。作为前述的说明性实例，颗粒(或颗粒群体，或颗粒的一个或多个亚群)不应附着或不附着在容器或容器装置的壁上。在一些实施方案中，颗粒或其一个或多个亚群的平均密度与包含它们的液体的比重(或密度)大约相同或在其+/-35％，或+/-30％，或+/-25％，或+/-20％，或+/-15％，或+/-10％，或+/-5％，或+/-3％，或+/-1％，或+/-0.5％之内。在一些实施方案中，颗粒或其一个或多个亚群的平均密度高于包含它们的液体的比重(或密度)。在一些实施方案中，颗粒或其一个或多个亚群的平均密度低于包含它们的液体的比重(或密度)。颗粒的密度相对于液体的密度是本文公开的各种应用的重要考虑因素。
54.在本公开中使用时，术语“颗粒群体或其一个或多个亚群”，包括所述术语的所有变体，是指液体体积/柱内的一组颗粒，其在暴露于密度调节液体时将相似地响应。例如，此类颗粒组中的每个颗粒可具有特定的最小密度或具有落在密度范围内的密度，使得它们在暴露于密度调节培养基时将相似地响应。仅作为进一步说明，这组颗粒的密度可在1g/ml与1.1g/ml之间，而液体的密度可为1.3g/ml(即相对于水的比重为1.3g/ml)，因此颗粒群体将在液体体积/柱内向上上升。颗粒群体可包含一个或多个颗粒亚群。作为说明性实例，颗粒群体可以是细胞悬液，并且悬液中的单独细胞可以基于共同特征(例如密度、直径、生物标志物表达、细胞周期阶段等或上述的任何组合)分类为一个或多个组。在更具体的实例中，细胞悬液可以包括活细胞和垂死细胞(或死细胞)。
55.当在本公开中使用时，术语“比重”(或在一些情况下相对比重)是指本公开的液体
的密度相对于参考液体的密度的比率。举例来说，本公开的液体的比重不等于一意味着本公开的液体的密度不同于参考液体的密度。作为更具体的实例，当水(1.0g/ml)用作参考液体时，本公开的液体的比重1.3可等同于密度为1.3g/ml的液体。因此，基于本公开的液体的(相对)比重，可以预测颗粒群体或其一个或多个亚群是否会在液体体积/柱内的特定隔室中下沉、漂浮或定位。当液体是水或具有与水基本相同密度的液体时，术语比重可适用。当液体不是水并且具有与水的密度显著不同的密度时，术语相对比重可更适用。在颗粒群体或其一个或多个亚群既不漂浮在表面上或表面附近也不下沉到液体体积/液柱的底部或靠近底部的情况下，它们可以呈中性浮力(即颗粒群体或其一个或多个亚群的密度等于或充分类似于液体的密度)。在一些情况下，如果颗粒群体(或一个或多个亚群)的平均密度在液体密度的+/-3％、+/-2％、+/-1％或更小的范围内，则可能实现中性浮力。换句话说，呈中性浮力的一个或多个颗粒群或其亚群可以被描述为(均质地)分布在液体体积/柱内或分布在整个液体体积/柱中。前述短语在本公开中可以互换，除非使用短语的上下文不合理地允许这样的解释。
56.在本公开中使用时，术语“比重调整剂”是指是指存在于本公开的液体中或者可以添加到本公开的液体中并且将具有调整液体的(相对)比重的效果的任何物质。在本公开的某些实施方案中，利用不会显著增加液体的粘度和/或渗透压和/或重量克分子渗透压浓度的比重调整剂可能是期望的或有利的。在颗粒是细胞或一些其他生物材料的情况下，前述性质可能特别重要。比重调整剂的实例可以包括，无论是液体还是固体形式，碘化化合物(例如碘克沙醇、碘帕醇、碘海醇等)、全氟化合物、全氟萘烷、盐(例如nacl、钨盐等)，或密度梯度培养基，例如可以以商标名lymphoprep
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等销售的密度梯度培养基。如果颗粒群体是细胞，那么重要的是选择对它们的健康、良好状态或质量无害，同时优选在使用比重调整剂调节液体密度后也不显著改变液体的渗透压和/或重量克分子渗透压浓度和/或粘度的密度梯度培养基。
57.液体的(相对)比重可以正向或负向地调整为远离或趋向于一(即，一是液体密度与参考液体(例如水)的密度之比等于1或基本等于1的值，这可能对平均密度与液体密度相同或基本相同的颗粒群体或一个或多个亚群具有中性浮力的影响)。例如，如果液体的(相对)比重为1.3g/ml，则可以通过添加适当体积的具有较低浓度的液体或添加其中不包括比重调整剂的液体来将(相对)比重调节为一。作为另一个说明性实例，如果液体的(相对)比重为1.1g/ml，则可以通过其中添加适量的比重调整剂(无论是粉末形式还是液体体积内)来调节(相对)比重进一步偏离一。
58.方法
59.在一方面，本公开的方法包括用于操纵密度调节液体(体积或柱)中颗粒、颗粒群体或一个或多个颗粒亚群浮力以便操纵它们在液体体积/柱内的定位的那些步骤。前述方法的具体实例或应用可包括但不限于：(i)将颗粒群体(或亚群)分布在整个液体体积/柱中，例如在中性浮力下；(ii)使颗粒群体(或亚群)在液体体积/柱内的向上偏移(例如到达或靠近气体-或空气-液体界面)；(iii)沉降的颗粒群体(或亚群)在液体体积/柱内向上偏移；(iv)颗粒群体(或亚群)在液体体积/柱内向下偏移，或(v)颗粒群体的亚群在液体体积/柱内分离(例如沉淀、漂浮和分布的任何组合)。在一些实施方案中，不同的颗粒群体可以位于液体体积/柱内的不同隔室/部分。例如，颗粒(亚)群体可在液体体积/柱中向上偏移(例
如到气体-或空气-液体界面)，而不同的颗粒(亚)群体可在液体体积/柱中向下偏移，而另一个(亚)群体或颗粒可以任选地是中性浮力或分布在整个液体体积/柱中。
60.在一个实施方案中，操纵颗粒群体或一个或多个亚群的方法发生在液体体积/柱中。液体体积将必然包含在某种类型的容纳装置中，因此容纳装置内液体的三维空间可称为“柱”。在一些实施方案中，容器装置可以是具有至少一个可打开端的容器。在一些实施方案中，容器装置可以是具有一个封闭端和一个可封闭端的容器，例如烧瓶、量筒或离心管。在一些实施方案中，容器装置可以是具有至少两个可打开和可封闭端的容器，例如导管或一段管道。
61.方法的步骤将包括使颗粒群体或一个或多个亚群与液体接触，并且与比重为约一的液体相比，实现液体体积/柱内颗粒群体或一个或多个亚群的浮力变化或影响液体体积/柱内颗粒群体或一个或多个亚群。浮力变化或影响可以与在具有等于或基本等于一的比重的液体中执行的相同操作相比较来测量。
62.液体可以是支持颗粒群体的任何液体。在颗粒是细胞的实施方案中，液体可以是支持细胞的任何液体，例如生理盐水溶液或适当的一个或多个细胞类型的培养基。液体的一个重要特性是其(相对)比重，或其比重范围。因此，液体将包含稀释剂和比重调整剂。在一个实施方案中，比重调整剂的浓度可以根据颗粒群体或一个或多个亚群的性质而变化。在一个实施方案中，比重调整剂的浓度可以根据方法的阶段而变化，如本文进一步描述的。
63.在方法的一些或所有阶段，液体将包括比重调整剂。因此，在一些实施方案中，液体可具有不等于一的(相对)比重。在一个实施方案中，液体可具有高于一的(相对)比重。换句话说，液体的密度将高于参考液体(例如水)的密度。在一个实施方案中，液体可具有低于一的(相对)比重。在一些实施方案中，液体的比重在约0.5g/ml与5g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约0.9g/ml与4g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1g/ml与2g/ml之间。
64.在一些实施方案中，液体的比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1.002g/ml与1.45g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1.004g/ml与1.4g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1.008g/ml与1.3g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1.01g/ml与1.2g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重在约1.0g/ml与1.1g/ml之间。在一些实施方案中，液体的比重为约1.05g/ml
±
0.03g/ml。在一些实施方案中，具有在任何前述范围内的比重的液体可用于本文所述的方法或工艺的一个步骤中，而具有在任何前述范围内的不同比重的液体可用于本文描述的方法或工艺的不同步骤中。
65.在一些实施方案中，比重调整剂可以是比重调整可溶性固体或比重调整可混溶溶液。当比重调整剂是可溶性固体时，它可以是非离子碘化化合物。在具体实施方案中，比重调整可溶性固体是碘克沙醇。在比重调整剂是比重调整可混溶溶液的情况下，这种溶液可以与稀释剂(例如水或一些其他水溶液)混溶。在一些实施方案中，比重调整混溶溶液是包括非离子碘化化合物的溶液。在具体实施方案中，非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。
66.在一些实施方案中，液体可具有第一比重，其随后可调节至不同的比重，例如通过改变液体中比重调整剂的浓度。在一个实施方案中，方法可以包括在使颗粒群体与液体接触之前通过改变液体中比重调整剂的浓度来调节液体的比重。在一个实施方案中，方法可
以包括在使颗粒群体与液体接触之后通过改变液体中比重调整剂的浓度来调节液体的比重。对液体(例如本文公开的方法中使用的那些液体)的(相对)比重的调节可如本文所述实现(例如稀释液体或向液体添加更多比重调整剂)。
67.在一些实施方案中，液体可以是水性的。在一个实施方案中，稀释剂可以是水或水基的。在具体应用中，液体可以是缓冲液，也可以是细胞培养基。当液体是缓冲液或细胞培养基时，液体可包括以下的一种或多种：一种或多种缓冲剂、一种或多种无机盐、一种或多种微量元素、一种或多种脂质、白蛋白、一种或多种生长因子、一种或多种细胞因子或一种或多种小分子(例如rho激酶抑制剂，如y-27632)。
68.在一些实施方案中，液体是均质的(即液体处于一个相中)。均质液体可促进操纵液体体积/柱中多个颗粒的定位和/或浮力，例如当在过程期间调节液体的比重时。在大多数实施方案中，液体至少相对于稀释剂和包含在其中的比重调整剂是均质的。
69.液体的另一个重要特性可以是其粘度或其粘度范围。在一些实施方案中，液体的粘度可在水粘度的约1％、2％、5％、10％或20％以内。在一个实施方案中，液体的粘度在37℃下为约0.69cp。在一个实施方案中，液体的比重可以在液体粘度变化小于约20％的情况下进行调节。在一个实施方案中，液体的比重可以在液体粘度变化小于约10％的情况下进行调节。在一个实施方案中，液体的比重可以在液体粘度变化小于约5％的情况下进行调节。
70.在一些实施方案中，液体的另一个重要特性可以是其重量克分子渗透压浓度或重量克分子渗透压浓度或其范围。在一个实施方案中，液体的比重可以在液体重量克分子渗透压浓度变化小于约1％、2％、5％、10％或20％的情况下进行调节。
71.在一些实施方案中，方法可以包括向液体施加能量输入。能量输入可以使颗粒群体或其一个或多个亚群分布在液体体积/柱内。因此，任何类型的能量输入都涵盖在本公开中，包括可以直接施加到液体或间接施加到液体的能量输入。在一个实施方案中，能量输入可以直接施加到液体，例如通过叶轮等，或加压(惰性)气体的输入。在一个实施方案中，能量输入可以间接地施加到液体，例如通过轨道振荡器等。
72.在一个具体实施方案中，能量输入可以是湍流混合力。在一些实施方案中，能量输入(例如湍流混合力)通过叶轮或混合摆来调节。在任何此类实施方案中，湍流混合力的每分钟转数(“rpm”)可能是要优化的重要变量。例如，如果意图是使颗粒群体(或一个或多个亚群)均质或基本均质地分布在液体体积/柱内，那么太高的rpm可能会不期望地将颗粒集中在液体体积/柱的周边和/或通过湍流混合力对颗粒群体产生负面影响。或者，如果意图是使颗粒群体均质地或基本均质地分布在液体体积/柱内，那么太低的rpm可能不期望地将颗粒集中在液体体积/柱的上部或下部，这取决于液体的比重。
73.在一个实施方案中，能量输入，无论是直接的还是间接的，都可以导致颗粒群体或其一个或多个亚群在液体体积/柱内均质分布或基本均质分布。
74.在一个实施方案中，液体的增加的(相对)比重可对应于在液体体积/柱内(均匀地)分布颗粒群(或一个或多个亚群)所需的减少的能量输入。例如，在液体的(相对)比重高于一，例如约2、约3％、约4％、5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％或更多的情况下，相对较低的转速，例如约10rpm、约15rpm、约20rpm、约25rpm、约30rpm、约35rpm、约40rpm或更多，可能足以使颗粒(例如具有约1.0g/ml的密度的颗粒)群体在液体体
积/柱内(均质地)分布。相比之下，液体的减少的(相对)比重可对应于(均质地)在液体体积/柱内分布颗粒群体(或一个或多个亚群)的能量输入增加。例如，在液体的比重略高于一，例如约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％，约0.6％、约0.5％或更低的情况下，可能需要相对较高的转速，例如约35rpm、约40rpm、约45rpm、约50rpm或更高，以使颗粒群体(例如具有约1.0g/ml的密度的颗粒)液体体积/柱中(均质地)分布。以此方式，可以看出能量输入水平(以分布颗粒的群体或一个或多个亚群)与液体的(相对)比重成反比。
75.在液体体积/柱中的颗粒群体或其子集意图被测定、处理、取样和/或从中去除的实施方案中，可能需要停用能量输入。然而，如果在停用能量输入后颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内迅速平衡到非均质或偏移分布，则这可能适得其反。在这种情况下，可能期望在停用能量输入之后维持颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内的分布(例如均质或基本均质)，例如如果颗粒颗粒群体或其一个或多个亚群在液体中呈中性浮力。因此，可以针对所讨论的应用仔细优化液体的(相对)比重，以便在期望的持续时间实现在液体体积/柱内颗粒群体或一个或多个亚群的期望分布。在一个实施方案中，颗粒群体或其一个或多个亚群在脂质柱内呈中性浮力。在一个实施方案中，此类中性浮力颗粒可能需要例如通过向其施加能量输入而最初分布在液体体积/柱内，但是在停用能量输入时将维持在整个液体中的分布。
76.例如，方法的实施方案可以包括在停用能量输入之后从液体体积/柱中去除(或取样或抽取)第一等分试样的颗粒，同时颗粒群体或一个或多个亚群均质分布或基本上均质地分布在整个液体中。在可能期望从相同体积的液体中去除连续等分试样的颗粒的情况下，应该(或多或少)在体积/柱内维持颗粒群体或一个或多个亚群的均质分布(或基本均质分布)，只要有必要去除这种连续的等分试样。因此，方法可包括从液体体积/柱中去除第二等分试样的颗粒，其中第二(第三等)等分试样中的颗粒浓度与第一个和/或紧接在前的等分试样中的颗粒浓度大致相同或在第一个和/或紧接在前的等分试样中的颗粒浓度的约75％、80％、85％、90％、95％或更高内。这种取样操作可以手动或自动执行。
77.可能并不总是期望颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内的(基本上)均质分布的情况。相反，在一些应用中，可能期望颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内的偏移或非随机分布。获得颗粒的群体或一个或多个亚群的偏移或非随机分布可以在能量输入停用之后实现，或者可以在完全没有能量输入的情况下实现。
78.在一个实施方案中，可能期望颗粒的群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内向上或向下偏移，这可以在已经采取工艺步骤之前、期间或之后发生。
79.当液体的密度高于颗粒群体或一个或多个亚群的颗粒的平均密度(例如在相对比重高于一比重的液体中)时，实现颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内向上偏移。举例来说，颗粒群体或一个或多个亚群从液体体积/柱的下部隔室向上偏移可促进随后分离一个或多个此类群体。颗粒群体或一个或多个亚群从液体体积/柱的下部或隔室向上偏移可促进从第二颗粒群体或一个或多个亚群中分离第一群体或亚群。例如，当第二群体或亚群的颗粒比第一群体或颗粒亚群的颗粒具有更高的密度时，那么第一和第二(亚)群体可以定位到液体体积/柱内的不同位置，取决于液体的比重。以这种方式，还可以可能从第一和第二群体和亚群中分离更多的颗粒群体或一个或多个亚群(例如第三、第四或更多)。在
一个实施方案中，第一(亚)群体可位于或靠近液体体积/柱的气体-或空气-液体界面，第二(亚)群体可位于或靠近液体体积/柱的底部(即沉降物)，并且第三(亚)群体可以在液体体积/柱内的第一和第二(亚)群体之间。在前述实施方案中，液体的密度将需要高于第一(亚)群体的平均密度，低于第二(亚)群体的平均密度，并且与第三(亚)群体的密度平均密度相同或大约相同。
80.在一个实施方案中，颗粒群体或一个或多个亚群的每个颗粒的密度低于液体的比重，并且颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内向上偏移，例如到达或靠近液体体积/柱的气-液界面。颗粒群体或一个或多个亚群位于或靠近液体体积/柱的气-液界面偏移可以允许增加位于或靠近气-液界面的颗粒的局部溶解气体浓度。
81.在一个实施方案中，无论是在将颗粒群体或一个或多个亚群暴露于液体之前或之后(例如在停用能量输入，或颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度高于液体的比重的情况下)，颗粒群体或一个或多个亚群体最初可以沉降在液体体积/柱内。在用更高浓度的比重调整剂调节液体比重(例如，增加液体的(相对)比重)时，这种沉降的颗粒群或一个或多个亚群可以在液体体积/柱内向上偏移。液体的比重可通过将另外的比重调整剂溶解在液体中或通过将比重调整剂的浓缩原液加入液体中来调节。在一些实施方案中，原液的液体可以是与已经与颗粒群体或一个或多个亚群接触的相同类型的液体。在一些实施方案中，上述情况可能不太重要，并且液体可能不同。在一个实施方案中，第一种液体(例如已经与颗粒接触的液体)和第二种液体(例如添加到第一种液体中以增加或减少其(相对)比重的原液)的性质可能很重要的是，颗粒是或包含细胞群或一个或多个亚群或其他生物材料。在这种情况下，可能期望第一和第二液体在所有或大部分方面相同，除了比重调整剂的浓度。
82.当液体的密度低于颗粒群体或一个或多个亚群的颗粒的平均密度时，可以实现颗粒群体或一个或多个亚群在液体体积/柱内向下偏移。举例来说，颗粒群体或一个或多个亚群朝向液体体积/柱的下部向下偏移可随后促进此群或一个或多个亚群的分离。作为另一个实例，颗粒群体或一个或多个亚群朝向液体体积/柱的下部向下偏移可促进从第二颗粒群体或一个或多个亚群中分离此颗粒群体或其一个或多个亚群，例如第二颗粒群体或其一个或多个亚群的颗粒具有比第一颗粒群体或其一个或多个亚群的颗粒低的平均密度。如上所述，这种操纵还可以在液体体积/柱内相对于彼此分离第三、第四等颗粒群体或一个或多个亚群。
83.在一个实施方案中，群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度高于液体的密度，并且这种颗粒(亚)群体沉降在液体中。
84.当期望将颗粒群体或一个或多个亚群与也存在于液体中的其他颗粒分离时，使颗粒群体或其一个或多个亚群在液体体积/柱内的定位偏移可能是特别有利的。将颗粒群体或一个或多个亚群与液体中也存在的其他颗粒分离可以基于颗粒群体或一个或多个亚群中的颗粒与其他颗粒群体或一个或多个亚群以及液体相比的密度差异来进行。
85.在上述方法的具体应用中，颗粒群体或一个或多个亚群可以是细胞群或一个或多个亚群。在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群由单一类型的细胞组成。在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群包含各种类型的细胞。在一些实施方案中，群体或一个或多个亚群可包含活的和垂死的和/或死的细胞。活的和垂死的和/或死的细胞可以以不同的
密度为特征，并且本文公开的方法和液体可用于从垂死的和/或死的细胞中分离活细胞。此类分离制备物随后可用于从液体共同体积/柱的连续取样/抽取操作中，由此分布在整个液体中的颗粒可重复地(在细胞活力和/或接种密度方面)等分到多个子孔中。
86.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是单个细胞、若干细胞的团块，或者可以是细胞聚集体。可以使用已知的消化酶例如胰蛋白酶等来消化细胞的单层培养物，或通过细胞悬浮培养物的研磨来获得单细胞的悬液。可以分别通过不完全消化或研磨细胞单层培养物或细胞悬浮培养物来获得若干细胞团块。在一些实施方案中，细胞群可以作为单个细胞接种。在一些实施方案中，作为单个细胞或细胞团块接种的细胞群可在液体中增殖以形成聚集体。
87.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是原代组织来源的细胞或组织碎片。
88.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是干细胞或祖细胞。干细胞或祖细胞的非限制性实例包括多能干细胞(无论是初始的、胚胎的还是诱导的)、间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞。此外，间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞可以是多能干细胞来源的。
89.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞。此类中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞可以从获自受试者例如患者或供体的适当前体细胞分化。或者，此类中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞可以从适当干细胞或祖细胞分化。
90.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是细胞系。
91.在颗粒群体或一个或多个亚群任选地是细胞群的实施方案中，液体可以是缓冲液或细胞培养基。在一个实施方案中，液体(包括缓冲液或细胞培养基)的比重可以等于、大约等于(例如小于一的+/-0.5％)或不等于一(例如大于一的+/-0.5％)。在一个实施方案中，液体的比重高于一。在一个实施方案中，液体的比重低于一。上述液体比重的描述涉及两种情况，其中颗粒群体或一个或多个亚群本质上是生物的(例如细胞)，或者其中群体或一个或多个亚群本质上不是生物的。
92.细胞培养基可以是支持细胞的任何培养基，例如支持细胞群生长和/或增殖的培养基。因此，在此类实施方案中，方法还可包括在液体内培养和/或扩增细胞群或一个或多个亚群。在其他实施方案中，方法还可包括在液体体积/柱的特定隔室或部分中扩增细胞群或一个或多个亚群(例如，沉降在其中，分布在体积/柱内/整个体积/柱中，或在气体-或空气-液体界面处)。在任何这样的实施方案中，可能期望细胞群或一个或多个亚群的生长或健康在液体中没受不利影响。更具体地，可能期望细胞群或一个或多个亚群的生长或健康没受比重调整剂的不利影响。
93.对细胞群或一个或多个亚群(或其他生物材料)的健康或良好状态的潜在有害影响可以在形态学和/或功能方面表征。在颗粒群体或一个或多个亚群是细胞的特定情况下，它们的健康和良好状态可以根据形态学和/或功能和/或以下一项或多项来衡量：群体倍增或细胞数量随时间的变化；活力或活力％；生物标志物的表达或不表达；分化成下游细胞类型的能力/能力；代谢率；或存在/不存在突变，例如中等规模或大规模的染色体异常，或一
个或多个(亚)群体中细胞中此类异常的不成比例累积(超过多次(即5-10次)传代)。对于特定细胞类型，例如psc，各种已知/反复出现的染色体异常可用作群体健康状况的指标。此外，psc应该能够分化成三个胚层中的任一个或全部，甚至更多。此外，未暴露于分化条件的psc应表达某些多能性标志物，例如tra-1-60、oct4等。
94.在一些实施方案中，可能期望使细胞群或一个或多个亚群在液体体积/柱内向上偏移，例如到达或靠近其气体-或空气-液体界面。这可以通过将细胞群或一个或多个亚群暴露于(相对)比重比细胞群或一个或多个细胞亚群的平均密度高的液体来实现。
95.在不同或相关的实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以从粘附到容器的封闭底端的细胞培养物中出芽或脱离。因此，如本文所述，使用适当配制的液体(例如培养基)，此类出芽或脱离的细胞群可在液体体积/柱内选择性地向上偏移或偏移到其气-液界面。
96.在颗粒群体或一个或多个亚群是细胞群或一个或多个亚群的实施方案中，能量输入(例如，湍流混合力)可施加到液体。向液体施加能量输入可以使细胞群或一个或多个亚群(均质地或基本均质地)分布在液体体积/柱内或整个液体体积/柱。根据细胞群或一个或多个亚群的性质，优化能量输入水平以不对细胞群或一个或多个细胞亚群产生不利影响可能是很重要的。事实上，某些细胞类型对剪切效应特别敏感，例如多能干细胞。因此，如果能量输入是湍流混合力，那么太高的rpm可能导致剪切效应对细胞群(健康或良好状态)产生负面影响，包括抗剪切克隆选择、增殖失败、分化或甚至死亡。或者，相反，太低的湍流混合输入可能导致细胞沉降和/或形成大规模聚集体、营养物分布不当或营养物不足，特别是由于氧气的低溶解度及其对空气-液体界面更新和/或气泡分布的质量传递依赖。在一个实施方案中，rpm可以被设置在约5-100rpm之间，或约10-50rpm之间，或约20与45rpm之间。
97.液体
98.在另一方面，本公开的液体包括能够操纵暴露于此类液体的颗粒群体的浮力的那些组合物。在本公开的方法的上下文中关于一种或多种液体的任何上述描述适用于可以商业化和/或与上述特定方法分离使用的一种或多种液体的前述描述。在使用或商业化此类液体的情况下，它们可以以试剂盒的形式销售，所述试剂盒包含至少一种基础液体(或多于一种基础液体)，例如一种或多种培养基，以及包含比重调整剂的补充剂。在一个实施方案中，提供的前述基础液体具有等于或基本上等于一的(相对)比重。在一个实施方案中，基础液体(例如培养基)被预先配制以包括指定浓度的比重调整剂，并且液体的(相对)比重不等于一。在一个实施方案中，这种预先配制的基础液体可以配备有另外的比重调整剂(无论是干燥/粉末/固体形式还是包含在原液中)，并且用户可以优化或调节其中比重调整剂的浓度，如执行上文描述的操作所期望的那样。在一些实施方案中，任何前述基础液体和比重调节补充剂可进一步配备有其他补充剂，所述其他补充剂包含一种或多种生长因子、细胞因子、蛋白质、肽、小分子或对培养细胞有用的其他物质。
99.如上所述，液体可以是支持颗粒群体或一个或多个亚群的任何液体。液体的一个重要特性是其(相对)比重，或其范围。因此，液体将包含稀释剂和比重调整剂。
100.比重调整剂的浓度可以根据颗粒群体或一个或多个亚群的性质和/或使用液体的特定应用而变化。因此，在一些实施方案中，液体可具有不等于一的(相对)比重，但仍然具有能够使颗粒群体或一个或多个亚群(例如细胞，其中大多数细胞具有1.03g/ml+/-0.01g/ml的密度)中性浮力的比重。在一些实施方案中，液体可具有不等于一的(相对)比重，但仍
然具有使颗粒(例如细胞)群体或一个或多个亚群能够随着液体体积/柱向上或向下偏移的比重。
101.在一个实施方案中，液体可具有高于一的(相对)比重。换句话说，液体的密度将高于参考物质(例如水)的密度。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约1.004g/ml与1.4g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约1.006g/ml与1.2g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约1.008g/ml与1.1g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重是约1.05g/ml
±
0.03g/ml。
102.在其他实施方案中，液体的(相对)比重可低于一。换句话说，液体的密度将小于参考物质(例如水)的密度。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.5g/ml与1.0g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.5g/ml与0.6g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.6g/ml与0.7g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.7g/ml与0.8g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.8g/ml与0.9g/ml之间。在一些实施方案中，液体的(相对)比重在约0.9g/ml与1.0g/ml之间。
103.在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度高于液体的比重。在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度低于液体的比重。在一个实施方案中，液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度与液体的比重相同或在液体的比重的+/-3％内。
104.在一些实施方案中，比重调整剂可以是比重调整可溶性固体或比重调整可混溶溶液。当比重调整剂是可溶性固体时，它可以是非离子碘化化合物。在具体实施方案中，比重调整可溶性固体是碘克沙醇。在比重调整剂是比重调整可混溶溶液的情况下，这种溶液可以与稀释剂(例如水或一些其他水溶液)混溶。在一些实施方案中，比重调整混溶溶液是包括非离子碘化化合物的溶液。在具体实施方案中，非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。
105.在一些实施方案中，液体可具有第一比重，其随后可调节至不同的比重，例如通过改变比重调整剂的浓度。在一个实施方案中，液体可以具有第一比重，其可通过改变液体中比重调整剂的浓度在使颗粒群体与液体接触之前调节到不同的比重。在一个实施方案中，液体可以具有第一比重，其可通过改变液体中比重调整剂的浓度在使颗粒群体与液体接触之后调节到不同的比重。液体中比重调整剂的浓度可以如本公开的别处所述进行调节。
106.在一些实施方案中，液体可以是水性的。在一个实施方案中，稀释剂可以是水。
107.在一些实施方案中，液体是均质的(即液体处于一个相中)。均质液体可以帮助解决多个颗粒的浮力变化，例如在过程期间调节液体的比重时。无论如何，液体相对于稀释剂和比重调整剂应该是均质的。
108.液体的另一个重要特性可以是其粘度或其范围。在一些实施方案中，液体的粘度可在水粘度的约1％、2％、5％、10％或20％以内。在一个实施方案中，液体的粘度在37℃下为约0.69cp。在一些情况下，可以调节液体的比重，使液体的粘度变化小于约20％、15％、10％、5％、2％或1％。
109.在一些实施方案中，液体的另一个重要特性可以是其重量克分子渗透压浓度或重量克分子渗透压浓度或其范围。在一些情况下，可以调节液体的比重，使液体的重量克分子渗透压浓度变化小于约20％、10％、5％或2％。
110.在具体实施方案中，颗粒群体或一个或多个亚群是细胞群或一个或多个亚群。在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是原代组织来源的细胞或组织碎片。
111.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是干细胞或祖细胞。干细胞或祖细胞的非限制性实例包括多能干细胞(无论是初始的、胚胎的还是诱导的)、间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞。此外，间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞可以是多能干细胞来源的。
112.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞。此类中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞可以从获自受试者例如患者或供体的适当前体细胞分化。或此类中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞可以从获自受试者例如患者或供体的适当祖细胞分化。
113.在一些实施方案中，细胞群或一个或多个亚群可以是细胞系。
114.因此，液体应支持细胞群或一个或多个亚群。支持细胞群或一个或多个亚群的液体不应对细胞群产生有害影响。可以如上所述或以本领域技术人员已知的任何其他方式测量对细胞的有害影响(例如健康和/或良好状态)。此外，支持细胞群或一个或多个亚群的液体应该将细胞维持在稳态或可以支持它们的维持和/或生长和/或增殖和/或分化。在液体使细胞维持稳态的情况下，就其组成而言，它可能不适合长期暴露于细胞群或一个或多个亚群。然而，支持细胞群或一个或多个亚群的液体就其组成而言(例如温度、ph、盐浓度等)应该是生理性的。作为非限制性实例，此类应用的液体可以是缓冲液或可以是细胞培养基。当液体是缓冲液或细胞培养基时，液体可包括以下的一种或多种：一种或多种缓冲剂、一种或多种无机盐、一种或多种微量元素、一种或多种脂质、白蛋白、一种或多种生长因子、一种或多种细胞因子或一种或多种小分子(例如rho激酶抑制剂)。
115.在颗粒群体或一个或多个亚群是细胞群的应用中，液体的比重调整剂不应隔离在细胞群或一个或多个亚群内。
116.以下非限制性实施例说明本公开。
117.实施例
118.实施例1：单层或悬浮悬液中psc的维持培养
119.根据制造商建议的方案，将多能干细胞维持在mtesr
tm
1、mtesr
tm
3d或tesr
tm-e8
tm
3d中。
120.对于维持在单层中的细胞，培养物在matrigel
tm
(corning)或vitronectin(stemcell technologies)上生长，并在达到约50-80％汇合时传代。为了传代细胞，吸出培养基，并用pbs洗涤细胞。使用温和细胞解离试剂(gentle cell dissociation reagent)(stemcell technologies)、accutase
tm
(stemcell technologies)或relesr(stemcell technologies)对集落进行酶促消化。在relesr的情况下，未分化的psc集落可以优先从培养表面脱离。将脱离的psc集落研磨以将其破碎成团块或单个细胞。
121.对于维持在悬液中的细胞，根据制造商推荐的方案，使培养物在tesr
tm e8
tm 3d或mtesr
tm 3d(均为stemcell technologies)中生长。细胞作为未分化细胞的聚集体在悬液中生长(即维持在悬液中)并在达到所期望的密度(例如8x 105个细胞/ml)时传代，通常在如本文所述培养3-4天后可获得。通过离心收集在悬液中生长的聚集体，并使用pbs洗涤。使用
温和细胞解离试剂(stemcell technologies)或accutase
tm
(stemcell technologies)结合研磨将聚集体解离以使它们破碎成团块或单个细胞。
122.实施例2：psc分布与悬浮psc的最小rpm的关系
123.如实施例1所述维持stips-m001 psc。在传代时，将细胞团块接种到单摆旋转瓶(integra biosciences)中的50ml tesr-e8-3d(stemcell technologies)中。培养基中补充有10μm rock抑制剂(st emcell technologies)。将细胞在40-45rpm下培养3天，直到它们大到无需显微镜即可看到，并根据制造商建议的方案每天使用tesr-e8 3d饲料补充剂(stemcell technologies)补料。
124.一旦psc聚集体达到指定的尺寸，就将它们接种到各种密度调节培养基(根据下表制备)中以评估在测试的培养基中大致均质分布细胞所需的rpm下限(也如下表所示)。
[0125][0126][0127]
图1显示了培养基密度与在培养基中悬浮psc聚集体所需的rpm之间的关系。随着培养基密度的增加，将psc聚集体分布在整个液体培养基中所需的rpm降低。图2显示了在20rpm混合速度的影响下悬浮在具有对照密度(1.0g/ml)的培养基(图2a，并在图2c中放大)或密度调节培养基(1.048g/ml)(图2b，并在图2d中放大)中的psc聚集体的代表性图像。在对照培养物中，聚集体沉降在旋转瓶底部的凹痕周围，而在密度调节培养物中，聚集体分布良好(图2c和2d)。
[0128]
实施例3：在密度调节培养基中psc悬浮培养物的放大
[0129]
如实施例1所述培养和收获stips-f016多能干细胞，并将1x 105个细胞/ml接种到100ml单摆旋转瓶(integra biosciences)、250ml双摆旋转瓶(integra biosciences)和500ml双摆旋转瓶(integra biosciences)中。在对照条件下的培养中，将上述容器中的每一个用实施例2中描述的完全培养基(例如非密度调节培养基)填充至其体积的一半，并且也如所述实施例中所述补料培养物。平行地，每种尺寸的容器分别用培养基填充至其体积的一半，所述培养基的密度被调节(如实施例2中所述)至1.024g/ml、1.032g/ml和1.04g/ml。培养物每3-4天传代一次，并以20rpm(对于100ml烧瓶)或25rpm(对于250ml和500ml烧瓶)进行3次传代。
[0130]
每天拍摄显微镜图像，100ml烧瓶的代表性图像如图3a-d所示。由于对照培养物的混合速度是推荐速度的一半，因此在烧瓶底部形成了psc的单一聚集体，正如预期的那样(图3a)。相比之下，随着培养基密度的增加，可以在培养基中观察到多个不同的聚集体(图3b-d)。通常，随着培养基密度的增加，聚集体的尺寸减小。
[0131]
评估了在密度调节培养基(例如》1g/ml)或标准培养基(例如1g/ml)中悬浮生长的psc系的每日倍数扩增(图4)。图4中的图表示从在标准培养基(n＝57)或密度调节培养基(n＝37)中悬浮生长stips-f016、stips-m001、wls-1c、h9和h1 psc系的实验中获得的所有数据点的合并。数据显示，与标准培养基(平均值＝1.027)相比，密度调节培养基中的悬浮培
养实现了更高的每日倍数扩增(平均值＝1.347)。
[0132]
实施例4：psc在密度调节培养基的长期暴露
[0133]
将来自实施例2的细胞传代(如实施例1中所述)并以1
×
105个细胞/ml接种在100ml单摆旋转瓶(integra)中。使用与实施例2中所述相同的培养基培养和饲喂细胞，不同之处在于密度被调节至1.032g/ml(45ml完全培养基中的5ml碘克沙醇)。
[0134]
培养4天后，根据建议的方案使用accutase
tm
(stemcell technologies)收集和解离聚集体。对解离的细胞进行每日倍数扩增(图5a)、活力百分比(图5b)和流式细胞术多能性标志物表达的分析(图5c和5d)。在密度为1.032g/ml的培养基中生长的psc显示出每日倍数扩增超过1.25(图5a)，并且约90％的细胞是活的(图5b)。
[0135]
为了评估在密度调节培养基中培养的psc的多能性，用pe抗人tra-1-60r抗体(biolegend)对细胞进行染色。通过流式细胞术(guava easycyte 12ht流式细胞仪(millipore))分析tra-1-60表达。证明了细胞的多能性，当大约89％的分析的细胞表达tra-1-60(图5d)时，与在mtesr1的2d对照条件下培养的f016 psc中相同标志物的表达水平(约88％)相当(图5c)。
[0136]
实施例5：使用密度调节培养基减少手动接种子孔中的接种密度可变性
[0137]
如实施例1所述，维持并解离f016 psc(ipsc)。将解离的多能干细胞团块以5.00x 105个细胞/ml重新悬浮在对照培养基(1.0g/ml)或密度调节培养基(1.04g/ml)中，从中抽取连续等分试样并接种到子孔中。
[0138]
在这个早期实验中，解离的psc被手动取样/等分并接种到子孔中的情况下，在密度调节培养基中以一分钟间隔从细胞悬液中提取的等分团块中没有观察到接种密度的显著降低。相比之下，从对照培养基(即“标准”密度培养基)中的细胞悬液中取样的团块显示出接种密度的降低，具体取决于连续取样/等分操作之间经过的时间量(图6a)。因此，使用密度调节培养基制备psc悬液用于随后子孔的接种，避免了在连续取样和接种多个等分试样的操作之间彻底混合细胞悬液的耗时步骤。有趣的是，还观察到，与使用悬浮在对照培养基(即“标准”密度培养基)中的细胞进行相同操作相比，从密度调节培养基中的悬液中连续取样/提取并接种到子孔中的那些细胞表现出更高的活力(图6b)。不受理论的束缚，活细胞和死细胞之间可能存在密度差异，其中活细胞比死细胞在细胞悬液中沉降得更快。
[0139]
实施例6：使用密度调节培养基减少机器人接种子孔中的接种密度可变性
[0140]
使用microlab starlet液体处理机器人(hamilton)将实施例5中描述的和图6中报告的实验扩展到更大规模实验。简而言之，如实施例1所述，使用accutase
tm
将维持在单层中的psc解离为单个细胞或使用relesr解离为团块。此外，使用aggrewell
tm
l 400微孔装置(stemcell technologies)通过在每个微孔中沉积约500个h1细胞并在mtesr
tm 1中孵育细胞24小时将psc形成聚集体。
[0141]
在对照培养基(1.0g/ml)或密度调节培养基(1.04g/ml或1.06g/ml)中制备三种2x 106个细胞/ml的单细胞悬液。液体处理器从每个单细胞悬液中接种48个子孔。与对照培养基相比，密度调节培养基产生更一致的接种效率(图7a)。此外，类似于图6中报告的观察结果，从密度调节细胞悬液中接种到子孔中的细胞的活力百分比得到改善(图7b)。当psc团块(图8a)和psc聚合体(图8b)的等分试样取自密度调节培养基中的源悬液(团块或聚合体)时，与从对照培养基中的源悬液中获取的等分试样相比，也观察到子孔中更一致的接种密
度的相同趋向。
[0142]
实施例7：传代操作期间间断暴露于密度调节培养基对单层维持的psc的影响
[0143]
h9(es细胞)和m001(ips细胞)psc在mtesr1中的matrigel上以2d形式维持10代，基本上如实施例1中所述。在每代的第7天，使用relesr解离培养物，并对psc团块进行计数并重新悬浮在密度调节培养基(1.06g/ml)中。将细胞悬液以2x 104个活h9细胞/孔和1.5x 104个活moo1细胞/孔接种到最终密度为1.0g/ml、1.005g/ml或1.01g/ml的培养基中的单独孔中。在第2天(即在碘克沙醇暴露约48小时后)，更换培养基，并在传代的剩余时间(第2-6天)中所有条件用标准mtesr
tm
1培养基(1.00g/ml)补料。
[0144]
评估如上所述培养10代的细胞在每代中累积的活细胞。在传代当天，每个条件的3个技术复制中的每一个都暴露于relesr(stemcell技术)以释放未分化psc的集落，并且通过汇集条件的技术复制来制备所得的团块悬液。使用chemometec nucleocounter nc-250
tm
测定每个混合样品的活细胞计数(使用nc-slides a2
tn
和试剂a100和b获得的活力和细胞计数)。在jmp中使用均值分析以将每个实验条件的斜率与组平均值进行比较来完成统计。对于h9细胞，未观察到对照(1.00g/ml)和实验条件(1.005g/ml和1.01g/ml)之间累积活细胞产量的显著差异(图9a)。对于m001细胞，1.01g/ml条件与对照有显著差异，但由于斜率高于对照，这无关紧要(图9a)。
[0145]
在上述10代实验之后，评估在每种条件下获得的细胞的活力％(如上使用nc-250进行量化)。在10代测定后的任一细胞系中，未观察到对照(1.00g/ml)和实验条件(1.005g/ml和1.01g/ml)之间活力百分比的统计学差异(图9b)。数据用离群值箱线图表示，其中箱内的水平线代表中值。统计是在jmp中使用anova和事后tukey hsd检验(所有对)完成的。
[0146]
如上所述，将细胞培养10代后，在不同测试条件下评估多能性标志物的表达。细胞用pe抗人tra-1-60-r抗体(biolegend)或alexa488抗oct4抗体(biolegend)染色，并通过流式细胞术(guava viacyte 12ht，millipore)进行评估。在不同测试条件下未观察到oct-4和tra-1-60表达存在显著差异，这表明在传代操作期间间断暴露于密度调节培养基不会负面影响累积活细胞数、细胞活力百分比和psc的未分化表型(图9c)。
[0147]
如上所述，将细胞培养10代后，在不同测试条件下评估复发突变的累积和终点细胞的核型。为了评估已知在psc中出现的常见突变的累积，从在“标准”密度培养基条件和指定的密度调节培养基条件下培养的每个样品中分离基因组dna。对于在psc和对照基因座中观察到的8种常见核型异常，使用遗传分析试剂盒(stemcell technologies)对分离的dna进行分析。使用quantstudio 5实时pcr系统(applied biosystems)的qpcr实验结果如图9d所示。对于仅在标准密度培养基中生长和传代的样品或在密度调节培养基配制物中传代的样品，所评估的基因组区域的拷贝数似乎没有显著差异。样品也被送去通过g显带(wicell)进行核型分析，以确认使用遗传分析试剂盒(stemcell technologies)获得的结果。样品染色体分析报告如图9e所示，但此研究的总体结果证实，在多次传代中短暂暴露(约48小时)于密度调节培养基配制物下培养psc不影响细胞的遗传稳定性(即与在对照条件下培养的细胞相比，细胞对重排的累积并不更敏感)。
[0148]
如上所述培养细胞10代后，在不同测试条件下评估分化能力。收获并培养细胞以使用stemdiff三系分化试剂盒(stemcell technologies)诱导分化为三个胚胎胚层。在培养期结束时，细胞用针对内胚层谱系的人sox17 apc缀合的抗体(r&d systems)和人
cxcr4pe缀合的抗体(r&d systems)、用针对中胚层谱系的人/小鼠brachyury apc缀合的抗体(r&d systems)染色和alexa 488抗oct4抗体(biolegend)，或针对外胚层谱系的alexa fluor 647小鼠抗人pax-6(bd biosciences)和抗人nestin alexafluor 488(thermo fisher scientific)染色，并通过流式细胞(guava viacyte12ht,millipore)进行评估。在不同测试条件下，未观察到双染色标志物表达的显著差异，并且所有条件都具有与“标准”密度培养基中维持的细胞相当的分化效率(在80％以内)(图9f)。图显示了平均(n＝3)标志物表达，误差棒显示了标准差。
[0149]
总体而言，此实施例7中的结果表明，与仅暴露于“标准”密度培养基的细胞相比，细胞在传代过程中反复暴露于密度调节培养基配制物(特别是在等分和接种操作期间)似乎不会对累积活细胞数、细胞活力百分比、多能性标志物的表达、相对较大规模遗传畸变的累积以及psc分化为胚层的能力造成不利影响。因此，密度调节培养基可用于细胞处理(例如，以促进培养、传代、分离/分离/富集和取样)，而对细胞本身没有任何明显风险。
[0150]
实施例8：使用密度调节培养基从微孔装置的孔中收获psc聚集体
[0151]
如实施例1所述制备wls-1c psc的单细胞悬液。aggrewell 400(stemcell technologies)的每个孔都接种2ml的1.2x 105个细胞/ml悬液，使得孔的每个微孔接收约200psc。简而言之，aggrewell是按照制造商的建议制备的，并且将补充有10μm rocki(y-27632，stemcell technologies)的1ml完全mtesr
tm
1添加到其中的每个孔中。接下来，将补充有10μm rocki的完全mtesr
tm
1中的1ml的2.4x 105个细胞/ml的wls-1c ips细胞单细胞悬液添加到孔中，以在每个孔中获得1.2x 105个细胞/ml的最终浓度。在收获聚集体之前允许聚集体形成2天。通常，从微孔装置中收集聚集体涉及多轮移除和强力重新分配培养基以去除聚集体。
[0152]
在这里，在第3天，慢慢移除并丢弃用过的培养基。如下制备不同的收获培养基：对照培养基(1.0g/ml)，以及使用碘克沙醇调节至1.1g/ml、1.2g/ml或1.3g/ml的培养基。在将各种收获培养基分配到微孔装置的每个孔中后，确定每个孔的聚集体损失。使用对照收获培养基，几乎所有的聚集体都保留在微孔装置中(图10，“dmem对照”)。随着收获培养基密度的增加，可以逐渐回收更多的聚集体(图10)。1.3g/ml的收获培养基基本上回收了所有聚集体，类似于上述传统且耗时的方法(图10)。
[0153]
实施例9：在工艺中使用密度调节培养基
[0154]
在悬浮培养psc聚集体的自动化工艺中，可以通过使细胞悬液流过过滤器来促进回收、传代和/或洗涤步骤。当聚集体通过过滤器时，通过使用本公开的密度调节液体来维持聚集体的均质分布可以防止堵塞。
[0155]
将直径大约300-500μm的f016细胞聚集体悬浮在tesr
tm e8
tm 3d培养基(1g/ml)或tesr e8(1.08g/ml)中，并吸入10ml移液管中。在每个转移移液管的液体体积/柱内，允许聚集体沉降约20至30秒(图11a、b和c)。标准培养基(1.0g/ml)中的聚集体在液体体积/柱内迅速沉降(图11a)，但在整个密度调节培养基(1.08g/ml)的体积/柱中保持均质分布(图11b，和图11c的放大图)。
[0156]
每个移液管中的每个体积的培养基都通过37μm网状过滤器，并对每个过滤器上的残留物进行拍照(图11d)。只有聚集体悬浮在标准培养基(1.0g/ml)的条件才会由于堵塞导致聚集体在过滤器上大量聚集。评估每种条件下的滤液的回收的总活细胞(图12a)和回收
细胞的活力％(图12b)。如图12a和12b以及图12c中的汇总数据所示，当悬浮(基本均质地)在密度调节培养基(1.08g/ml)时，在基于过滤器传代psc聚集体后回收更多细胞，并且与标准培养基(1g/ml)中的沉降的聚集体群体相比，此类细胞中表现出更高的活力百分比。
[0157]
尽管已参考目前被视为优选的实例对本公开进行描述，但应理解，本公开不限于所公开的实例。与此相反，本公开意图涵盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效布置。
[0158]
所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文中，其并入程度就如同每个单独出版物、专利或专利申请特定地并且单独地经指示以引用的方式整体并入一般。

技术特征：
1.一种操纵液体体积内颗粒群体或其一个或多个亚群的定位的方法，所述方法包括：a)将所述颗粒群体或其一个或多个亚群暴露于所述液体，所述液体补充有比重调整剂并且具有不等于一的比重；和b)影响所述液体体积内的所述颗粒群体或其一个或多个亚群的浮力。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还可包括在所述颗粒群体或其一个或多个亚群与所述液体接触之前或之后通过改变所述比重调整剂在所述液体中的浓度来调节所述液体的比重。3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括向所述液体施加能量输入以将所述颗粒群体或一个或多个亚群分布在整个所述液体体积中。4.如权利要求3所述的方法，其中增加的所述液体比重对应于减少的在所述液体体积内分布所述颗粒群体或一个或多个亚群的能量输入。5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述能量输入是湍流混合力。6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，所述方法还包括停用所述能量输入。7.如权利要求6所述的方法，其中在停用所述能量输入之后维持在整个液体体积中所述颗粒群体或一个或多个亚群的分布。8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括从所述液体体积中去除第一等分试样的颗粒。9.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括从所述液体体积中去除第二等分试样的颗粒，其中所述第二等分试样中的颗粒浓度在所述第一等分试样中的颗粒浓度的约80％或更多内。10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度与所述液体比重相同或在所述液体比重的约+/-3％内，并且所述群体或一个或多个亚群在所述液体体积内呈中性浮力。11.如权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述颗粒群体或一个或多个亚群从所述液体体积的下部向上偏移或朝向所述液体体积的下部向下偏移。12.如权利要求11所述的方法，其中所述群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度低于所述液体的比重并且所述群体或一个或多个亚群向上偏移或偏移到所述液体体积的气液界面。13.如权利要求11或12所述的方法，其中在所述颗粒群体或一个或多个亚群与所述液体接触之前，所述颗粒群体或一个或多个亚群沉降在所述液体体积内，并且在开始与所述液体接触之后在所述液体体积内向上偏移。14.如权利要求11所述的方法，其中所述群体或其一个或多个亚群的颗粒的平均密度高于所述液体的比重，并且所述群体或一个或多个亚群沉降在所述液体体积内。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述液体的比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述液体的比重大于或小于一的+/-3％。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述比重调整剂为比重调整可溶性固体或可混溶溶液。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述比重调整可溶性固体是碘克沙醇。19.如权利要求17所述的方法，其中所述比重调整可混溶溶液是水可混溶的。20.如权利要求19所述的方法，其中所述比重调整可混溶溶液是非离子碘化溶液。21.如权利要求20所述的方法，其中所述非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述颗粒群体或一个或多个亚群是细胞群或一个或多个亚群。23.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞群或一个或多个亚群是单个细胞或细胞聚集体。24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述细胞群或一个或多个亚群是干细胞、原代组织来源的细胞或组织碎片，或细胞系。25.如权利要求24所述的方法，其中所述干细胞是多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞或祖细胞、神经干细胞或祖细胞，或成体上皮干细胞或祖细胞。26.如权利要求22或23所述的方法，其中所述细胞群或一个或多个亚群是中胚层、外胚层或内胚层谱系的分化细胞。27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述液体是细胞培养基。28.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括在所述液体体积内培养和/或扩增所述细胞群或一个或多个亚群。29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述细胞群或一个或多个亚群的生长和/或健康在所述液体中没受不利影响。30.一种用于操纵颗粒群体或其一个或多个亚群的定位的液体，所述液体包含稀释剂和比重调整剂，其中所述液体的比重不等于一。31.如权利要求30所述的液体，其中所述比重调整剂为比重调整可溶性固体或可混溶溶液。32.如权利要求31所述的液体，其中所述比重调整可溶性固体是碘克沙醇。33.如权利要求32所述的液体，其中所述比重调整可混溶溶液是水可混溶的。34.如权利要求33所述的液体，其中所述比重调整可混溶溶液是非离子碘化溶液。35.如权利要求34所述的液体，其中所述非离子碘化溶液包括溶解的碘克沙醇。36.如权利要求30至35中任一项所述的液体，其中所述颗粒群体或其一个或多个亚群是细胞群或一个或多个亚群。37.如权利要求30至36中任一项所述的液体，其中所述稀释剂是缓冲液或细胞培养基。38.如权利要求37所述的液体，其中所述细胞培养基是水性的。39.如权利要求37所述的液体，其中所述细胞培养基是均质的。40.如权利要求30至39中任一项所述的液体，其中所述液体的粘度在水的10％以内。41.如权利要求40所述的液体，其中所述粘度在37℃下为约0.69cp。42.如权利要求30至41中任一项所述的液体，其中所述液体的比重在约1.0g/ml与1.5g/ml之间。43.如权利要求37至42中任一项所述的液体，所述液体还包含缓冲液、无机盐、微量元素、脂质、白蛋白、生长因子和细胞因子中的一种或多种。44.如权利要求30至43中任一项所述的液体，其中所述比重调整剂不隔离在所述细胞
群或一个或多个亚群内。45.如权利要求30至44中任一项所述的液体，其中所述液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度高于所述液体的比重。46.如权利要求30至44中任一项所述的液体，其中所述液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度低于所述液体的比重。47.如权利要求30至44中任一项所述的液体，其中所述液体中的颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度与所述液体的比重相同或在所述液体的比重的+/-3％内。

技术总结
公开了用于操纵液体体积内颗粒群体或一个或多个亚群的定位和/或浮力的液体和方法。所述液体的比重可以根据应用和/或所述液体内颗粒群体或其一个或多个亚群的平均密度使用比重调整剂来调节。例如，密度调节液体可用于使颗粒群体或一个或多个颗粒亚群在所述液体体积内向上或向下偏移。作为另一实例，密度调节液体可用于维持中性浮力颗粒群体或一个或多个亚群在这种液体体积内的分布。多个亚群在这种液体体积内的分布。多个亚群在这种液体体积内的分布。


技术研发人员：E
受保护的技术使用者：加拿大干细胞技术公司
技术研发日：2021.11.25
技术公布日：2023/10/7